药用植物组织培养(12页).doc

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1、-药用植物组织培养-第 11 页药用植物组织培养 1.药用植物组织培养的定义及组培中所涉及的主要概念。 定义：是指在无菌条件下，将离体的药用植物器官、组织、细胞及原生质体，培养在人工培养上和人工控制的环境中，使其生长、分化、形成新的植株的过程和技术。（又称植物离体培养、植物克隆） 组培中所涉及的主要概念：培养基：指根据植物营养原理和植物组织离体培养的要求而人工配制的营养基质。 初代培养：也叫第一代培养，指将从植物体上分离下来的材料进行的一次培养。 继代培养：将初代培养的培养物转移到新的培养基上继续培养。 固体培养基：指把加入琼脂或结冷胶使培养基呈固体状态的培养。 外植体：由植物体上切取下来用于

2、组织培养的离体材料。（泛指第一次接种所用的植物组织、器官等一切离体材料。） 愈伤组织：指外植体因受伤或离体培养时，其未分化的细胞和已分化的细胞进行活跃的分裂，形成的一种无特定结构和功能的薄壁细胞。 2. 植物组织培养的理论基础是什么？ 理论基础：细胞具有全能型。 3.我国药用植物的组织培养起源于20世纪60年代，哪位学者首先进行了何种药用植物的研究？ 罗士伟教授 人参的组织培养 4. 植物组织培养的特点? 特点: （1）培养条件可以人为控制；（2）生长周期短，繁殖率高；（3）管理方便，利于工厂化生产和自动化控制。 5. 一般药用植物组织培养实验室由那些分室所组成?各分室的作用及所需仪器设备等。

3、 一般药用植物组织培养实验室由准备室（条件许可的情况下，可细分为储存室、洗涤室、配制室）、无菌操作室、培养室和温室。 （1）准备室作用：主要进行一些常规的试验操作，如所需器皿的洗涤、干燥和保存，培养基的配制和灭菌，蒸馏水的生产，常规的生理生化分析，以及组织培养中常用的化学试剂、玻璃器皿的存放。 所需仪器设备：普通天平（1/10）。分析天平（1/10000）、冰箱、高压蒸汽灭菌锅、蒸馏水制造装置、干燥箱或烘箱、酸度计（或PH试纸5.0-7.0）、微波炉或电炉、药品柜及培养容器、分注器等。 （2） 无菌操作室作用：主要进行植物材料的表面灭菌、接种及培养物的继代转接等。 所需仪器设备：超净工作台、周

4、转小推车、紫外灯、（显微镜、显微摄影装置）、酒精灯、镊子剪刀类、细菌过滤器。 （3）培养室作用：对接种后的材料进行培养，使其生长、分化的场所。 所需仪器设备：为了满足培养材料生长、繁殖所需的温度、光照、湿度和通风条件，培养室必须有培养架日光灯、电炉或空调、自动定时器以及增湿机或去湿机、震荡培养机等。 （4） 温室作用：栽培提供组培取材用的材料，或作为试管苗炼苗、移栽管理的场所。 所需仪器设备：喷雾、灌溉装置（灌输、增加空气湿度等），遮阴网（进行遮光处理），移植床等设施。 6.若对某种药用植物进行组培时选材需考虑那些因素? 外植体的选择 （1）取材部位：部位不同，培养的难易程度不同，有的部位来源

5、困难，有的部位容易变异，因此，选材时既要考虑培养成苗的难易程度，又要考虑材料来源是否有保障，同时兼顾遗传稳定性。一般幼嫩的茎、叶为最理想的。 （2）取材季节：在取材季节上，应尽量选择旺盛生长的季节取材，因旺盛生长时期的材料内源激素含量较高，再分化比较容易。 （3）材料的老嫩：在外植体的选择上应尽量选择未分化或分化程度较轻的组织作为外植体。年幼的组织比年老的组织好培养，因而茎尖和嫩梢是很好的外植体材料。 （4）材料的大小：材料越少，带毒越少，但不易成活。 7. 污染是组培中经常发生的，而引起污染的污染源主要有哪些？其表现特征为？预防措施为？ 污染源主要有：细菌和真菌 细菌性污染主要表现：在培养基

