临床微生物学检验与抗菌药物敏感性试验进展讲稿.ppt

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1、关于临床微生物学检验与抗菌药物敏感性试验进展第一页，讲稿共四十一页哦现代感染性疾病的特点现代感染性疾病的特点感染性疾病（感染性疾病（infectious diseasesinfectious diseases）是指各种生物性病原）是指各种生物性病原( (病原微生物、寄生虫病原微生物、寄生虫) )寄生人体所引起的传染性感染疾病和寄生人体所引起的传染性感染疾病和非传染性感染疾病。非传染性感染疾病。 （一）疾病谱发生变迁，发现了很多引起传染病的新病原（一）疾病谱发生变迁，发现了很多引起传染病的新病原 体，如嗜肺军团菌、汉坦病毒、埃博拉病毒、尼巴病毒、体，如嗜肺军团菌、汉坦病毒、埃博拉病毒、尼巴病毒、

2、朊病毒、朊病毒、SARSSARS冠状病毒等。而且已经绝迹的旧传染病又死冠状病毒等。而且已经绝迹的旧传染病又死灰复燃，如梅毒、结核病、霍乱等。灰复燃，如梅毒、结核病、霍乱等。 （二）多重耐药株的出现，导致抗感染治疗的困难（二）多重耐药株的出现，导致抗感染治疗的困难（三）器官移植、抗肿瘤化疗和放疗的开展，减弱了机体的（三）器官移植、抗肿瘤化疗和放疗的开展，减弱了机体的 免疫防御功能，造成医院感染及条件性致病菌感染的增加免疫防御功能，造成医院感染及条件性致病菌感染的增加 上一页下一页返回返回第二页，讲稿共四十一页哦感染性疾病的实验诊断方法感染性疾病的实验诊断方法一般实验室检查一般实验室检查 1. 1

3、.血常规检查血常规检查 2.C 2.C反应蛋白反应蛋白(CRP) (CRP) 3. 3.降钙素原降钙素原(PCT), PCT(PCT), PCT是严重细菌性炎症和真菌感染的特异性指是严重细菌性炎症和真菌感染的特异性指标，而且也是脓毒症和炎症活动有关的多脏器衰竭的可靠指标，而且也是脓毒症和炎症活动有关的多脏器衰竭的可靠指标。如果给予足够的刺激，免疫抑制的患者将产生标。如果给予足够的刺激，免疫抑制的患者将产生PCTPCT，PCTPCT不仅是用于鉴别诊断的急性指标，而且是监控炎症活动的参数。不仅是用于鉴别诊断的急性指标，而且是监控炎症活动的参数。 病原学病原学实验诊断实验诊断 感染性疾病的病原体的实

4、验诊断方法包括病原体的分离培感染性疾病的病原体的实验诊断方法包括病原体的分离培养、病原体特异性抗原抗体的检测、病原体核酸检测等多养、病原体特异性抗原抗体的检测、病原体核酸检测等多种方法。种方法。上一页下一页返回返回第三页，讲稿共四十一页哦标本的采集与培养方法标本的采集与培养方法（一）标本采集原则：（一）标本采集原则： 1.采集标本时应无菌操作，尽量避免污染。盛放标本的容采集标本时应无菌操作，尽量避免污染。盛放标本的容 器和培养基应预先进行无菌处理并贴好标签。器和培养基应预先进行无菌处理并贴好标签。 2.应选择感染部位或病变明显的部位采集标本，避免周围应选择感染部位或病变明显的部位采集标本，避免

5、周围 组织、器官或分泌物中的杂菌污染。组织、器官或分泌物中的杂菌污染。 3.根据病原体在感染性疾病的不同时期的体内分布和排出根据病原体在感染性疾病的不同时期的体内分布和排出 部位选择在最佳时间采集适宜标本。部位选择在最佳时间采集适宜标本。 4.对于怀疑细菌感染的标本，尽量在抗生素使用前采集。对于怀疑细菌感染的标本，尽量在抗生素使用前采集。 5.标本采集后应及时送检。大多数细菌标本应冷藏送检，标本采集后应及时送检。大多数细菌标本应冷藏送检， 但是某些细菌，如脑膜炎奈瑟菌对低温和干燥极其敏感但是某些细菌，如脑膜炎奈瑟菌对低温和干燥极其敏感 ，应注意保温，尽量床旁接种，并预温相应的培养基。，应注意保

