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1、-酵母细胞的固定化(教学案)-第 9 页课题4 酵母细胞的固定化1基础知识1固定化酶的应用实例生产高果糖浆（1）高果糖浆的生产原理：葡萄糖异构酶果糖葡萄糖（2）葡萄糖异构酶固定：将葡萄糖异构酶固定在颗粒状载体上，装入反应柱中。（3）高果糖浆的生产操作（识图45反应柱）：从反应柱上端注入葡萄糖溶液，从下端流出果糖溶液，一个反应柱可连续使用半年。2固定化技术的方法（识图46固定方法）：将酶和细胞固定化方法有包埋法、化学结合法和物理吸附法。【比较】酶和细胞的固定方法和特点固定对象酶细胞适宜固定法化学结合法、物理吸附法包埋法特 点体积小，固定一种酶。包埋法容易丢失体积大，固定一系列酶。难以化学结合和吸
2、附思考1对固定酶的作用影响较小的固定方法是什么？吸附法。思考2将谷氨酸棒状杆菌生产谷氨酸的发酵过程变为连续的酶反应，应当固定（酶、细胞）；若将蛋白质变成氨基酸，应当固定（酶、细胞）。3固定细胞的材料：固定细胞时应当选用不溶于水的多孔性载体材料，如明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等2实验设计1制备固定化酵母细胞（1）酵母细胞的活化：1g干酵母10mL蒸馏水50mL烧杯搅拌均匀放置1h，使之活化。思考3活化是指让处于休眠状态的微生物重新恢复正常生活状态的过程。（2）配制CaCl2溶液：0.83gCaCl2150mL蒸馏水200mL烧杯溶解备用。（3）配制海藻酸钠溶液：0.7g海藻酸1
3、0mL水50mL烧杯酒精灯微火（或间断）加热，并不断搅拌，使之溶化蒸馏水定容到10mL。思考4微火加热并不断搅拌的目的是什么？防止海藻酸南焦糊。（4）海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合：将溶化的海藻酸钠溶液冷却至室温，加入活化酵母细胞液，搅拌后吸入到注射器中。思考5为什么要海藻酸钠溶液冷却后才能加入酵母细胞？防止高温杀死酵母细胞。（5）固定化酵母细胞：以恒定速度缓慢地将注射器中的溶液滴加到CaCl2溶液中，形成凝胶珠状颗粒。2固定化酵母细胞的发酵（6）冲洗：将固定的酵母细胞凝胶珠用蒸馏水冲洗23次。（7）发酵：150mL10葡萄糖固定化酵母细胞200mL锤形瓶密封25发酵24h。思考6发酵过程中锥形
4、瓶为什么要密封？酵母菌的酒精发酵需要缺氧条件。思考7锥形瓶中的气泡和酒精是怎样形成的？酵母菌进行无氧呼吸产生的。思考8在利用固定化酶或固定化细胞进行生产的过程中，需要无菌操作码？需要。酵母细胞的活化配制CaCl2溶液配制海藻酸钠溶液将海藻酸钠溶液与酵母细胞的混合固定化酵母细胞冲洗凝胶珠酒精发酵3发酵操作（四）实例探究例1关于酵母菌的叙述，正确的是A酵母菌在营养物质充足时、环境适宜时，依靠有性生殖进行繁殖B酵母菌的代谢类型是异养厌氧型C酵母菌的生物膜系统包括细胞膜、核膜、各种的细胞器膜等膜D用酵母菌酿酒时，应先密封后通气解析：酵母菌在环境适宜时进行出芽生殖，环境不良时进行孢子生殖。代谢类型为异养
5、兼性厌氧型。酵母菌细胞为真核细胞，因此具有生物膜系统。在酿酒时，应当先通气后密封。答案：C例2研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的，如将大肠杆菌得到的三酯磷酸酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，于微生物降解相比，其作用不需要适宜的A温度 B酸碱度 C水分 D营养解析：本题考察酶和细胞的比较，二者的正常活动都需要一定的条件，如温度、酸碱度、水份等，但是酶本身是一种大分子物质，不需要营养，而细胞的生活离不开营养物质。答案：D综合应用例3下列有关固定化技术的叙述，正确的是（ ）A固定化酶只是在细胞内才能发挥作用B固定化酶能提高酶的利用率C酶的固定是酶分离纯化的常用
