植物组织培养教案(38页).doc

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1、-植物组织培养教案-第 36 页重点难点 组织培养的概念、组织培养的类型、特点和应用第一节 组织培养的概念一、组织培养的概念是指通过无菌操作分离植物体的一部分(即外植体explant)，接种到培养基上，在人工控制的条件进行培养，使其生成完整的植株。二、组织培养的特点：取材少 生长周期短 繁殖率高。人工控制条件 管理方便三、培养的研究类型组织培养按培养对象可分为植株培养、器官培养、组织培养、 细胞培养和原生质体培养等：第三节组织培养应用及展望一、快速繁殖种苗 组织培养的快速繁殖，就是应用组织培养和细胞培养技术，快速繁衍珍稀濒危植物。二、无病毒苗的培养 三、在育种上的应用，。四、工厂化育苗参考文献

2、1、颜昌敬编著 植物组织培养手册 1990.1 上海科技出版社， 2、朱建华主编 植物组织培养实用技术 2002.1 中国升量出版社 3、梅家训、丁习武主编 组培快繁技术及其应用 2003.4 中国农业出版社 4、李浚明编译植物组织培养教程第2版北京：2004.1中国农业大学出版社，单元章节第一章 实验室及培养条件教学目的 基本掌基握组织培养实验室的设计；熟练掌握实验仪器设备使用和培养基用湿热灭菌方法以及无菌操作技术。重点难点组织培养实验室的组成、常用仪使用；培养基用灭菌以及无菌操作技术；组织培养的条件。教学方法启发式；讲授；多媒体课件；演示。教学时数2课时。教学内容第一节 实验室及基本操作一

3、、 实验室（一）准备室(repairing room)在准备室内要完成培养基制备、清洗与整理工作。为完成培养基的制备工作，准备室还应配备以下仪器设备：大型工作台、药品柜、普通冰箱、电子分析天平和托盘天平、电蒸馏水器 、磁力搅拌器、电炉或电饭锅、酸度计、高压灭菌锅等。 （二）接种室(transfering room)1、对接种室要求 2、接种室的主要设备及用具（三）培养室(culturing room)培养室是将接种的材料进行培养生长的场所。培养材料放在培养架上培养。培养条件:培养室一般保持在20-27左右，相对湿度以保持在70-80为好，一般需要每天光照10-16h。环境的相对湿度一般要求70

4、-80的相对湿度。（四）炼苗室二、 设备和器材（一）玻璃器皿（二）器械用具 第二节 基本操作一、洗涤（自学）二、灭菌(sterilization)灭菌是指用物理或化学的方法，杀死物体表面和孔隙内的一切微生物或生物体。培养基用湿热灭菌方法三、无菌操作1、在接种前20分钟，打开超净工作台的风机以及紫外灯；2、接种员先洗净双手，在缓冲间换好专用实验服，并换穿托鞋；3、上工作台后，用酒精棉球擦拭双手，特别是指甲处。然后擦拭工作台面； 4、先用酒精棉球擦拭接种工具，再将镊子和剪子从头至尾过火一遍；5、接种时，接种员双手不能离开工作台，不能说话、走动和咳嗽等；6、接种完毕后要清理干净工作台，若连续接种，每

5、5天要大强度灭菌一次。本章小结实验室组成：准备室、无菌操作室、培养室、炼苗室；培养基用湿热灭菌；无菌操作无菌操作的技术程序。自学指导与训练方案讨论：建一个组织培养实验室起码需要用哪些设备和仪器。思考题：1、对接种室有哪些要求？如何对接种室消毒？2、培养室的作用是什么？对培养条件有什么要求？3、简述无菌操作步骤。4、简述培养基用湿热灭菌方法5、用95酒精配成75酒精1000ml,问用95酒精和水各多少ml？参考文献1. 刘庆昌 吴国良 植物细胞组织培养 2005.3 中国农业大学出版社2、李浚明编译植物组织培养教程第2版北京：中国农业大学出版社，2004单元章节第二章 培养基及其配制教学目的掌握

6、培养基的种类和特点；基本掌握培养基的组成成分和适宜的剂量；熟练掌握培养基的制备方法和步骤；初步掌握培养基的筛选方法。重点难点培养基的种类和特点、培养基成分、作用和常用剂量；母液配制过程，利用母液配制工作培养基；培养基的选择。教学方法启发式；讲授；多媒体课件。教学时数4课时教学内容第一节培养基的种类和成分一、培养基的种类目前国际上流行的培养基有几十种， 如：MS培养基、B5培养基、White培养基、N6培养基、KM-8P培养基等二、 培养基的成分 培养基的成分主要可以分水、无机盐、有机物、天然复合物、培养体的支持材料等五大类。1水 大规模生产时可用自来水。但在少量研究上尽量用蒸馏水；2、无机元素