6、温，尽量床旁接种，并预温相应的培养基。上一页下一页返回返回第四页，讲稿共四十一页哦 上一页下一页返回返回第五页，讲稿共四十一页哦 上一页下一页返回返回第六页，讲稿共四十一页哦上一页下一页返回返回第七页，讲稿共四十一页哦上一页下一页返回返回第八页，讲稿共四十一页哦上一页下一页返回返回第九页，讲稿共四十一页哦7.7.穿刺液穿刺液 穿刺液包括胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液。穿刺液包括胸水、腹水、心包液、关节液及鞘膜液。正常的穿刺液是无菌的，有感染的情况下，只要检出细菌正常的穿刺液是无菌的，有感染的情况下，只要检出细菌，通常都可视为是病原菌，因此，革兰氏染色直接涂片检，通常都可视为是病原菌，因此，

7、革兰氏染色直接涂片检查很有意义，只要检出细菌即可诊断感染的类型。培养须查很有意义，只要检出细菌即可诊断感染的类型。培养须做需氧与厌氧培养，而且要同时接种肉汤做增菌培养，根做需氧与厌氧培养，而且要同时接种肉汤做增菌培养，根据分离鉴定的细菌选择相应的药敏实验进行报告。据分离鉴定的细菌选择相应的药敏实验进行报告。 上一页下一页返回返回第十页，讲稿共四十一页哦细菌感染的实验诊断方法细菌感染的实验诊断方法（一）显微镜检查（一）显微镜检查 直接显微镜检查是细菌感染实验诊断的基本方法之一，包直接显微镜检查是细菌感染实验诊断的基本方法之一，包 括染色和不染色标本检查法。染色法可根据镜下细菌的形括染色和不染色标

8、本检查法。染色法可根据镜下细菌的形 态及染色性做出初步诊断，只对特定样品中的细菌有诊断态及染色性做出初步诊断，只对特定样品中的细菌有诊断 价值。价值。1. 1. 革兰染色革兰染色 革兰染色是诊断细菌感染最简单快速的方法，通革兰染色是诊断细菌感染最简单快速的方法，通 常根据不同的染色性和细菌形态，可以对细菌的种属做出常根据不同的染色性和细菌形态，可以对细菌的种属做出 初步的推测性鉴定。初步的推测性鉴定。2. 2. 抗酸染色抗酸染色 鉴定结核和麻风等分枝杆菌属细菌的重要方法。鉴定结核和麻风等分枝杆菌属细菌的重要方法。3. 3. 墨汁染色墨汁染色 用于检查脑脊液的隐球菌，具有方便、快速、节用于检查脑

9、脊液的隐球菌，具有方便、快速、节 约成本等优点。约成本等优点。4. 4. 不染色标本直接检查法不染色标本直接检查法 主要用于检查细菌的动力及运动状主要用于检查细菌的动力及运动状 态。态。上一页下一页返回返回第十一页，讲稿共四十一页哦上一页下一页返回返回第十二页，讲稿共四十一页哦（二）病原菌的分离培养（二）病原菌的分离培养1. 1. 很多细菌的形态和染色性缺乏明显特征，仅凭形态学不能做确很多细菌的形态和染色性缺乏明显特征，仅凭形态学不能做确切的诊断，需经细菌的分离培养，甚至纯培养后，对细菌进切的诊断，需经细菌的分离培养，甚至纯培养后，对细菌进行生化和血清学鉴定，方能明确感染的细菌。行生化和血清学

10、鉴定，方能明确感染的细菌。2. 2. 原则上应对所有送检标本做分离培养，以便获得单个菌落后进行纯培原则上应对所有送检标本做分离培养，以便获得单个菌落后进行纯培养，从而对细菌做进一步的生物学、免疫学、致病性或细菌的药物养，从而对细菌做进一步的生物学、免疫学、致病性或细菌的药物敏感性等方面的检查，最终做出确切的报告。敏感性等方面的检查，最终做出确切的报告。3. 3. 细菌培养时应选择适宜的培养基，以便提供特定细菌生长所细菌培养时应选择适宜的培养基，以便提供特定细菌生长所需的必要条件。分离培养后根据菌落的大小、形态、颜色需的必要条件。分离培养后根据菌落的大小、形态、颜色、表面性状、透明度和溶血性等对

11、细菌做出初步的识别，、表面性状、透明度和溶血性等对细菌做出初步的识别，然后根据生化反应结果及血清学试验对分离菌做出鉴定。然后根据生化反应结果及血清学试验对分离菌做出鉴定。上一页下一页返回返回第十三页，讲稿共四十一页哦（三）病原菌抗体的检测（三）病原菌抗体的检测1. 1. 病原菌侵入机体后，其抗原性物质能刺激机体产生特异病原菌侵入机体后，其抗原性物质能刺激机体产生特异 性抗体。存在于血液或其他体液中的特异性抗体，常随性抗体。存在于血液或其他体液中的特异性抗体，常随 病程的进展发生变化。用已知细菌或其抗原检测病人体病程的进展发生变化。用已知细菌或其抗原检测病人体 内是否产生了相应的特异性抗体及其量