6、方法D固定化酶的固定化方式就是吸附在固体表面上。解析：制成固定化酶的步骤是：酶的生产、提取、酶的分离纯化、酶的固定化，制成固定化酶的方法有吸附在固体表面，有将酶相互连接起来将酶包埋在细微的网格里等；这样的固定化酶能重复利用，从而提高了酶的利用率；而酶在条件适宜时，既可在细胞内起作用，也能在细胞外起作用，制成的固定化酶，更是主要在细胞外发挥作用。答案选B（五）巩固练习1酶的固定化常用的方式不包括A吸附 B包埋 C连接 D将酶加工成固体2溶解海藻酸钠，最好采用 加热的方法A小火间断 B小火持续 C大火间断 D大火持续3高果糖浆生产需要的酶是A葡萄糖异构酶 B蔗糖酶 C麦芽糖酶 D果糖酶4关于酵母菌
7、的叙述，正确的是A酵母菌在营养物质充足时、环境适宜时，依靠有性生殖进行繁殖B酵母菌的代谢类型时异养厌氧型C酵母菌的生物膜系统包括细胞膜、核膜、各种的细胞器膜等膜D用酵母菌酿酒时，应先密封后通气5研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的，如将大肠杆菌得到的三酯磷酸酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，于微生物降解相比，其作用不需要适宜的A温度 B酸碱度 C水分 D营养6将酵母菌的培养液由富氧状态变为缺氧状态，下面加快的一项是ACO2的释放 B丙酮酸的氧化 C葡萄糖的利用 DATP的形成7固定化酶的优点是A有利于增加酶的活性 B有利于产物的纯化C有利于提高反应速度 D
8、有利于酶发挥作用8下列不是用于包埋法固定化细胞的载体是A琼脂糖 B醋酸纤维素 C聚丙烯酰胺 D聚乙烯树脂9关于固定化细胞的叙述，正确的是A催化效率高，低耗能、低污染B对环境的条件非常敏感，容易失活C既能与反应物充分接触，又能与产物分离D成本低、操作简单，但反应效果可能很低10固定化细胞技术不包括A包埋法 B化学结合化 C物理法 D生物法答案：1D 2A 3A 4B 5D 6C 7B 8D 9.C 10.D课余作业1什么是细胞的活化。2如何检验凝胶珠的质量是否合格。教学体会固定化酶的技术要求比较高，因此在教学过程中重点介绍固定化酵母细胞的操作。对于固定化酶的作用、原理及其在生产中的应用，主要是让
9、学生通过生产实例来了解。教师在教学时可以采用让学生能够阅读自学的方式。例如，在葡萄糖的异构反应中，如果不将葡萄糖异构酶固定化，而是直接使用葡萄糖异构酶，会对生产产生哪些影响？资料袋固定化细胞的载体固定化细胞技术所采用载体的物理化学性质直接影响所固定细胞的生物活性和体系传质性能。理想的载体材料应具有对微生物无毒性、传质性能好、性质稳定。寿命长、价格低廉等特性。它可分为有机高分子载体、无机载体和复合载体三大类。有机高分子载体又分为天然高分子凝胶载体和合成有机高分子凝胶载体。天然高分子凝胶一般对生物无毒，传质性能较好，但强度较低，在厌氧条件下易被生物分解。有机合成高分子凝胶载体一般强度较大，但传质性
10、能较差，在进行细胞固定时对细胞活性有影响，易造成细胞失活。无机载体大多具有多孔结构，在与微生物接触时，利用吸附作用和电荷效应，从而把微生物固定。它的操作方法是把载体放人含有一定微生物浓度的溶液中，固定一段时间（24h左右）即可。由有机载体和无机载体材料组成的复合载体材料，可以改进载体材料的性能。Lin等将粉末活性炭和Phanerochaete chrysosporium联合包埋固定，结果表明了复合固定化体系能更加有效地用于降解五氮酚，显示出复合载体材料的优越性。、课堂练习1高果糖浆生产需要的酶是 ( )A葡萄糖异构酶 B蔗糖酶 C麦芽糖酶 D果糖酶2下列关于固定化酶中用到的反应柱的理解中。正确