6、某一位置或培养材料周围出现黏液状物或浑浊的水迹状痕迹，有时呈现发酵状泡沫。一般在接种13d后即可发现。 真菌性污染主要表现：培养基污染部位发霉，出现黑、白、黄等不同颜色的霉菌，一般在接种后35d或更长时间后才会出现。 预防措施： 1.选择植物材料 取材时选择带菌少的时期、部位等进行培养。 2.严格消毒灭菌 培养基：灭菌时要检查高压蒸汽灭菌的温度、压力、时间和正确使用情况； 接种环境：是否对接种室定期用甲醛和高锰酸钾混合液熏蒸，接种前用紫外灯消毒、保持室内清洁、干燥和密闭等； 接种用具：接种用具是否进行灭菌处理等； 3.规范操作 整个接种操作过程是否规范、熟练等。 8. 对接种室进行灭菌的方法主

7、要有哪两种? （1）定期用甲酸及高锰酸钾熏蒸 （2）工作前还应用紫外灯照射20分钟及用70%酒精喷雾降尘。9.组织培养中,一般培养温度设定为? 252oC10.接种的定义为? 接种：把处理好的外植体经无菌操作程序转移到培养基上的过程11.对培养基进行高压蒸汽灭菌时,一般灭菌时间为? 一般灭菌时间：1520min12.组培中对外植体消毒的目标是? 既要消灭材料上的病菌，又要不损伤植物材料。13.碳水化合物在培养基的添加中具有哪些作用? 既作为碳源、能源，也有调节培养基渗透压的作用。14.生长素类物质在培养基中添加具有的作用是? 主要被用于诱导愈伤组织形成、促进细胞脱分化、促进细胞伸长、促进生根。

8、15. 细胞分裂素类物质在培养基中添加具有的作用是? （1）诱导芽的分化促进侧芽萌发生长。（2）促进细胞分裂与扩大。（3）抑制根的分化。16.培养基中添加的GA3除促进幼苗茎的伸长生长，促进不定胚发育成小植株外,还具有的作用是? 对器官形成有很好的促进作用。17.以MS培养基为代表的高盐成分培养基的特点为? 无机盐，如钾盐、铵盐及硝酸盐含量较高，微量元素种类齐全，营养丰富，不需要添加更多的有机附加物。18.以White培养基为代表的低无机盐含量培养基的特点是? 无机盐含量非常低，为MS的1/4左右（主要指大量元素），有机成分也很低，多用于生根培养。19.用手提式高压蒸汽灭菌锅进行灭菌时,是否需

9、要将冷空气排净? 灭菌时排除冷空气非常重要，因为冷空气使锅内温度不一致，低层的温度不一致，低层温度达不到121oC，导致培养基不能充分灭菌。20.灭好菌的的培养基需进行灭菌效果检验时，检验方法为？ 检验方法：置于培养室中23天，若没有污染现象，说明灭菌的培养基可靠，可以使用。 大量元素 玻璃器皿 水洗 干燥 微量元素母液 铁盐 有机物 混合 调节pH 生长调节剂 分装 封口 高压蒸汽灭菌 加水、加热溶解 加水定容称量 蔗糖+琼脂 冷却备用21.请写出培养基制备程序的简化流程图。22.药用植物离体培养中通过器官发生再生植株的方式？ 先分化芽，待芽伸长后在其幼茎基部长根，形成完整的小植株。 先分化

10、根，再在根上产生不定芽而形成完整植株。 在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根，然后二者的维管组织互相连接进而成为一个完整的植株。23.影响植物离体形态发生的因素： 植物种类和基因型 不同物种和同一物种不同基因型间存在较大差别，形态发生能力难易程度不同。 培养材料的生理状态 发育年龄：一般幼嫩组织比老态组织形态发生能力强。 培养器官或组织类型 同一植物的不同器官、组织或细胞，其形态发生的能力和方向常有所不同。双子叶植物形态发生常用外植体依次为：叶、茎、胚轴、子叶等；单子叶植物特别是禾本科植物，细胞分裂旺盛的分生组织或器官较好。而裸子植物则大部分以子叶为外植体 培养时间和细胞倍性 愈伤组织培养时间过