12、的多少，可作为内是否产生了相应的特异性抗体及其量的多少，可作为 某些病原菌感染的辅助诊断。某些病原菌感染的辅助诊断。2. 2. 常用的血清学试验包括：玻片或试管凝集试验、沉淀试常用的血清学试验包括：玻片或试管凝集试验、沉淀试 验、补体结合试验和冷凝集试验等，可根据病原菌的种验、补体结合试验和冷凝集试验等，可根据病原菌的种 类加以选择。血清学诊断一般适用于病程较长和抗原性类加以选择。血清学诊断一般适用于病程较长和抗原性 较强的病原菌引起的感染。较强的病原菌引起的感染。3. 3. 若以血清学试验结果作为诊断依据时，应在急性期和恢若以血清学试验结果作为诊断依据时，应在急性期和恢 复期各取一份血清同时

13、检测，恢复期血清效价明显升高复期各取一份血清同时检测，恢复期血清效价明显升高4 4 倍或以上时方有诊断价值。倍或以上时方有诊断价值。4. 4. 用血清学试验检测特异性抗体对感染性疾病的诊断有两用血清学试验检测特异性抗体对感染性疾病的诊断有两 方面的局限：在疾病的早期，抗体难以检测出来，因此方面的局限：在疾病的早期，抗体难以检测出来，因此 难以作为早期诊断的依椐难以作为早期诊断的依椐; ;当抗体水平升高时，很难找出当抗体水平升高时，很难找出 抗体效价与病情之间的关系。抗体效价与病情之间的关系。上一页下一页返回返回第十四页，讲稿共四十一页哦（四）病原菌抗原的检测（四）病原菌抗原的检测抗原的检测是用

14、已知的特异性抗体检测未知的细菌抗原成分。抗原的检测是用已知的特异性抗体检测未知的细菌抗原成分。这些试验特异、敏感、简便，即使是在采集样品前患者使用这些试验特异、敏感、简便，即使是在采集样品前患者使用了抗生素，对细菌的培养不易成功，但细菌的抗原仍能被检了抗生素，对细菌的培养不易成功，但细菌的抗原仍能被检测出来。因此抗原的检测是检查病原菌的常用技术，可直接测出来。因此抗原的检测是检查病原菌的常用技术，可直接使用临床标本或在细菌分离培养后进行。使用临床标本或在细菌分离培养后进行。上一页下一页返回返回第十五页，讲稿共四十一页哦（五）病原菌的核酸检测（五）病原菌的核酸检测1. 1. 传统的微生物学鉴定技

15、术主要根据微生物形态学和生化等表型特征传统的微生物学鉴定技术主要根据微生物形态学和生化等表型特征来进行。但有些试验耗时长、费用高或难以顺利完成。随着分子生来进行。但有些试验耗时长、费用高或难以顺利完成。随着分子生物学技术的发展，多种检测病原菌核酸的实验技术已经被建立。这物学技术的发展，多种检测病原菌核酸的实验技术已经被建立。这不但能有助于感染性疾病的确诊，还能确定病原菌的基因型，使微不但能有助于感染性疾病的确诊，还能确定病原菌的基因型，使微生物学的检测技术从细菌生物学检查进展到细菌分子生物学的鉴定生物学的检测技术从细菌生物学检查进展到细菌分子生物学的鉴定。2. 2. 分子生物学诊断技术常用于检

16、测不能在体外培养或目前的培养技分子生物学诊断技术常用于检测不能在体外培养或目前的培养技术不敏感、费用高昂或耗时长的病原体。目前常用的方法主要有术不敏感、费用高昂或耗时长的病原体。目前常用的方法主要有聚合酶链反应聚合酶链反应 (polymerase chain reaction(polymerase chain reaction，PCR) PCR) 及核酸杂交及核酸杂交技术技术( nucleotide hybridization)( nucleotide hybridization)包括包括SouthernSouthern印迹杂交印迹杂交(Southern blot)(Southern blot

17、)、NorthemNorthem印迹杂交印迹杂交(Northern blot)(Northern blot)、斑点、斑点杂交杂交(dot blot)(dot blot)和原位杂交和原位杂交(in situ hybridization(in situ hybridization，ISH)ISH)等。等。上一页下一页返回返回第十六页，讲稿共四十一页哦（六）内毒素检测（六）内毒素检测1. 1. 细菌内毒素检查法又称鲎试验法，它是细菌内毒素检查法又称鲎试验法，它是19641964年由美国学者年由美国学者LevihLevih和和BangBang发现，并在发现，并在19681968年正式建立的一种定性或定