11、的是 ( )A反应物和酶均可自由通过反应柱 B反应物和酶均不能通过反应柱C反应物能通过，酶不能通过 D反应物不能通过，酶能够通过 3.如果反应物是大分子物质，采用那种方法催化受限制( )。A直接使用酶 B使用化学方法结合的酶C使用固定化细胞 D使用物理吸附法固定的酶4固定化细胞常用包埋法固定，原因是A包埋法固定操作最简便 B包埋法对酶活性的影响最小C包埋法固定具有普遍性 D细胞体积大，难以被吸附或结合5下列不属于固定化酶在利用时的特点的是 ( )A一种固定化酶一般不能催化一系列酶促反应B有利于酶与产物分离，提高产物品质C能自由出入依附的载体D酶是催化剂，但固定化酶也不可永远利用6、下列关于固定
12、化酶技术说法中，正确的是A固定化酶技术就是固定反应物，让酶围绕 反应物旋转的技术B固定化酶的优势在于能催化一系列的酶促反应 C固定化酶中的酶无法重复利用D固定化酶是将酶固定在一定空间的技术7、目前，酶已经大规模地应用于各个领域，下列属于应用中所面临的实际问题的是 ( )A酶通常对强酸、强碱、高温非常敏感，但对有机溶剂不敏感B酶的结构比较稳定，所以催化功能很高C酶用于生产时可能会混在产物中，影响产品质量 D直接用于生产中的酶可以多次利用8.固定化细胞对酶的活性影响最小，根本原因是( )。A避免了细胞破碎、酶的提取纯化过程 B固定化细胞在多种酶促反应中连续发挥作用C促化反应结束后，能被吸收和重复利
13、用D细胞结构保证了各种酶在细胞内化学反应中有效的发挥作用9.关于酵母细胞活化的说法，不正确的是( )。A酵母细胞活化就是由无氧呼吸变成有氧呼吸 B酵母细胞活化所需要的时间较短 C活化就是让处于休眠状态的细胞恢复生活状态 D酵母细胞活化后体积增大 10下列关于固定化酶和一般酶制剂在应用效果上的说法中，错误的是 ( ) A固定化酶生物活性强，可长久使用 B一般酶制剂应用后和产物混在一起，产物的纯度不高 C一般酶制剂只能一次性利用 D固定化酶可降低生产成本，提高产量和和质量11、 使用固定化酶的优点是 ( )A有利于增加酶的活性 B有利于产物的纯化 C有利于提高反应速度 D有利于酶发挥作用12.酶的
14、固定方式不包括( )。A.将酶吸附在载体表面上 B将酶相互连接起来 C将酶包埋在细微网格里 D将酶加工成固体13.使用固定化细胞的优点是( )。A.能催化大分子物质的水解 B可催化一系列化学反应 C与反应物易接近 D有利于酶在细胞外发挥作用14.下列关于酶和细胞的固定叙述不正确的是( )。A 酶分子很小，易采用包埋法 B酶分子很小，易采用化学结合或物理吸附法固定的酶C细胞个大，难被吸附或结合 D细胞易采用包埋法固定15研究认为，用固定化酶技术处理污染物是很有前途的，如将大肠杆菌得到的三酯磷酸酶固定到尼龙膜上制成制剂，可用于降解残留在土壤中的有机磷农药，与微生物降解相比，其作用不需要适宜的 (
15、) A温度 B酸碱度 C水分 D营养16下列不是用于包埋法固定化细胞的载体是( ) A琼脂糖 B醋酸纤维素 C聚丙烯酰胺 D聚乙烯树脂17下列关于固定化细胞的叙述，正确的是 ( ) A催化效率高，低耗能、低污染 B对环境的条件非常敏感，容易失活 C既能与反应物充分接触，又能与产物分离 D成本低、操作简单，但反应效率可能很低18溶解海藻酸钠，最好采用下列哪种加热的方法 ( ) A小火间断 B小火持续 C大火间断 D大火持续19.对配制海藻酸钠溶液的叙述不准确的是( )。 A加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环 B.海藻酸钠的浓度涉及固定化细胞的质量C海藻酸钠的浓度过高，易形成凝胶珠 D海藻酸钠
