干细胞基本与临床应用基本研究.ppt

《干细胞基本与临床应用基本研究.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《干细胞基本与临床应用基本研究.ppt（54页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。

1、Tuesday, October 27, 2020,干细胞基础与应用基础研究,广西医科大学研究生选修课课程 组胚教研室 陈维平,内容安排 一、理论课 1、细胞体外培养基本技术和方法讨论 2、干细胞的分离与培养 3、胚胎干细胞 4、成体（组织）干细胞 5、讨论交流 二、实验课 1、干细胞的分离、培养与观察 三、考核 内容：设计一份完整的“XX干细胞培养的基本方法（流程）” 时间：2014年1月,干细胞基础与应用基础研究,干细胞基础与应用基础研究（一） 细胞体外培养基本技术和策略讨论,（一）基本概念 1,体外培养 (In vitro culture) 对象：细胞（特定条件下、单一细胞成份） 组织

2、器官 胚胎（全胚培养 Holo-embryo culture） 条件：体内生存环境的模拟 （天然优化环境人工环境） 目的：1、建立活体结构成分在体外生存、生长的 适宜环境 2、应用,（一）基本概念 2,体内培养(In vivo culture) 方式：移植（Transplantation） 条件：异体相似环境 优点：最大限度模拟自然生长环境 目的：分化研究、临床治疗、特殊 目的（如珍贵细胞株污染的处理）,（二）基本条件（模拟）,营养条件的模拟 水： 无机盐： 葡萄糖： 维生素： 氨基酸： 细胞因子(Cytokine) ：未知因素 理化条件的模拟 温度： 液体渗透压： 氧与酸碱度： 细胞之间的相

3、互关系： 培养基的选择,一、水,细胞及机体内环境溶解或分散状态离子和/或分子的水溶液（化学基础） 水的重要性质： 惰性大多数物质溶于水而不发生化学反应。 热稳定性和导热性。 表面张力等等：表面张力是维持细胞形态的重要条件。,二、无机盐,存在形式：离子状态为主 结合（蛋白质或脂质） 形成与维持培养液的晶体渗透压 对细胞功能活动的支持作用 细胞和组织类型不同，对无机盐的要求也不同 实验目的不同，对培养基中无机盐的要求也不同 实验步骤的目的不同，对培养基中无机盐的要求也不同,三、理化条件 1,温度：3537 细胞对低温耐受能力强过高温 1、应该对实验有全过程的考虑 2、高温的结果是一样的 3、低温条

4、件下细胞活动减缓至停止 4、对低温的耐受能力与细胞类型、个体年龄等因素有关 5、低温的危害与细胞内外冰晶形成的不均衡有关，故降温应该是缓慢的，避免冰晶形成；复温应该是快速的。 液体渗透压：正常血浆 280310 mOsm/kg； （主要由晶体渗透压构成 胶体渗透压1.5 mOsm/kg） 酸碱度： 7.36 7.44 耐受范围 6.08.0；,三、理化条件 2,细胞之间的相互关系： 1、从组织水平的认识 细胞是结构和功能的基本单位，而组织是细胞的存在形式。 2、从细胞水平的认识 a.直接接触型；膜表面分子结合 b.直接联系型；胞间间隙连接 c.间接联系型；生物因子传递,三、理化条件 3,生长基

5、质（Ground substance）： 大多数机体内的细胞不是生活在液态环境中的，体外培养环境下表现为贴壁、附壁生长，培养器皿的表面不适合细胞的这一特性，必需包被某些物质，以帮助细胞贴壁、附壁生长。 1、多聚赖氨酸(Polylysine) 0.05 mg/ml 2、纤维连接蛋白(Fibronectin) 3、胶原 （如 鼠尾胶） 4、层粘连蛋白(Laminin) 510g/ml,四、培养基的选择 1,一、基本概念 培养基(Nutrient medium)：多指商品，固态或粉剂，未 经溶剂溶解的状态。 培养液(Culture solution medium)：用溶剂溶解后的溶 液，一般添加有血

6、清、抗生素、活性因子等等。 条件培养液(Conditioned medium)：经过某些细胞培养， 含有特定的（已知或未知）细胞分泌物的培养液。,参考文献只能提供基本的参考，除重复性实验外，具体的实验方案应该从多个角度来综合考虑，必要时还应该做探索性实验。,二、常用类型 天然培养基：血清、胚胎渗出液、水解蛋白 合成培养基：RPMI1640、Eagle MEM系列（BME、DMEM、IMEM、MEM）、HamF12。 无血清培养基：化学成分确定的培养基，对实验目的和细胞类型的针对性强。 1、基础培养液：DMEM HamF12 = 1 1 2、附加成分： 根据实验目的、细胞类型等因素设定。如B27