18、量检测年正式建立的一种定性或定量检测微量细菌内毒素的分析方法。该法具有灵敏度高、特异性强和操作微量细菌内毒素的分析方法。该法具有灵敏度高、特异性强和操作简便快捷的特点，不仅在药学，而且在微生物学及临床检验等领域简便快捷的特点，不仅在药学，而且在微生物学及临床检验等领域应用较为广泛。应用较为广泛。2. 2. 鲎试验法可广泛用于革兰氏阴性菌感染的快速诊断，可对患者的鲎试验法可广泛用于革兰氏阴性菌感染的快速诊断，可对患者的血液、尿液及脑脊液进行直接检查，有助于临床医生及时发现内血液、尿液及脑脊液进行直接检查，有助于临床医生及时发现内毒素疾病，以迅速采取果断的治疗。在公共卫生方面，鲎试验法毒素疾病，以

19、迅速采取果断的治疗。在公共卫生方面，鲎试验法可对水源、食物、饮料等进行内毒素测定，以便将其控制在规定可对水源、食物、饮料等进行内毒素测定，以便将其控制在规定水平以下，预防疾病。水平以下，预防疾病。3. 3. 正常人血中内毒素浓度为：正常人血中内毒素浓度为：0.1 EU0.1 EUmlml，超过此值即可诊断为，超过此值即可诊断为内毒素血症。许多研究表明，内毒素与多种疾病密切相关，内毒素血症。许多研究表明，内毒素与多种疾病密切相关，内毒素血症多随病情恶化而加重，随病情缓解而减轻。因此内毒素血症多随病情恶化而加重，随病情缓解而减轻。因此，内毒素可以作为一个衡量病情和判断预后的参考指标。也，内毒素可以

20、作为一个衡量病情和判断预后的参考指标。也可用于临床治疗及判定疗效或筛选恰当药物的指标之一。可用于临床治疗及判定疗效或筛选恰当药物的指标之一。上一页下一页返回返回第十七页，讲稿共四十一页哦细菌的耐药性检测细菌的耐药性检测细菌耐药性的概念细菌耐药性的概念 细菌耐药性细菌耐药性( drug resistance):( drug resistance):是指细菌对某抗菌药是指细菌对某抗菌药 物的相对抵抗性。指病原体对反复应用的化学治疗药物物的相对抵抗性。指病原体对反复应用的化学治疗药物 敏感性降低或消失的现象。敏感性降低或消失的现象。上一页下一页返回返回第十八页，讲稿共四十一页哦细菌的耐药性检测细菌的

21、耐药性检测细菌耐药性的遗传机制细菌耐药性的遗传机制（一）天然耐药指细菌对某些抗菌药物的天然耐药，耐药基因源自（一）天然耐药指细菌对某些抗菌药物的天然耐药，耐药基因源自亲代，由细菌染色体基因决定而且代代相传的耐药性，存在亲代，由细菌染色体基因决定而且代代相传的耐药性，存在于其染色体上，具有种属特异性，天然耐药性始终如一并可于其染色体上，具有种属特异性，天然耐药性始终如一并可预测。预测。（二）获得耐药获得耐药性指细菌（二）获得耐药获得耐药性指细菌DNADNA的改变导致其获得耐药性表型。的改变导致其获得耐药性表型。耐药细菌的耐药基因来源于基因突变或获得新的基因，作用方式耐药细菌的耐药基因来源于基因突

22、变或获得新的基因，作用方式为接合、转导或转化。可发生于染色体为接合、转导或转化。可发生于染色体DNADNA、质粒、转座子等结、质粒、转座子等结构基因，也可发生于某些调节基因。获得耐药性大多由质粒介导，构基因，也可发生于某些调节基因。获得耐药性大多由质粒介导，但也有染色体介导，如金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药。耐药基但也有染色体介导，如金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药。耐药基因在质粒、转座子和整合子等可移动的遗传元件介导下，进行传因在质粒、转座子和整合子等可移动的遗传元件介导下，进行传播。播。 上一页下一页返回返回第十九页，讲稿共四十一页哦细菌的耐药性细菌的耐药性天然耐药性天然耐药性与抗菌药物无关，是