11、长或继代次数太多，往往会推迟或降低形态发生的能力。所以一般取处于旺盛生长期的愈伤来诱导器官形成。但某些植物的胚状体发生，则需要愈伤组织培养时间长或多次继代培养。 培养基： 营养成分：一般认为，培养基中的铵态氮和K+有利于胚状体形成，提高无机磷的含量可促进器官发生。 植物生长调节剂（可以刺激植物生长，也可抑制，对植物的生命活动真正起到调节作用。） 生长素 促进外植体生长、生根并与细胞分裂素共同诱导不定芽分化及侧芽萌发与生长，抑制植物器官脱落，延长休眠。 细胞分裂素 促进分化和芽形成，抑制根发育及衰老。 赤霉素 促进茎的伸长，打破休眠，对芽的诱导和形成有促进作用。 乙烯 对芽的诱导和形成有促进或抑

12、制作用。 脱落酸 抑制细胞分裂和伸长，对休眠的发生及成熟很重要，可增加胚性愈伤组织的形成和体胚发生，防止畸形胚的发生，提高抗逆性。 培养基的性质 培养基的物理性质，如固态、液态、渗透压等，对器官或胚状体的形成及发育也有明显的影响。 培养条件： 光照光在苗的形成，根的发生、叶枝状的分化以及胚状体的形成等过程中的重要作用。 温度大多植物的培养恒温培养有利。有些植物需进行低温预处理，有较好的培养效果。24.胚培养的应用有哪些方面？ 克服远缘杂交的不亲和性打破种子休眠、缩短育种周期提高种子萌发率（或克服种子的自然不育性） 种子生活力的测定25.通过培养被子植物的何种组织可获得三倍体植株？ 由于被子植物

13、的胚乳是三倍体，因此通过胚乳培养可得到三倍体植株26.完整的人工种子组成包括哪些部分? 体细胞胚、人工胚乳和人工种皮27.人工种子的制备技术 胚状体的诱导： 外制体的选择和消毒愈伤组织的诱导胚状体的诱导、器官诱导等。 成熟与干燥： 胚状体诱导成功后必须转入成熟培养基中培养，使他们同步增殖并达到成熟，才可用于制备人工种子； 胚状体诱导成熟后，须进行干燥处理。一般，繁殖体经过干燥后，人工种子的成株率明显提高，而且耐贮存。 人工种子的包裹： 人工种子的包裹方法主要有：液胶包埋法、干燥包裹法和水凝胶法。目前广泛使用的是水凝胶法中的离子交换法，常用海藻酸钠来包裹，制成的人工种子是水凝胶珠状的。 *操作方

14、法为： 无菌条件下选择好胚状体悬浮于23海藻酸钠溶液中用滴管将该溶液滴入0.1mol/LCaCl2溶液中发生离子交换反应表面迅速发生络和作用，形成胶囊丸状人工种子无菌水冲洗1/2MS发芽实验/4oC下保存/或根据需要再用材料包裹。28.分离单细胞的最好材料是： 叶组织（叶片）29.由愈伤组织来分离单细胞时，以什么样的外观为最佳？ 外观疏松、生长快、浅色30.药用植物细胞培养的应用有哪些方面？ 药用次生代谢产物的生产生产天然的植物成分生物转化细胞的工厂化生产 突变体的选择 诱导多倍体31.细胞悬浮培养的方法有那几种？ 分批培养:指把细胞分散在一定容积的培养基中进行培养，当培养物增殖到一定量时，转