7、 大量元素，有N，P，K，Ca，Mg，S等。微量元素 Fe，B，Mn，Cu，Mo，Co等。3有机化合物(1)碳水化合物 最常用的碳源是蔗糖。 (2)维生素(vitamin)主要有VB1、VD6、Vpp、VC、有时还使用生物素、叶酸、VB2等。 (3)肌醇 又叫环己六醇。 (4)氨基酸 是有机氮源，可直接被细胞吸收利用。培养基中最常用甘氨酸。4植物激素(hormone)在培养基的各成分中植物激素是培养基的关键物质，对植物组织培养起着决定性作用。(1)生长素类(auxin) 在组织培养中，生长素主要被用于诱导愈伤组织形成，诱导根的分化和促进细胞分裂、伸长生长。 IAA(吲哚乙酸)、 NAA(萘乙酸

8、)、IBA(吲哚丁酸)、2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)。 NAA和IBA广泛用于生根，并与细胞分裂素互作促进芽的增殖和生长。生长素配制时可先用少量95酒精助溶。2，4-D可用01molL的NaOH或KOH助溶。(2)GA( 赤霉素)，赤霉素用于打破休眠，促进种子、块茎、鳞茎等提前萌发。赤霉素不耐热，高压灭菌后将有70-100失效。(3)细胞分裂素类(cytokinin)包括6-BA(6-苄基氨基嘌呤)、Kt(kinetin激动素)、n(zeatin玉米素)等。其中Zt活性最强，但非常昂贵，常用的是6-BA。细胞分裂素作用：诱导芽的分化促进侧芽萌发生长，当组织内细胞分裂素生长素的比值高时，诱

9、导愈伤组织或器官分化出不定芽。促进细胞分裂与扩大。抑制根的分化。因此，细胞分裂素多用于诱导不定芽的分化、茎、苗的增殖，而避免在生根培养时使用。5.培养材料的支持物 琼脂(agar) 在固体培养时琼脂是最好的固化剂。琼脂能溶解在热水中，成为溶胶，冷却至40即凝固为固体状凝胶，溶解于90以上的热水。6抗生物质 抗生物质有青霉素、链霉素、庆大霉素等，用量在5-20mgL之间。添加抗生物质可防止菌类污染，7活性炭 可以吸附外植体产生的致死性褐化物；一般为0.1-02。三、培养基的选择（一）单因子试验。各项条件和因素都维持在一般水平上，只变动一个因子，以找出这一因子对试验影响和影响的程度。（二）多因子试

10、验。（三）逐步添加和逐步排除的试验方法（四）广谱试验法第二节、培养基的制备母液的配制和保存称量溶解定容分装标签保存。母液种类成分规定用量(mg/L)扩大倍数称取量(mg)母液定容体积(ml)配1LMS培养基吸取量(ml)大量元素KNO3NH4NO3MgSO4.7H2OKH2PO4CaCI.2H2O1900165037017044020380003300074003400880010050微量元素MnSO4.4H2OZnSO47H2OH3BO3KINa2MoO4.2H2OCuSO4.5H2OCoCI2.6H2O22.38.66.20.830.250.0250.025100223086062083

11、252.52.5100010铁盐Na2-EDTAFeSO4.7H2O37.327.810037302780100010有机物烟酸甘氨酸VBVB肌醇0 5200 10 51005025100525500050010自学指导与训练方案复习思考题：1、培养基的种类及特点有哪些？ 2、培养基一般包括哪些基本成分？如何配制？3、如何选择合适的培养基？4、用于植物组织培养的植物生长调节物质主要有哪两种？它们在组织培养中各起什么作用？作 业： 1、MS培养基配制过程。2、75%乙醇的配制 3、BA和NAA的配制。 自学指导：培养基的选择试验。参考文献1、颜昌敬. 植物组织培养手册.上海：上海科技出版社，19