23、细菌固有的，在某种抗菌药物发现或与抗菌药物无关，是细菌固有的，在某种抗菌药物发现或产生之前所分离的细菌已对该药已具有耐药性。产生之前所分离的细菌已对该药已具有耐药性。获得性耐药获得性耐药A A 染色体介导的耐药染色体介导的耐药 突变突变B B 质粒介导的耐药质粒介导的耐药 转导、转化、接合、易位转导、转化、接合、易位上一页下一页返回返回第二十页，讲稿共四十一页哦细菌耐药性细菌耐药性 染色体染色体 染色体耐药性染色体耐药性 - - 稳定稳定 - - 垂直传播垂直传播 - - 无水平传播无水平传播 ( (耐药性不会从一种细菌传给另一种细菌耐药性不会从一种细菌传给另一种细菌) ) 上一页下一页返回返

24、回第二十一页，讲稿共四十一页哦细菌耐药性细菌耐药性 质粒质粒 质粒的耐药性质粒的耐药性 不稳定不稳定, ,由于抗生素的使用选择了耐药质粒由于抗生素的使用选择了耐药质粒 - - 耐药基因由一个细菌传给另一个细菌耐药基因由一个细菌传给另一个细菌, , 甚至是不同的细菌甚至是不同的细菌上一页下一页返回返回第二十二页，讲稿共四十一页哦细菌产生耐药的因素细菌产生耐药的因素人的行为使微生物人的行为使微生物 适应生存，产生新的防御力适应生存，产生新的防御力 抗菌药物是医院中各类药物使用范围最广；使用频度最高；使抗菌药物是医院中各类药物使用范围最广；使用频度最高；使用量最大的药物用量最大的药物抗菌药物的大量使

25、用和不合理使用使微生物产生耐药性抗菌药物的大量使用和不合理使用使微生物产生耐药性多重耐药菌在全世界播散，使抗微生物化疗失去效力，以多重耐药菌在全世界播散，使抗微生物化疗失去效力，以致我们的治疗可能又回到了抗菌药物诞生之前的时代致我们的治疗可能又回到了抗菌药物诞生之前的时代上一页下一页返回返回第二十三页，讲稿共四十一页哦自然状态下，只占极少数（自然状态下，只占极少数（1010-5-51010-9-9）的耐药菌（株）难以与占压）的耐药菌（株）难以与占压倒决大多数的敏感菌（株）竞争：微生态定植位点的竞争、营养倒决大多数的敏感菌（株）竞争：微生态定植位点的竞争、营养物质的竞争及代谢产物的抑制等物质的竞

26、争及代谢产物的抑制等耐药突变株在所有 当细菌增殖时耐 由于敏感菌被消除细菌群体中均存在 药菌的比例恒定 耐药菌存活增殖抗菌药物选择性压力选择性压力上一页下一页返回返回第二十四页，讲稿共四十一页哦细菌的耐药性检测细菌的耐药性检测抗生素的耐药机制抗生素的耐药机制 由于细菌的生命周期短、繁殖较快，因此它有很强的适应新环境的能由于细菌的生命周期短、繁殖较快，因此它有很强的适应新环境的能力，接触抗生素时能形成耐药。常见的细菌对抗生素的耐药机制主要力，接触抗生素时能形成耐药。常见的细菌对抗生素的耐药机制主要有四种有四种 ：（一）膜通透性的降低（一）膜通透性的降低（二）改变作用靶位（二）改变作用靶位（三）分

27、泌各种酶（三）分泌各种酶（四）主动外排（四）主动外排返回返回上一页上一页下一页下一页上一页下一页返回返回第二十五页，讲稿共四十一页哦细菌的耐药机制细菌的耐药机制上一页下一页返回返回第二十六页，讲稿共四十一页哦细菌的耐药性检测细菌的耐药性检测（一）合理使用抗菌药物（一）合理使用抗菌药物 1. 1.制定抗生素用药常规，供临床选用抗菌药物参考。制定抗生素用药常规，供临床选用抗菌药物参考。 2. 2.严格根据适应证选用药物。严格根据适应证选用药物。 3. 3.病人用药前应尽可能进行病原学检测，并进行药敏试验，作为调整病人用药前应尽可能进行病原学检测，并进行药敏试验，作为调整 用药的参考。用药的参考。

28、4. 4.根据根据PK/PDPK/PD理论，制定合理的用药方案。理论，制定合理的用药方案。（二）严格执行消毒隔离制度，对耐药菌感染的患者应予隔离，防止耐药菌的交叉感（二）严格执行消毒隔离制度，对耐药菌感染的患者应予隔离，防止耐药菌的交叉感染。染。（三）加强药政管理（三）加强药政管理 1. 1.加强细菌耐药性的检测，建立细菌耐药监测网，掌握本地区、本单加强细菌耐药性的检测，建立细菌耐药监测网，掌握本地区、本单 位重要致病菌和抗菌药物的耐药性变迁资料，及时为临床提供信息。位重要致病菌和抗菌药物的耐药性变迁资料，及时为临床提供信息。 2. 2.必须规定抗菌药物凭处方供应。必须规定抗菌药物凭处方供应。