15、接继代，建立起单细胞培养物。 连续培养：是利用特制的培养容器进行大规模细胞培养的一种方式。是指在深入研究分批培养中生长曲线形成的内在机制的基础上，开放培养系统，不断补充营养液、解除抑制因子、优化生长代谢环境的培养方式。 常用的连续培养法有恒浊法与恒化法： 恒浊法：是以培养器中细胞的密度为监控对象，用光电控制系统来控制流入培养器的新鲜培养液的流速，同时使培养器中的含有细胞与代谢产物的培养液也以基本恒定的流速流出，从而使培养器中的培养物在保持细胞密度基本恒定的条件下进行培养的一种连续培养方式。 恒化法：是通过控制培养基中营养物，主要是生长限制因子的浓度，来调解培养物的有机繁殖与代谢速度的连续培养方

16、式。32.常温保存中，加生长抑制剂或延缓剂进行保存时，常用的抑制剂为？ 脱落酸。脱落酸诱导种胚细胞分裂停止、启动并维持种子休眠,而赤霉素启动和促进种子萌发,两者在调节种子休眠和萌发过程中存在相互拮抗的关系.具有抗GA的作用，抑制DNA合成，从而达到抑制外植体的作用。33.低温保存离体种质时，培养材料的生长是否停止？ 不会，培养物的生长受到限制，生长速度减慢，但不会完全停止，因此仍需要进行继代。34.超低温保存离体种质的基本程序为：选取离体材料预处理（加速继代、提高培养基渗透压、低温锻炼、加冷冻防护剂）冷冻（快冻、慢冻、俩步冰冻、逐级冰冻）冷冻（种质库）储存（196oC）解冻再培养（细胞生长、植

17、株再生）35.茎尖脱毒中，茎尖大小与脱毒及成活率的关系？ 与脱毒反比 培养的成活率成正比36.热处理脱毒中，热处理是杀死病毒还是钝化病毒的活性？ 热处理并不能杀死病毒，只能部分地或完全地钝化病毒的活性。37. 植物病毒的介体传播方式中，主要的传播昆虫为？ 蚜虫38.旺盛分裂的细胞中植物核蛋白合成与病毒核蛋白的合成谁占优势？ 当植物细胞分裂时，病毒DNA随着复制，因此，植物细胞分裂和病毒繁殖之间存在相互竞争，在迅速分裂的植物细胞中，是正常核蛋白合成占优势，而在植物细胞伸长期间，是病毒核蛋白占优势。 在旺盛分裂的分生细胞中，代谢活性很高，使病毒无法进行复制。39.药用植物组培苗进行工厂化生产的生产

18、车间的设计原则为？ （1）方便原则；（2）无菌原则；（3）节能原则；（4）安全原则。40.高压蒸汽灭菌锅的使用： 加水：水超过内支架1cm。 装锅：将包扎好的试管或三角瓶直立放在内筒中，不要装得过紧、过满。 盖严锅盖：先将软管对好内筒插孔，盖严锅盖，对角旋转旋钮。 加热：插上电炉插头或推上电闸加热。 排放冷空气：当锅内压力上升到所需压力一半（0.05MPa）时，将电源切断，放气阀打开，排净冷空气。 升压保温：排净冷空气后，继续加热，到压力表指针达到0.1MPa（或121.3oC）0.15MPa（或128oC）时，维持2030分钟。 降压排气：到时间后切断电源，使其自然冷却，待压力表指针降到0.

19、05MPa时，打开放气阀，排净蒸汽。 出锅冷却：压力表指针归零后，打开锅盖，取出试管或三角瓶摆在平台上冷却。41. 无机营养成分：（共16种） 大量元素：指在培养基中浓度大于0.5mmol/L的元素。包括：C、H、O、N、P、K、Ca、Mg、S 微量元素：指浓度小于0.5mmol/L的元素。包括：Mn、Fe、Cu、Zn、Cl、B、鉬Mo42. 植物生长调节剂：（常用）生长素：NAA（萘乙酸）、IAA（吲哚乙酸）、2,4-D（2，4-二氯苯氧乙酸）等细胞分裂素：KT、6-BA、Zip等赤霉素：GA3乙烯：脱落酸：ABA名解药用植物组织培养：以现代生命科学理论为基础，结合化学学科的科学原理，采用先