12、902、谭文澄. 观赏植物组织培养技术.北京：中国林业出版社，20003、李浚明编译植物组织培养教程第2版北京：中国农业大学出版社，2004单元章节第三章 外植体的选择与灭菌方法教学目的熟练掌握组织培养相关的灭菌方法，无菌操作技术和外植体的选择与灭菌的方法步骤，掌握污染原因及采取的对策。 重点难点消毒概念 灭菌方法 无菌操作 污染教学方法启发式；讲授；多媒体课件，教学时数2课时。教学内容一外植体的选择（一）外植体的部位 （二）取材季节 对大多数植物，应在其生长开始的季节。（三）器官的生理特点和发育 幼年组织比老年组织具有较高的行态发生能力。（四）外植体的大小 茎段长0.5cm，叶片面积5mm2

13、。二、外植体的消毒方法（一）常用消毒剂 常用的有0.1%升汞溶液。70-75%酒精。（二）外植体的灭菌方法1、 茎段，茎尖及叶片的消毒 2、 果实和种子的消毒 3、 根及地下部器官的消毒4、花药的消毒植物材料必须经严格的表面灭菌处理，再经无菌操作手续接到培养基上，这一过程叫做接种。接种的植物材料叫做外植体。首先，把材料切割成适当大小，即灭菌容器能放人为宜。置自来水龙头下流水冲洗几分钟至数小时，洗时可加入洗衣粉清洗。第二步要在超净台用70%-75%酒精浸10-30s。第三步是用灭菌剂0.1%升汞处理5-10 min。升汞是由重金属汞离子来达到灭菌的； 第四步用无菌水涮洗4-6次，每次不少于3mi

14、n，以尽量去除残毒。三、污染的原因及对策污染指：组培过程中培养基和培养材料滋生杂菌导致培养失败现象。1、污染的原因 外植体带菌，培养基灭菌不彻底，操作员不遵守操作规程等。（1）细菌污染 在接种后1-2天可发现，菌斑呈粘液状。（2）真菌污染 在接种3天后可发现，污染部分长有不同颜色的霉菌。2、污染的预防措施 （1）将取的枝条用水冲干净后插入自来水中使其抽枝，用新抽的枝作外植体。（2）晴天中午到下午采样（3）培养基加抗生素（4）操作人员严格遵守操作规程接种（5）培养基及其用具灭菌要彻底四、培养条件 大多数植物组织培养 都是在23-27 之间进行，一般采用25土2。光照强度一般为10006000LX

15、。最常用的周期是16h的光照，8h的黑暗。容器内湿度一般100%，环境的相对湿度一般要求70-80的相对湿度。培养基pH值大多在5-6.5左右，一般培养基皆要求5.8。自学指导与训练方案复习思考题：1、灭菌和消毒有何区别？2、常用的灭菌方法有哪几种？3、接种材料如何进行消毒处理？5、组织培养中如何尽量避免出现污染？6、植物组织培养技术主要包括哪些环节？各环节的主要工作内容是什么？训练：1、不同消毒剂消毒剂处理效果试验。 2、 污染情况调查。参考文献1、谭文澄. 观赏植物组织培养技术.北京：中国林业出版社，20002、李浚明编译植物组织培养教程第2版北京：中国农业大学出版社，20043、刘庆昌

16、吴国良 植物细胞组织培养 2005.3 中国农业大学出版社单元章节第四章 植物组织培养的基本原理教学目的在了解组织培养基本原理的基础上，掌握植物细胞的全能性、器官的发生、愈伤组织培养等重点难点植物细胞的全能性、细胞分化、脱分化、 再分化、愈伤组织培养、体细胞胚教学方法启发式；讲授；现场教学。教学时数4课时。教学内容第一节植物细胞的全能性细胞分化一、植物细胞的全能性（totipotent)：植物每个细胞都携带一套完整的基因组（该植物体全部遗传信息），在一定条件下具有发育成完整植物体的潜在能力。二、 细胞分化细胞分化指：导致细胞形成不同结构，引起功能改变或潜在的发育方式改变的过程。（一）细胞分化分

17、为行态结构分化和生理生化分化（二）发育中的植物不存在部分基因组永久关闭情况。即保持潜在全能性，只要条件适合便表现出全能性。（三）在完整植株中，细胞发育途径一旦被决定，通常不易改变，但离体培养通过脱分化可改变。（四）极性与分化关系密切，极性是细胞分化前提，极性是指：细胞（也可指器官、植株）内的一端与另一端在形态结构和生理生化上存在差异现象。（五）生理隔离。（六）细胞分裂对细胞分化有重要作用。（七）激素对细胞分化有重要调节作用。（八）细胞核染色体和DNA变化对细胞分化重要作用。三、组织分化 在细胞分化的基础上，可以分化出各种各样的组织（分生组织、保护组织、机械组织输导组织等）。是形成不定芽和不定根