29、 3. 3.畜牧业应尽量避免供临床使用的抗菌药物作为动物生长促进剂或治疗，畜牧业应尽量避免供临床使用的抗菌药物作为动物生长促进剂或治疗， 以避免对医用抗菌药物产生耐药性。以避免对医用抗菌药物产生耐药性。（四）研发新抗菌药物（四）研发新抗菌药物上一页下一页返回返回第二十七页，讲稿共四十一页哦细菌的耐药性检测细菌的耐药性检测抗生素敏感试验抗生素敏感试验最小抑菌浓度（最小抑菌浓度（MIC minimal inhibitory concentrationMIC minimal inhibitory concentration）: :能能够抑制够抑制99.9%99.9%细菌生长的最小抗生素浓度。细菌生长

30、的最小抗生素浓度。最小杀菌浓度（最小杀菌浓度（MBC minimal bactericidal concentrationMBC minimal bactericidal concentration）能）能够杀死够杀死99.9%99.9%的细菌的最小抗生素浓度。的细菌的最小抗生素浓度。稀释法稀释法纸片扩散法纸片扩散法上一页下一页返回返回第二十八页，讲稿共四十一页哦Broth dilution testTube dilution test for determining the minimum inhibitory concentration (MIC).上一页下一页返回返回第二十九页，讲稿共四

31、十一页哦Disk diffusion test上一页下一页返回返回第三十页，讲稿共四十一页哦细菌的耐药性检测细菌的耐药性检测临床常见的耐药菌株临床常见的耐药菌株耐甲氧西林的葡萄球菌（耐甲氧西林的葡萄球菌（MRSMRS）耐青霉素的肺炎链球菌耐青霉素的肺炎链球菌耐万古霉素的肠球菌耐万古霉素的肠球菌耐万古霉素的金黄色葡萄球菌耐万古霉素的金黄色葡萄球菌产产ESBLsESBLs的革兰氏阴性杆菌的革兰氏阴性杆菌高产高产AmpCAmpC酶的革兰氏阴性杆菌酶的革兰氏阴性杆菌泛耐药的铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌泛耐药的铜绿假单胞菌及鲍曼不动杆菌产产NDM-1NDM-1的超级细菌的超级细菌上一页下一页返回返回第三十

32、一页，讲稿共四十一页哦侵袭性真菌病的实验诊断侵袭性真菌病的实验诊断真菌感染的类型真菌感染的类型 自然界存在的真菌超过一百万种，但仅有自然界存在的真菌超过一百万种，但仅有400400种真菌能导致人类、种真菌能导致人类、动物或植物患病。虽然真菌在环境中普遍存在，并且是构成动物或植物患病。虽然真菌在环境中普遍存在，并且是构成正常人类微生物菌群的一部分，但是由于免疫系统的防御作正常人类微生物菌群的一部分，但是由于免疫系统的防御作用，真菌在健康人群中极少导致疾病。根据真菌病的感染部用，真菌在健康人群中极少导致疾病。根据真菌病的感染部位可以分为以下几类：位可以分为以下几类：浅表真菌病浅表真菌病皮下真菌病皮

33、下真菌病全身性或侵袭性真菌感染全身性或侵袭性真菌感染上一页下一页返回返回第三十二页，讲稿共四十一页哦侵袭性真菌病的实验诊断侵袭性真菌病的实验诊断（一）长期应用广谱抗生素。（一）长期应用广谱抗生素。（二）免疫抑制性治疗：免疫抑制剂、糖皮质激素、恶性肿瘤（二）免疫抑制性治疗：免疫抑制剂、糖皮质激素、恶性肿瘤 患者、器官移植患者、化疗、放疗。患者、器官移植患者、化疗、放疗。（三）免疫抑制性疾病：中性粒细胞减少、艾滋病。（三）免疫抑制性疾病：中性粒细胞减少、艾滋病。（四）体内留置导管：中心静脉插管、肠外静脉营养、气管插（四）体内留置导管：中心静脉插管、肠外静脉营养、气管插 管、放置尿管、机械通气管、放