20、进的生物工程技术手段，以药用植物为研究对象，进行其组织器官的发生、培养和细胞融合、转化以及次生代谢产物和药材组培苗工厂化生产研究的一门新兴的综合性应用学科。愈伤组织：植物在受伤之后于伤口表面形成的一团薄壁细胞；在组织培养中，则指在人工培养基上由外植体长出来的一团无序生长的薄壁细胞。外植体：组培中，由活植物体上切取下来进行培养的那部分组织或器官，包括了植物各个部分的各种组织，能在合适的条件下成功地进行培养。全能性：任何具有完整的细胞核的植物细胞都拥有形成一个完整植株所必需的全部遗传信息。组织细胞培养：植物各个部分组织、单个细胞或很小的细胞团和原生质体等的离体无菌培养。原生质体培养：除去植物细胞的

21、细胞壁，培养裸露的原生质体，使其重新形成细胞壁并继续分裂、分化，形成植株的方法。人工种子：经过人工包裹的单个体细胞胚而形成的具有与天然种子相同机能的一种“种子”。早熟萌发：幼胚接种后，离体胚越过正常胚胎发育阶段，不再继续其胚性生长，而是在培养基上迅速萌发成幼苗。离体授粉技术：未授粉的胚珠培养于试管内的琼脂培养基上，在移植的胚珠上撒上花粉粒，落到胚珠表面上的花粉粒1015分钟后萌发，2小时内即在胚珠的外表布满了花粉管，授粉后12天内完成受精，5天内受精胚珠膨大，鼓胀而不透明，里面已形成了1个有4个细胞的原胚和若干胚乳游离核。原生质体融合：将不同来源的原生质体在诱导剂或电激作用下相互接触，从而发生

22、融合并形成杂种细胞，进一步分化再生形成杂种植株。因取材为植物体细胞，完全不经过有性过程，只通过体细胞融合制造杂种，故又称体细胞杂交。平板培养法：将单细胞悬浮液按一定的细胞浓度，接种到1mm厚的固体培养基上进行培养。看护培养法：把单个细胞置于一块生长活跃的愈伤组织上进行培养，用一片滤纸将愈伤组织和单细胞隔开，由愈伤组织哺育单细胞，使之分裂、增殖。微室培养法：把细胞置于人工制造的微室中进行培养，用条件培养基代替看护组织。细胞遗传转化：把外源基因导入细胞的过程。填空全能性条件：一是要把这些细胞从植物体其余部分的抑制性影响下解脱出来；二是要给予它们适当的刺激。脱分化细胞进行再分化过程方式：一是器官发生

23、方式；二是胚胎发生方式。低无机盐培养基：White培养基、WS培养基、HE培养基、改良Nitsch培养基，HB培养基。常用碳源：碳水化合物、醇和有机酸。原生质体分离的方法：机械法、酶解法。原生质体培养方法：固体培养琼脂糖包埋；液体培养；双层培养。原生质体低密度培养对策：饲养细胞层法、共培养法、Cuprak微滴法。药用植物工厂功能设置：贮藏室、制剂室、洗涤室、灭菌室、接种室、培养室、炼苗温室。高温灭菌锅内压为108kPa。简答培养基的种类： 1、MS及类似的培养基：LS培养基、BL培养基、BM培养基、ER培养基；2、硝酸钾含量较高的培养基：B5培养基、SH培养基、N6培养基；3、中等无机盐含量的

24、培养基：H培养基、Nitsch培养基、Miller培养基和Blaydes培养基；4、低无机盐培养基：White培养基、WS培养基、HE培养基、改良Nitsch培养基、HB培养基。培养基成分： 水、无机营养成分（大量元素：氮、磷、钾、钙、镁和硫；微量元素：铁、锰、铜、锌、氯、硼和钼等）、碳源、有机化合物（植物生长调节物质、维生素、氨基酸）、天然复合物（椰乳、香蕉、马铃薯、水解酪蛋白、其他）、前体物质、培养材料的支持物及其他添加物（培养材料的支持物、活性炭）、抗生物质、人参等中药提取物。外植体脱分化形成愈伤组织可划分为三个时期，起动期、分裂期、分化期。 起动期特点：起动期是愈伤组织形成的起点。外观