18、的基础。器官分化主要指根和芽的分化。第二节离体条件下植物器官的发生一、 外植体脱分化（去分化）脱分化（dedifferentiation）：由高度分化的植物组织或器官失去原来结构和功能而恢复分生状态，形成无组织结构的细胞团或愈伤组织的过程。愈伤组织（callus）在人工培养基上由外植体进行细胞分裂，形成一种高度液泡化的呈无定形态的薄壁细胞。再分化（redifferentiation):经脱分化的愈伤组织 在一定的培养条件下长出植株的能力。1、细胞水平再分化：细胞壁变厚、假导管细胞形成、酶水平变化等。形成各种细胞。2、组织水平的再分化；维管组织分化，形成愈伤组织（由高度液泡化的细胞组成）愈伤组织

19、含有拟分生组织或瘤状结构。3、器官细胞水平的再分化（器官发生）：再分化形成各种器官4、植株再生途径器官发生途经就是先诱导获得不定芽或不定根，然后获得再生植株；体细胞胚发生是指由愈伤组织或外植体形成体细胞胚，然后通过体细胞胚而发育成再生植株；原球茎发生是兰花离体培养中特有的植株再生； 愈伤组织发生是由愈伤组织经再分化而发育成再生植株。三、 愈伤组织的培养（一）愈伤组织的形成、生长、保持1、愈伤组织的形成：外植体中已分化的活细胞，在外源激素的诱导下通过脱分化后形成愈伤组织，这一过程被大致划分为三个时期（诱导期、分裂期和形成期）。2、愈伤组织的生长3、愈伤组织继代培养（二）愈伤组织的形态发生方式 从

20、外植体形成器官或无性系的形态发生，有下面两种方式：1、不定芽方式（unfixed bud） 指细胞或愈伤组织培养物，通过形成不定芽再生成植株，这是细胞和组织培养中常见的器官发生方式。2、胚状体方式（somatic embryo） 指由培养细胞诱导分化出的胚胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株第三节植物体细胞胚发生胚状体亦称体细胞胚；指在植物组织培养过成中，由植物体细胞所形成的类似于合子胚的结构。具有根、茎结构，能一次性形成再生植株。胚状体发生：指由培养细胞诱导分化出具胚芽、胚根、胚轴的胚状结构，进而长成完整植株。一、植物体细胞胚状体发生过程（一）体细胞胚状体发生过程由外植体经胚状体形成

21、完整植株可分：五个时期：原胚期、球形胚期、心形胚期 鱼雷形胚期、子叶期（成熟胚）、发育成完整植株（二）胚性和非胚性或愈伤组织生理形态差异1、胚性愈伤组织 （Embryonenic callus）：表面松脆、细胞小，这种小细胞聚集为丛状，被称为EC。DNA、RNA及蛋白质合成活跃，再生力强。2、非胚性愈伤组织：表面粗糙、组织结构疏松、细胞大，大液泡的细胞。（三）体细胞胚发生的基因表达机理二、植物体细胞胚发生途径（一）体细胞胚发生方式： 体细胞胚发生途径：直接途径、间接途径（二）体细胞胚（Somatic embyo）的来源：外植体细胞经脱分化后直接产生体胚，多数起源于单细胞三、植物体细胞胚发生的双

22、极性和生理隔离双极性是指：细胞发育初期，其内含物分布具不均匀性，而形成体细胞后，具有发育成芽端和根端的潜在能力。（一）植物体细胞胚发生的极性（二）植物体细胞胚发生的生理隔离生理隔离：早期的胚性细胞与周围细胞还存在胞间连丝，随着胚性细胞的发育，细胞壁加厚，胞间连丝消失或被堵塞（维管束系统无直接联系），为孤立状态。生理隔离是体细胞胚发生的先决条件。四、体细胞胚胎发生的生理学和生物化学（一）蛋白质和核酸（二） 多胺代谢 （三）糖类、金属离子和微量元素（自学）（四）内源激素1、生长素 2、细胞分裂素 3、赤霉素 4、脱落酸（自学）（五）活性酶（自学）第三节 影响植物离体形态发生的因素一、植物种类和基因