16、的浓度过低，形成凝胶珠内包埋细胞过少20、下列有关固定化酵母细胞制备步骤正确的是 ( )A应使干酵母与自来水混合并搅拌，以利于酵母菌活化B配制海藻酸钠溶液时要用小火间断加热的方法C向刚溶化好的海藻酸钠溶液中加入已活化的酵母细胞，充分搅拌并混合均匀D将与酵母细胞混匀的海藻酸钠溶液注人CaCl2溶液中，会观察到CaCl2溶液中有球形或椭球形的凝胶珠形成21下列关于酵母菌的叙述，正确的是 ( )A酵母菌在营养物质充足、环境适宜时，依靠有性生殖进行繁殖 B酵母菌的代谢类型是异养厌氧型 C酵母菌的生物膜系统包括细胞膜、核膜、各种细胞器膜等D用酵母菌酿酒时，应先密封后通气22在制备固定化酵母细胞的实验中，
17、CaCl2溶液的作用是 ( ) A调节溶液pH B进行离子交换 C胶体聚沉 D为酵母菌提供钙离子23.下图为固定化酶的反应柱示意图，请据图回答： (1)请请在横线上填出各标号名称._ _。(2) 与一般酶制剂相比，固定化酶的突出优点是_和_固定化细胞的优点是_。 (3)的作用是_。（4）制作固定葡萄糖异构酶所用的方式有_或_。 （5）据图说出反应柱的作用原理 23、答案：（1）反应柱； 固定化酶； 分布着小孔的筛板 （2）既能与反应物接触，又能与反应物分离； 能被反复利用； 成本更低，操作更容易 （3）酶颗粒无法通过筛板上的小孔，反应溶液可自由出入。（4）将酶相互连接起来；将酶吸附在载体表面上
18、 （5）反应物溶液从反应柱上端注入，使反应物溶液流过反应柱，与固定化酶接触，得到产物，从反应柱下端流出。24.下图是制备固定化酵母细胞实验步骤图解，请据图回答：酵母细胞活化配制CaCl2溶液配置海藻酸钠溶液海藻酸钠溶液与酵母细胞混合固定化酵母细胞(1) 在_状态下，微生物处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物恢复_状态。活化前应选择足够大的容器，因为酵母细胞活化时_。(2) 影响实验成败的关键步骤是_ 。(3) 如果海藻酸钠浓度过低，形成凝胶珠包埋酵母细胞数目_。（4）观察形成凝胶珠的颜色和形状，如果颜色过浅，说明 如果形成的凝胶珠不是圆形或椭圆形，说明 。（5）制备固定化酶不宜用包埋法
19、，为什么？24、答案：（1）缺水； 正常生活状态； 体积增大（2）配制海藻酸钠溶液； (3)少 （4）固定化酵母细胞数目较少； 海藻酸钠浓度偏高，制作失败（5）因为酶分子很小，容易从包埋材料中露出知识拓展：在具体的操作过程中，还应该注意下列问题。（一）酵母细胞的活化。在缺水的状态下，微生物会处于休眠状态。活化就是让处于休眠状态的微生物重新恢复正常的生活状态。酵母细胞所需要的活化时间较短，一般需要0.51 h，教师需要提前做好准备。此外，酵母细胞活化时体积会变大，因此活化前应该选择体积足够大的容器，以避免酵母细胞的活化液溢出容器外。（二）加热使海藻酸钠溶化是操作中最重要的一环，涉及到实验的成败，
20、教师一定要提醒学生按照教材的提示进行操作。海藻酸钠的浓度涉及到固定化细胞的质量。如果海藻酸钠浓度过高，将很难形成凝胶珠；如果浓度过低，形成的凝胶珠所包埋的酵母细胞的数目少，影响实验效果。（三）刚形成的凝胶珠应在CaCl2溶液中浸泡一段时间，以便形成稳定的结构。检验凝胶珠的质量是否合格，可以使用下列方法。一是用镊子夹起一个凝胶珠放在实验桌上用手挤压，如果凝胶珠不容易破裂，没有液体流出，就表明凝胶珠的制作成功。二是在实验桌上用力摔打凝胶珠，如果凝胶珠很容易弹起，也能表明制备的凝胶珠是成功的。直接使用酶、固定化酶和固定化细胞催化的优缺点如下表所示。类型优点不足直接使用酶催化效率高，低耗能、低污染等。对环境条件非常敏感，容易失活；溶液中的酶很难回收，不能被再次利用，提高了生产成本；反应后酶会混在产物中，可能影响产品质量。固定化酶酶既能与反应物接触，又能与产物分离，同时，固定在载体上的酶还可以被反复利用。一种酶只能催化一种化学反应，而在生产实践中，很多产物的形成都通过一系列的酶促反应才能得到的。固定化细胞成本低，操作更容易。固定后的酶或细胞与反应物不容易接近，可能导致反应效果下降等。