25、上看不到外植体明显变化，实际上细胞内发生着激烈变化。RNA的含量迅速增加，细胞核也变大。脱分化起动期的实质是在外源生长素诱导下，首先激活了细胞中特定基因的表达，为进入细胞分裂的DNA复制奠定了基础。 分裂期特点：在细胞分裂期外植体切口边缘开始膨大，外层细胞开始分裂，这时细胞核大，核仁明显，可见大量分生细胞团的形成。当细胞最小、细胞核和核仁最大、RNA含量最高时，标志着细胞分裂进入了高峰期。 分化期特点：细胞大小趋于稳定，原在分裂期出现于组织边缘的细胞分裂多呈平周分裂，从而使创伤形成层的细胞呈辐射状排列，接着内部组织细胞开始分裂，细胞数目进一步增加，以致冲出表层形成大量愈伤组织。胚胎培养的意义：

26、 一、克服植物远缘杂交障碍：1、植物的两种受精隔离机制（拒绝异种受精，拒绝自花受精），2、植物远缘杂交障碍的表现形式（花粉不萌发、花粉管不能伸入花柱、生长缓慢，胚败育引起的杂交不结实）；二、打破种子休眠：1、种胚发育不全（无胚乳种子果实成熟时，需与微生物“共生萌发”；胚乳种子离开母体时，胚龄幼小，仍需吸收胚乳营养），2、存在抑制种胚发育的物质；三、克服珠心胚干扰，提高育种效率：有些植物种子存在多胚现象，其中只有一个胚是通过受精产生的。珠心胚干扰确定真正的杂种，还会造成杂种胚夭折；四、克服种子的自然不育性：长期营养繁殖的植物，种子常是无活力的；五、种子生活力的测定：应用一般的种子萌发试验需较长时

27、间，未经层积处理和经层积处理的种胚，离体培养条件下萌发速率一致。影响花药培养的因素：1、培养基中的激素成分：激素成分对诱导细胞生长和分裂有重要作用。调节激素成分，可以影响花粉发育类型和是二倍体的体细胞组织或是单倍体的花粉细胞生长增值；2、培养基中的蔗糖浓度：高蔗糖浓度不利于体细胞的生长，而不影响花粉生长；3、花粉的发育时期：单核中期或单核后期为花药培养的最适期；4、植物材料的选择：用花药或花粉培育诱导形成愈伤组织或胚状体的难易程度，在不同植物不同品种间有很大差异性；5、培养条件。如何净化植物原生质体并测定活力：1、沉降法：将滤液置于离心管中离心后，原生质体沉于管底，弃去上清液，反复3次；2、漂

28、浮法：根据原生质体来源不同，利用比重大于原生质体的高渗蔗糖溶液，离心后使原生质体漂浮其上，残渣碎屑沉管底；3、界面法：采用两种密度不同的溶液，离心后使完整的原生质体处在两液相的界面；4、原生质体活力的测定：胞质环流法、氧电极法、渗透压变化法、染色法（伊凡蓝染色法、二乙酸荧光素法、酚藏花红染料法）。单细胞培养方法及各有什么含义：1、平板培养法：将单细胞悬浮液按一定的细胞浓度，接种到1mm厚的固体培养基上进行培养的过程，此法易于在显微镜下追踪管擦细胞的分裂和细胞团的增值；2、看护培养法：把单个细胞置于一块生长活跃的愈伤组织上进行培养，用一片滤纸将愈伤组织和单细胞隔开，由愈伤组织哺育单细胞，使之分裂、增殖，单细胞子啊看护愈伤组织的影响下可能发生分裂；3、微室培养法：把细胞置于人工制造的微室中进行培养，用条件培养基代替看护组织，对培养过程中细胞的生长、分裂和形成细胞团的活动，可以进行连续显微观察。