23、型：胡萝卜易诱导体细胞胚，烟草难。二、培养材料的生理状态1、植株发育年龄：幼嫰组织比老态组织具有较高的体形态发生力，特别生根能力。2、培养器官或组织类型：3、培养时间和细胞倍数：培养时间越长或继代次数越多，会推迟或降低形态发生能力。三、培养基1、植物营养：2、物理性质3、植物生长调节物质：生长素 、细胞分裂素、赤霉素四、培养条件（一）光照：一般来说光照强度为1000-5000LX，最常用每日是10-16h的光照。（二）温度：大多数植物组织培养都是在2327之间进行，一般采用25 2。自学指导与训练方案 思考题：1、植物细胞的全能性概念。2、什么是植物细胞分化、 脱分化 、再分化？3、愈伤组织是

24、如何形成的？4、植物离体培养中再生植株的主要途有哪些？5、简述愈伤组织细胞分化。6、简述体细胞胚状体发生过成。7、影响植体离体形态发生的因素有哪些？参考文献1、孙敬三，桂耀林主编植物细胞工程实验技术北京：科学出版社，19952、周维燕主编植物细胞工程原理与技术北京：中国农业大学出版社，20013、刘庆昌 吴国良 植物细胞组织培养 2005.3 中国农业大学出版社4、奚元龄等植物细胞培养手册北京：农业出版社，19922782975、李浚明编译植物组织培养教程第2版北京：中国农业大学出版社，2004单元章节第五章 植物器官和组织培养教学目的掌握植物器官和组织培养的主要技术，特别是茎段、叶片、愈伤组

25、织培养技术的应用。重点难点茎节和切段、叶片、花器官、愈伤组织培养教学方法启发式；讲授；多媒体课件教学时数2课时。教学内容第一节 植物器官和组织培养的基本程序器官培养指：以植物的根，茎，叶，花，果等器官为外植体的离体无菌培养。一、无菌外植体的获得1、外植体：如根的根尖，茎尖，茎节，叶片，花蕾，果实、块茎、鳞茎、种子等2、灭菌（以上讲过）。 二、初代培养物的建立采来的植物材料经过灭菌处理得到无菌外植体-初代培养，是在无菌条件下经无菌操作而获得。三、形态发生和植株再生形态发生途径；器官发生、体细胞胚胎发生。器官发生中芽多发生在愈伤组织的表层，即外起源。而根发生在愈伤组织的深处，即内起源。体细胞胚胎起

26、源于单细胞，体细胞胚具有双极性。四、培养产物的观察记载（一）愈伤组织、外植体愈伤组织诱导率、愈伤组织生长量。 （二）体细胞胚、胚状体诱导率。 （三）芽分化诱导率。第二节 植物营养器官培养一、离体根的培养以植物根切段为外植体进行的离体培养技术离体根培养是进行根系生理和代谢研究的最优良的实验体系（一）根无性系的建立将种子进行表面消毒，在无菌条件下萌发，待根伸长后从根尖一端切取长1cm的根尖，接种于培养基中。1、根直接增殖：养基如MS也可采用，但必须将其浓度稀释到23或12，2527 黑暗条件培养，使根直接增殖。2、根间接增殖；根-愈伤组织-芽或根。4、 根形成过程：以不定根方式进行。（二）影响离体

27、根发生和生长的因素培养基、激素、加适当浓度生长素有利根生长，赤霉素能增加侧根发生与生长。植物材料：一般用种子在无菌条件下萌发根尖。光照和温度：25-27黑暗条件培养有利。二、植物茎培养植物茎培养又分为茎尖和茎段培养茎尖培养：切取茎的先端部分或茎尖分生组织（茎尖）0.1mm部分进行无菌培养，应用于无病毒苗培育。茎段培养：对带有腋芽或叶柄的茎段进行无菌培养。茎段培养优点：是以芽生芽方式繁殖，易培养成功，变异小，性状均一，繁殖速度快，故作快速繁殖的主要外植体茎段培养中可能出现四种情况：单芽、丛生苗、完整植株、愈伤组织。 三、离体叶的培养离体叶培养指；以植物叶器官为外植体进行的离体培养技术（叶原基、叶

28、柄、叶鞘、叶片、子叶在内的叶组织的无菌培养）。它大多经脱分化形成愈伤组织，再由后者分化出茎和根。 (1)材料选择及灭菌 (2)接种 把灭菌过的叶组织切成约05cm见方小块或薄片(如叶柄和子叶)，接种在MS或其他培养基上，培养基中附加BA和NAA。（3)培养 叶接种后培养条件为每天10-12h光照，光强1500-30001x。培养约2周至4周，叶切块开始增厚肿大，进而形成愈伤组织。这时应转移到再分化培养基上进行分化培养。第三节 植物繁殖器官培养一、花器官的培养花器官培养指整朵花或其组成部分如花托、花瓣、花丝、花柄、子房、花药等的无菌培养。其培养方法如下：取材 从健壮植株上取未开放的花蕾作外植体材