34、置尿管、机械通气（五）免疫功能低下的患者：糖尿病、新生儿、肾功能衰竭、（五）免疫功能低下的患者：糖尿病、新生儿、肾功能衰竭、 血液透析、营养不良。血液透析、营养不良。上一页下一页返回返回第三十三页，讲稿共四十一页哦侵袭性真菌病的实验诊断侵袭性真菌病的实验诊断侵袭性真菌感染的流行病学侵袭性真菌感染的流行病学（一）念珠菌感染（一）念珠菌感染（二）曲霉菌感染（二）曲霉菌感染（三）毛霉菌感染（三）毛霉菌感染（四）隐球菌感染（四）隐球菌感染（五）组织胞浆菌感染（五）组织胞浆菌感染上一页下一页返回返回第三十四页，讲稿共四十一页哦侵袭性真菌病的实验诊断侵袭性真菌病的实验诊断侵袭性真菌病临床诊断新进展侵袭性真

35、菌病临床诊断新进展 IFI IFI的诊断由宿主因素、临床特征、组织病理学和真菌学检查四方面的诊断由宿主因素、临床特征、组织病理学和真菌学检查四方面构成，按国外指南分为确诊、临床诊断及拟诊三个层次。其中确诊构成，按国外指南分为确诊、临床诊断及拟诊三个层次。其中确诊主要依据组织病理学或血液、胸腔积液等的真菌培养阳性为主要依主要依据组织病理学或血液、胸腔积液等的真菌培养阳性为主要依据。据。1.1.确诊确诊IFIIFI：组织学证据。：组织学证据。2.2.临床诊断临床诊断IFIIFI：符合：符合1 1项宿主因素、项宿主因素、1 1项主要临床表现或项主要临床表现或2 2项次要临项次要临床表现及床表现及1

36、1项微生物学证据。项微生物学证据。3.3.拟诊拟诊IFIIFI：1 1项宿主因素及项宿主因素及1 1项微生物学标准或项微生物学标准或2 2项次要临床标准。项次要临床标准。上一页下一页返回返回第三十五页，讲稿共四十一页哦真菌培养：仍然是确诊的金标准。真菌培养：仍然是确诊的金标准。 直接镜检：墨汁染色及真菌涂片检查。直接镜检：墨汁染色及真菌涂片检查。 血清学诊断方法：是应用免疫方法检测血清或其它体液中真菌细血清学诊断方法：是应用免疫方法检测血清或其它体液中真菌细胞壁和胞质的成分。由于胞壁和胞质的成分。由于IFIIFI多继发于严重免疫受损患者，往多继发于严重免疫受损患者，往往缺乏可检测到的抗体，所以

37、检测真菌抗原成为目前实验往缺乏可检测到的抗体，所以检测真菌抗原成为目前实验室诊断的发展方向。室诊断的发展方向。 1 1）GMGM试验试验 2 2）G G试验试验上一页下一页返回返回第三十六页，讲稿共四十一页哦GMGM试验试验 GM GM是曲霉菌细胞壁的成分，最初是从感染动物模型和侵袭性曲霉病是曲霉菌细胞壁的成分，最初是从感染动物模型和侵袭性曲霉病患者血清中发现。当曲霉感染时，血液及体液（尿液、脑脊液、腹水、患者血清中发现。当曲霉感染时，血液及体液（尿液、脑脊液、腹水、胸水）中会显著增高。在感染早期血清中就能够检测出胸水）中会显著增高。在感染早期血清中就能够检测出GMGM，而且常常早，而且常常早

38、于临床症状和影像学特征出现，研究显示有于临床症状和影像学特征出现，研究显示有2/32/3的患者在其它方法诊断的患者在其它方法诊断侵袭性曲霉病前侵袭性曲霉病前6 61414天即可检测到天即可检测到GMGM，连续动态监测（每周，连续动态监测（每周2 2次）对高次）对高危患者具有早期诊断价值。危患者具有早期诊断价值。 GM GM试验的试验的CutoffCutoff值为值为0.50.5时敏感性增高，有利于早期诊断，但是特时敏感性增高，有利于早期诊断，但是特异性相对较差，有可能出现假阳性，其原因主要是一些抗原物质与单克异性相对较差，有可能出现假阳性，其原因主要是一些抗原物质与单克隆抗体产生交叉反应所致。

39、例如：隆抗体产生交叉反应所致。例如：1 1） 哌拉西林哌拉西林/ /他唑巴坦的应用。他唑巴坦的应用。2 2） 胃肠黏膜损伤时谷类食物中的胃肠黏膜损伤时谷类食物中的GMGM抗原通过肠道入血，胃肠外营养时抗原通过肠道入血，胃肠外营养时 营养液中的某些成分也会与营养液中的某些成分也会与GMGM产生交叉反应。产生交叉反应。3 3） 母乳或配方食品中双歧杆菌与母乳或配方食品中双歧杆菌与GMGM有交叉反应，因此儿童和新生儿假有交叉反应，因此儿童和新生儿假 阳性高达阳性高达83%83%。4) 4) 一些真菌，如酵母菌、青霉菌、组织胞浆菌也能与一些真菌，如酵母菌、青霉菌、组织胞浆菌也能与GMGM产生交叉。产生