7、、N-2，针对神经元；G-5，针对神经胶质细胞,四、培养基的选择 2,（三）基本步骤,取材 ：目的明确、取材准确、避免过多的损失和损伤。 分离: 制作细胞悬液。 纯化： 提高目的细胞富集度。 原代培养：目的细胞在体外条件下的生长、扩增。 传代培养：进一步扩增、纯化。 鉴定：定质、定量。 冻存与复苏：保存,连续传代培养,一、取材 1,（一）、实验的目的： 直接影响实验各环节，如培养基的选择、培养时间的长短等等。,取材是整个实验的重要步骤之一，决定了后续实验步骤的效率。,一、取材 2,（二）、细胞及其所在组织的性质： 帮助确定分离的方法、消化酶的选择与使用等等。 （三）、操作流程的优化： 应该充分

8、考虑保持细胞活力：操作时间短、细胞损失和损伤少。,一、取材 3,细胞悬液(Cell suspension)： 单个细胞存在于溶液（培养液、平衡液、缓冲液等）。 一般程序：、解剖充分暴露、洗涤、剔除多余组 织。 、分割1 mm 3植块植块培养 、分离（散）细胞机械解离、酶消化、 鳌合剂解离。 、筛网过滤 、低速离心 500800 rm510 min 8001000 rm 510 min 、计数、调节细胞密度10 5个ml,二、分离与纯化 1,分离与纯化在概念上没有明确的区别，也不是一个单一的、独立的步骤，往往贯穿在整个细胞培养的过程之中。 分离与纯化是衡量细胞培养成功与否的重要标志；也是建立细胞

9、系（细胞株）的前提。 1、细胞分离（Separation）：从组织材料、细胞悬液中获取目的细胞。 2、细胞纯化（Purification）：从异质性的混合物中获得单一类型细胞。 3、富集（Enrichment）：分离纯化后，目的细胞数量所达到的比例。,二、分离与纯化 2,（一）基本原理 1、根据细胞的物理特性，如密度、电荷等。 2、根据细胞的生物学特性，如贴壁紧密程度、贴壁快慢、特异性表面标志等。 3、根据其它细胞特性 （二）基本方法 1、机械分离与酶学分离 2、基于物理性状的分离纯化技术、速度沉降法 3、根据细胞表面电荷的分离方法 4、利用细胞表面标志的分离方法 5、根据其它细胞特性的分离方

10、法,机械分离与酶学分离1,1、取材过程中的分离 尽可能剔除其它结构、组织。 充分冲洗，必要时可考虑添加抗生素。 2、筛网过滤 根据组织、细胞的类型，细胞大小来选择筛网的材 质、孔径大小 3、酶学分离 对同一种组织，采用不同的酶消化，细胞富集的类 型也不同。 举例：对皮肤消化 胰蛋白酶 ？ 胶原酶 ？,机械分离与酶学分离2,4、培养过程中的选择性 体外培养过程中的自然法则： a、富集多、活力强、增殖能力强的细胞类型会表现出优势生长。 b、细胞集落可以出现区域性分布。 方法： 机械性刮除、选择性消化 目的： 清除 或 收集,基于物理性状的分离纯化技术 1,优点：无需对细胞进行复杂的（化学、生物 学

11、等）处理，避免了细胞发生变化， 对细胞的活力影响较少。 关键：1、密度梯度形成介质的选择。 2、密度梯度的配置。,也称为密度梯度离心（Density gradient centrifugation）技术,沉降速度=离心力 细胞体积 细胞密度和介质密度差 / 介质黏度,介质选择的原则： 1、密度范围大 包括所需要的密度。 2、溶液的黏度低 较小离心力和较短离心 时间可达 到分离效果 3、易于测定其密度（浓度）。 4、不损伤细胞、不改变细胞生物学特性。 5、离心分离后易于除去。 6、不妨碍、不影响后续实验研究的目的。,基于物理性状的分离纯化技术 2,基于物理形状的分离纯化技术 3常用介质,1、血清

12、白蛋白 早期常用，但黏度太高。 2、聚蔗糖（Polysucrose） 即Ficoll，实验室常见，缺点是：黏度、渗透毒性随浓度增加而增加。使用时注意避免。 3、泛影酸盐 常用的“淋巴细胞分离液（密度：1.0770.001g/ml）” 就是泛影酸盐和Ficoll配制而成，以避免Ficoll黏度、渗 透毒性随浓度增加而增加的缺点。,基于物理形状的分离纯化技术 4常用介质,4、硅胶颗粒 Percoll （密度：1.130.005g/ml） 优点：（1）稳定性好。可长期保存。 （2）密度稀释范围大，包括了大多数细胞密度。 （3）溶液产生的渗透压小，全密度范围内维持 等张。 （4）黏度低，较小离心力和较