29、料。经消毒、接种培养 。要加入生长激素和细胞分裂素，诱导形成愈伤组织或胚状体，再分化培养成植株。二、 种子培养种子培养是指受精后发育完全的成熟种子和发育不完全的未成熟种子的无菌培养。培养技术如下：（1)种子灭菌 种皮厚或不饱满的种子，宜用01升汞消毒10-20min。应先用75酒精或吐温40处理，提高消毒效果。对壳厚难萌发的种子，可去壳培养。 (2)培养基 对某些发育不全的无胚乳的种子培养，应提供适当的生长激素。种子培养的糖浓度可稍低，一般1-3。 (3)接种培养 种子培养的接种较容易，把种子按每瓶3-5粒放人培养瓶中，均匀排列，放在20-28的条件下培养，1000-20001x光强，每天光照

30、10h。第四节 植物组织培养组织培养：指以分离出植物各部位的组织（如分生组织，形成层，木质部，韧皮部，表皮，皮层，胚乳组织，薄壁组织，髓部等），或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。一、分生组织培养分生组织培养指对分生组织进行离体培养，包括根尖、茎尖等顶端分生组织和形成层组织的培养。茎尖的培养；茎尖培养是切取茎的先端部分或茎尖分生组织部分，进行无菌培养。微茎尖和普通茎尖培养。茎尖培养步骤如下:(1)取材 挑选杂菌污染少，生长不久的茎尖。(2)消毒接种 (3)接种 为了减少污染，可在接种前再剥掉一些叶片，使茎尖为05cm左右大小。这样取茎尖大小只能作为快速繁殖。为脱病毒：在剖取茎尖时，把茎芽

31、置于解剖镜下，用解剖针或解剖刀片将分生组织切下来（0.20.5mm），可带12枚叶原基。茎尖培养后可能出现四种情况：芽萌发、产生胚状体、产生不定器官、产生愈伤组织。二、愈伤组织培养愈伤组织培养：指诱导植物外植体产生无序生长的薄壁细胞及其培养技术。 通过植物的器官和组织的培养去分化诱导产生愈伤组织，然后从愈伤组织再分化产生芽，长成小植株三、植物薄层组织培养植物薄层组织培养：指植物薄细胞层组织进行离体培养的技术。薄层细胞培养采用茎表皮层细胞做外植体，进行平板培养。该种培养技术具有取材方便，表面消毒方便，不通过愈伤阶段直接分化成芽、根等优点。自学指导与训练方案复习思考题：1、植物器官和组织培养的基本

32、程序是什么？2、什么是茎尖、叶培养？3、茎尖、茎段、叶培养的方法和步骤？4、什么是植物薄层组织培养？6、茎段培养的目的是什么？参考书： 1、梅家训、丁习武主编 组培快繁技术及其应用 2003.4 中国农业出版社 2、高新一、王玉英编著 植物无性繁殖实用技术 2003.12 金盾出版社 3、李浚明编译植物组织培养教程第2版北京：2004部中国农业大学出版社，单元章节第六章 植物胚胎培养及离体授粉教学目的在了解胚胎培养意义基础上，明确胚胎培养、胚乳培养、胚珠培养、子房培养的方法、离体授粉的方法。重点难点 胚胎培养及离体授粉的概念、培养方法教学方法启发式；讲授；多媒体课件，演示。教学时数2课时。教学

33、内容 胚胎培养（embryo culture）植物胚胎培养是指对植物的胚（种胚）子房、胚珠和胚乳进行离体培养，使其发育成完整植株的技术。第一节植物胚培养一、胚培养的类型: 胚培养的类型：幼胚培养、成熟胚培养 。在未成熟胚胎的培养中常见有三种明显不同的生长方式，一种是继续进行正常的胚胎发育，维持“胚性生长”；另一种是在培养后迅速萌发成幼苗，而不继续进行胚性生长，通常称为“早熟萌发”；第三种是在很多情况下，胚在培养基中能发生细胞增殖形成愈伤组织，并由此再分化形成多个胚状体或芽原基。二、幼胚培养方法苹果幼胚培养（1）幼胚培养一般在授粉后3050d内取幼果，因这时种子内的胚已开始发育，较易培养成功。成