40、交叉。上一页下一页返回返回第三十七页，讲稿共四十一页哦G G试验试验 1,3 1,3 -D-D葡聚糖是酵母和丝状真菌细胞壁的多聚糖成分，葡聚糖是酵母和丝状真菌细胞壁的多聚糖成分，原核生物、病毒和人体细胞都不存在这种多聚糖，因此原核生物、病毒和人体细胞都不存在这种多聚糖，因此BGBG作作为真菌抗原具有较高的特异性。当真菌进入人体血液或深部为真菌抗原具有较高的特异性。当真菌进入人体血液或深部组织后，经中性粒细胞及吞噬细胞的处理后，可释放出组织后，经中性粒细胞及吞噬细胞的处理后，可释放出BGBG进进入血液及其它体液，当真菌在体内含量减少时，机体免疫可入血液及其它体液，当真菌在体内含量减少时，机体免疫

41、可迅速清除迅速清除BGBG。在浅部真菌感染中，。在浅部真菌感染中，BGBG未被释放出来，故在体未被释放出来，故在体液中的量不增高。因此，它在血液及无菌体液中异常增高可液中的量不增高。因此，它在血液及无菌体液中异常增高可以视为的以视为的IFIIFI的标志。的标志。上一页下一页返回返回第三十八页，讲稿共四十一页哦G G试验试验 多项研究表明，多项研究表明，BGBG在在IFIIFI临床表现出现之前就已经高于正常临床表现出现之前就已经高于正常值，被认为是早期诊断无创检测手段之一。值，被认为是早期诊断无创检测手段之一。G G实验阳性对诊断真实验阳性对诊断真菌感染并无特异性，仍应进行其它确证实验和真菌鉴定

42、。菌感染并无特异性，仍应进行其它确证实验和真菌鉴定。 由于某些物质中存在由于某些物质中存在BGBG类似物，可造成假阳性结果，因此类似物，可造成假阳性结果，因此G G试验在用于试验在用于IFIIFI诊断时必须注意排除假阳性的因素。例如：诊断时必须注意排除假阳性的因素。例如：1).1).血液透析使用的纤维滤膜。血液透析使用的纤维滤膜。2).2).手术过程中使用的纱布或棉球。手术过程中使用的纱布或棉球。3).3).真菌为原料制成的抗生素。真菌为原料制成的抗生素。4).4).抗肿瘤药物中蘑菇聚糖、抗肿瘤药物中蘑菇聚糖、X X多聚糖成分。多聚糖成分。5).5).食物中的食物中的BGBG通过受损胃肠黏膜入

43、血。通过受损胃肠黏膜入血。上一页下一页返回返回第三十九页，讲稿共四十一页哦3.3.分子生物学诊断方法分子生物学诊断方法 目前随着分子生物学技术的发展，目前随着分子生物学技术的发展，IFIIFI的实验诊断又有了的实验诊断又有了新的进展。新的进展。PCRPCR、分子探针、限制性酶切片段长度多态性分、分子探针、限制性酶切片段长度多态性分析（析（RFLPRFLP）、）、DNADNA指纹图谱、随机扩增指纹图谱、随机扩增DNADNA多态性多态性(RAPD)(RAPD)等方等方法，均可用于法，均可用于IFIIFI诊断，形成了以诊断，形成了以PCRPCR技术为基础的一系列分技术为基础的一系列分子诊断方法。采用

44、实时定量子诊断方法。采用实时定量PCRPCR检测血液中曲霉菌检测血液中曲霉菌DNADNA，敏感，敏感性为性为91.6%91.6%、特异性为、特异性为94.4%94.4%。阳性和阴性预测值分别为。阳性和阴性预测值分别为73.3%73.3%、98.5%98.5%。应用实时定量。应用实时定量PCRPCR结合结合GMGM试验可将敏感性提试验可将敏感性提高至高至100%100%，阳性预告值升至，阳性预告值升至75.1%75.1%。虽然有较高的敏感性和。虽然有较高的敏感性和特异性，但操作过程易受污染，且缺乏标准化，其临床价值特异性，但操作过程易受污染，且缺乏标准化，其临床价值还有待进一步研究。还有待进一步研究。上一页下一页返回返回第四十页，讲稿共四十一页哦感谢大家观看第四十一页，讲稿共四十一页哦