13、短离心时间可达 到分离效果。 （5）易于洗涤清除，对细胞无毒性。 （6）高速离心时可形成连续密度剃度。 （10000 r/min） （7）用量少，经济。,基于物理形状的分离纯化技术 5常用方法,1、一步密度梯度离心法 高密度介质、低速离心 依据细胞的密度和体积: 密度大于介质的在介质之下；密度小于介质的在介质之上 体积大的沉降速度快；体积小的沉降速度慢。 注意：对不同物种的细胞，分离介质的密度稍有不同。,基于物理形状的分离纯化技术 6常用方法,2、等密度梯度离心法 依据细胞的密度 a、连续密度梯度： 密度逐渐增高的介质体系 c = m 时，沉降速度为零，细胞停留在密度相同的介质区带内。 b、不

14、连续密度梯度： 密度递减、顺序、分层分布介质体系， 时细胞停留在 m 1 c m2的界面上。,基于物理形状的分离纯化技术 7常用方法,3、速度沉降法 依据细胞的密度和体积，但以体积为主要因素。 a、单位重力速度沉降法： 单位重力作用，低密度介质（BSA + 0.01 mol/L PBS，梯度：1.00991.0123 g/ml） 优点：细胞回收率高、重复性好、分离量大。 缺点：时间太长（数个小时！），细胞活力易 受影响。 b、低速离心速度沉降法： 5%20% Ficoll，100 g，25 min 的条件下。,根据其它细胞特性的分离方法1,一、反复植块培养法 原理：不同的细胞从植块中迁移出来的

15、时间、速度不同。 优点：细胞在取材时受损伤少 缺点：纯化周期长，细胞纯度低，细胞产量低。,植块,雪旺细胞,成纤维细胞,成纤维细胞,第一周,第二周,第三周,根据其它细胞特性的分离方法2,二、有丝分裂抑制剂法 原理：有丝分裂后细胞（不再分裂增殖的细胞，如神经细胞）不受有丝分裂抑制剂的影响，可分裂细胞明显受其抑制 逐渐消亡。 常用抑制剂： 阿糖胞苷（Ara-C）、氟尿嘧啶（FU）,三、原代培养 1,原代培养的概念： 1、是指“初次培养”的含义，没有培养物的分割。 2、“代”只是分割的记录与记数形式，与细胞分裂增殖的“代”不同。 3、植块培养也可以分割，故也可以进行传代培养 4、更换培养液、更换培养器

16、皿，仍是原代培养。,三、原代培养 2,基本目的： 1、维持目的细胞在体外条件下生存一段时间,适应体外培养的新环境。 2、更接近原来的组织形式，有利于目的细胞适应体外培养的新环境。 3、使目的细胞在体外条件下稳定生长、扩增，形成优势群体。,三、原代培养 3 植块培养,植块培养目的： 1、观察组织生长行为及其规律。 2、获得向外迁移的细胞（应该有相应的松解、离散措施）。 植块培养的优点： 保持了良好的3D组织结构、维持了细胞之间的相互作用，细胞易于成活和生长。 植块培养的缺陷： 植块中央的物质交换受局限。适宜大小！1mm3 植块培养的关键： 1、植块的贴壁、固定。 2、培养液的添加。 3、如果是为

17、了获得细胞，要注意植块的适时移出。,三、原代培养 4 细胞培养,优点：能在特定条件下，获得单一类型的细 胞并进行相关的研究。 关键：使细胞尽快进入分裂、增殖的生长状态。 1、促进细胞贴壁 2、适宜的细胞接种密度。 105 个/ml是常用的标准，但还应该考虑细胞类型、生长能力、活力。 干细胞的培养会选择更低密度？,三、原代培养 5 培养空间,3、培养空间 构建适宜的培养体系： 培养体系由两大部分组成：液相和气相 调整培养空间的目的：保证细胞的供O2量 相关参数： （1）、液相气相 = 1 10 （体积） （2）、液相高度：25 mm,O2,O2,O2,四、传代培养 1,传代的目的： 1、避免接触

18、性抑制，保持细胞稳定地生长。 2、进一步纯化细胞类型。 （1）不同的传代处理方式 （2）不同的处理强度 传代的指标： 1、体细胞：集落占据80%90%的瓶底面积。 2、干细胞：根据目的细胞集落的生长状况，有必要时。,四、传代培养 2,传代的基本步骤： 1、换液 一些技术手册要求传代前一天换液，主要 是改善细胞状态，增强适应能力。 2、解离细胞 目的细胞的生物学特性决定解离细胞方法 酶消化法 机械震荡法 3、再次接种 传代的关键： 1、适当的时间 2、适当的方法 3、适当的细胞密度,五、“二倍体细胞”的问题,细胞性状的稳定，是体外培养条件下，研究体内细胞生物学性状的前提。 问题：在较长时间和不适