34、熟胚培养取自处于成熟期果实的种子。胚培养的材料进行表面消毒。（2）切开果实取出种子，切开子房壁取出胚珠，剥离珠被取出胚，接种在BA 0.25+IAA 0.5 的1/2MS 培养基上。培养条件为2530和15002000lx 光照14h。（3）分化增值时，把苗切段移植到加有BA 0.51.0和CH300的1/2MS 培养基上 ，在光下培养，可使绿苗得到增殖和生长。（4）苗的生根和移栽，三、成熟胚培养 成熟胚一般指子叶期后至发育完全的胚。它培养较易成功，在含有无机大量元素和糖的培养基上，就能正常生长成幼苗。培养基用MS，适合于幼胚培养的糖为8%-12%，适合于成熟胚培养的糖为2%。加一些天然胚乳（

35、椰乳）对胚培养有促进作用。多数植物幼胚培养温度25-30。光照：黑暗或弱光。第二节植物胚乳培养植物胚乳培养：将胚乳组织从母体上分离出来，通过离体培养，使其发育成完整植株的技术。 胚乳是由两个单倍的极核和一个单倍的精子结合而成的3倍体组织。由它可获得无子结实的3倍体植株。一、植物胚乳培养方法取授粉4-8d后的幼果，常规消毒后，在无菌条件下切开果实，取出种子，小心分离出胚乳。接种在培养基上，可用MS、White等，加入2，4-D或NAA0.5-2.0mg/L，BAO.1-1.OmgL。 在25-27和黑暗条件或散射光下培养，约6-lOd胚乳开始膨大，再培养形成愈伤组织这时应转到分化培养基上培养，分

36、化培养基可加入0.53.0mgL的BA及少量的NAA。二、影响因素：培养基、培养温度、光照第三节植物胚珠和子房培养一、 胚珠的培养胚珠培养是将授粉的子房在无菌条件下解剖后， 取出胚珠置于培养基培养的过程。对胚珠进行培养时，首先从花中取出子房进行表面消毒，然后在无菌的条件下进行解剖，取出胚珠，放在培养基上进行培养，基本培养基一般均用Nistch培养基，如MS、N6、B5等培养基也可采用。将胚珠培养成植株的关键是选择胚的发育时期，实验证明发育到球形胚期的胚珠较易培养成功。二、子房培养子房培养指将子房从母体分离下来置于培养基上,使其进一步发育成幼苗的技术。子房培养意义:胚珠培养时分离胚珠困难,用子房

37、培养，使未受精胚囊中单倍性细胞诱导发育成单倍植株；获得杂种植株,在二个有性不亲和物种杂交中,利用子房培养的方法可获得杂种植株；为试管受精提供一项技术。(一）培养方法子房培养方法与胚珠的培养相似，如培养未受精的，用开花前1-5天的子房。消毒方法见78页。用MS、B5等培养基。由于子房存在性细胞和体细胞，都能产生愈伤组织，进一步发育成植株，所以，植株有来源于性细胞的、有来源于体细胞。来源于性细胞的是单倍体，有来源于体细胞的是二倍体。（二）影响因素用MS、N6、B5等培养基，加激素，大麦子房培养加2，4D0.5+NAA1.0+KT1.0。第三节植物离体授粉植物离体授粉指将未授粉的胚珠或子房从母体上分

38、离下来,进行无菌培养,并用一定的方式授无菌花粉,在试管内实现受精技术。（一）离体柱头授粉离体柱头授粉指通过雄蕊的离体培养，使无菌花粉授于柱头上，得到含有可育的种子的技术。离体柱头授粉方法是在花药未开裂时取母体花蕾，消毒后，在无菌条件下，将整个雄蕊接种到培养基上，当天或第二天，在其柱头上授以无菌花粉。（二）离体子房授粉 离体子房授粉指通过人工方法将花粉直接引入子房，使花粉粒在子房腔内萌发，并进行授精，最后获得种子的技术。1、活体子房内授粉：活体植株上的子房用花粉悬浮液授粉，使子房发育并形成种子。操作步骤：将母本花蕾去雌并套袋，采父本花粉，母本花蕾去雌后1-2天将父本花粉引入子房。直接引入法：将子