19、宜条件下的体外培养，由于细胞融合等已知和未知的原因，细胞的染色体倍数会发生变化，成为多倍体细胞。,营养条件,理化条件,生活环境,遗传物质基础,传代,六、体外培养细胞的生长与观察 1,在体外培养条件下，细胞的生长行为会有相应的变化，对其研究的目的是： 1、了解细胞的生长行为的基本规律； 2、区分质变与量变，判断目的细胞的价值和意义。 A、 体外培养细胞的生长方式： 1、黏附型 2、悬浮型,六、体外培养细胞的生长与观察 2,黏附型细胞 黏附是体外培养条件下恢复“组织形式”的倾向 1、细胞与细胞之间的接触 2、细胞与细胞外基质结合 体内、体外的差异：体内是立体三维的结构；而体外只是二维的空间，大多数

20、情况下只有一个附着面。故细胞的外形会有变化。,六、体外培养细胞的生长与观察 3,黏附型细胞的类型： 1、上皮型细胞（上皮样细胞）： 细胞镶嵌状紧密排列，呈“铺路石样”；起源于内胚层、外胚层的细胞多呈此型。,六、体外培养细胞的生长与观察 4,2、成纤维细胞（成纤维细胞样）： 细胞梭形、多角形、胞体铺展，细胞间隙较大，细胞排列疏松；细胞可呈放射状、螺旋状排列。起源于中胚层的细胞多成此型。,六、体外培养细胞的生长与观察 5,3、多形型细胞 细胞有较长的突起、胞体多角形，可分为胞体部和突起部，细胞间距大。 常见类型：神经组织细胞。,六、体外培养细胞的生长与观察 6,4、游走型细胞： 细胞分散、不易形成

21、集落； 可有胞质突起，细胞变形、游走活跃。 见于单核吞噬细胞系统、肿瘤细胞。,六、体外培养细胞的生长与观察 7,铺展：,球形 原饼形 细胞铺展 极性细胞,铺展的程度与细胞DNA合成、细胞的生长有密切关系。,内质,外质,六、体外培养细胞的生长与观察 9,B、每一代细胞的生长过程： 1、潜伏期： 2、指数生长期： 3、停滞期：,1,2,3,接种,细胞数量,培养时间,关于“隔天换液”的辨析： 细胞周期（cell cycle)： 是指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，分为间期与分裂期两个阶段,根据细胞的分裂能力可把它们分为三类： 增殖细胞群，如造血干细胞，表皮与胃肠粘膜上皮的干细胞

22、。这类细胞始终保持活跃的分裂能力，连续进入细胞周期循环； 不再增殖细胞群，如成熟的红细胞、神经细胞、心肌细胞等高度分化的细胞，它们丧失了分裂能力，又称终末细胞（end cell）； 暂不增殖细胞群，如肝细胞、肾小管上皮细胞、甲状腺滤泡上皮细胞。它们是分化的，并执行特定功能的细胞，在通常情况下处于G0期，故又称 G0期细胞。在某种刺激下，这些细胞重新进入细胞周期。如肝部分切除术后，剩余的肝细胞迅速分裂。,六、体外培养细胞的生长与观察 8,C、细胞系的生长过程 1、原代培养期 2、传代培养期 3、衰退期,1,2,3,接种,细胞数量,培养时间,转化,传代,老化,死亡,细胞株（系）的基本概念 1,细胞

23、系：从原代培养经传代培养后得到的细胞群体（适应后的细胞群体）。 1、可较长期的传代 2、细胞类型不均一 3、以某一种明确的细胞类型为主（主类 细胞）,细胞株（系）的基本概念 2,细胞株：经由选择和/或克隆化培养技术，从细胞系中获得的，细胞类型较为单一的细胞群体。 1、细胞的遗传、生化性质相同， 2、细胞带有共同的特异性标记 以上两点，在后续培养过程中必须持续保持。如遗传形状发生变异，则形成“亚株”。,细胞株（系）的基本概念 3,有限细胞系（株）：体外仅能持续传若干代，多 为二倍体细胞。 连续细胞系（株）：体外具无限增殖能力，多为 异倍体细胞。 永生性（不死性）：保持接触抑制，无致瘤性。 恶性转化细胞系： 有致瘤性。,细胞克隆,概念：将单一细胞分离、单独培养，并使其生 长、增殖为一个新的细胞群体。 基本方法： 1、稀释铺板法： 2、饲养层克隆法： 3、生长基质克隆法： a、胶原模板、血纤维蛋白模层板 b、琼脂克隆法 c、琼脂基底加甲基纤维素克隆法,细胞周期与细胞同步化,国内外细胞库,1、ATCC （American Type Culture Collection）： http：/www.atcc.org 2、中国国家专利局 武汉大学生命科学院 3、中国科学院上海细胞所,