39、房顶端开一小口将花粉引入子房；注射法：用100mg/L硼酸将花粉制成悬浮液用注射器注入子房2、离体子房内授粉：指将无菌花粉对离体培养的子房进行授粉，最后获得种子的技术。在花药未开裂时取母体花蕾，消毒后，在无菌条件下，将整个雄蕊接种到培养基上，当天或第二天，将子房顶端开一小口将花粉，将花粉引入子房（三）离体胚珠授粉 离体胚珠授粉指离体培养未受精的胚珠上授粉,最后在试管内获得种子的技术。 离体子房和胚珠授粉是将花粉直接授于子房或胚珠，克服了柱头和花柱组织造成不亲和性的障碍，又克服了活体子房的脱落。二、离体授粉的方法 授粉程序：确定开花时间、制备无菌子房或胚珠授、制备无菌花粉、子房或胚珠试管内授粉。

40、将母本花蕾开花前去雌并套袋，开花后1-2天将花蕾取下，经消毒后，剥去子房壁使胚珠外露，进行无菌培养。在花药未开裂时取母体花蕾，消毒后，在无菌条件下，将整个花药接种到培养基上，当花粉散出时，将花粉授于胚珠。三、影响离体授粉受精的因素（一）外植体1、柱头和花柱：有的必须去掉柱头和花柱，有的不必去掉。2、胎座：胚珠或子房带有胎座，有利于离体授粉受精成功。3、外植体的生理状态：多数开花后1-2天剥离的胚珠结实率高。可以把剥离的胚珠的时间选择在雄蕊授粉后和花粉管进入子房之前。（二）培养基等MS、White 、 Nitsch等，糖47%，温度20-250C,黑暗或弱光自学指导与训练方案复习思考题：1、什么

41、是植物胚胎培养、植物胚乳培养、胚珠和子房培养？2、什么是植物离体授粉、离体柱头授粉、离体胚珠授粉？3、简述离体授粉的程序。参考书：1、刘庆昌 吴国良 植物细胞组织培养 2005.3 中国农业大学出版社2、李浚明编译植物组织培养教程第2版北京：中国农业大学出版社，2004单元章节第七章 花药和花粉培养教学目的掌握花药和花粉的区别，掌握花药最佳接种时期、花药培养的大致过程；基本掌握花药培养的发育途径；初步掌握花药和花粉培养的意义及花粉培养的过程重点难点花药材料消毒和接种，花粉的分离，花粉培养方法，花粉发育过程教学方法启发式；讲授；多媒体课件教学时数2课时。教学内容第一节 花药和花粉培养的意义一、花

42、药和花粉培养的概念花药和花粉培养是指：花粉在培养基上改变其正常发育和机能，不经受精发生细胞分裂，由单个花粉粒发育成完整植株。花药培养属器官培养，花粉培养属细胞培养，但花药培养和花粉培养的目的一样，都是要诱导花粉细胞发育成单倍体细胞，最后发育成单倍体植株。二、花药和花粉培养的应用（一）育种方面由于花粉是单倍体细胞，诱发它经愈伤组织或胚状体发育成的植株都是单倍体植株，经染色体加倍而成为正常结实纯合二倍体植株。缩短育种年限。（二）物种进化研究：利用单倍体材料可查明其原始亲本染色体组的构成。（三）遗传分析：单倍体是研究基因性质及其作用的良好材料。（四）分子生物学（五）植物基因克隆筛选第二节花粉小孢子发

43、育途径把花粉形成植株的途径叫“花粉孢子体发育途径”。把小孢子或花粉沿孢子体途径发育成花粉植株的过程称“雄性发育”。一、花粉发育时期：适宜的花粉发育时期被子植物花粉发育为四个时期：四孢子期、单核期（小孢子期）、二核期、三核期（雄配子期）。二、花药材料的选择：花药培养大多数是单核期三、培养基的选择 花药培养所采用的培养基是MS、N6、B5等。添加的激素有6-BA、KT和玉米素，2，4-D，NAA和IAA等。诱导愈伤组织的培养基可添加2，4-D，其浓度为13mgL，分化培养基可添加23mgL的BA，再加少许的IAA(0.20.5mgL)。花药培养在某些情况下，可不经愈伤组织阶段，直接产生胚状体。但多数情况下是产生愈伤组织，这时尚需要进一步转移到分化培养基中，诱导分化产生芽。四、消毒接种培养 从健壮无病植株中采集花蕾，先用70的酒精浸一下后，在饱和漂白粉溶液中浸10-20min，或用01升汞液消毒7-lOmin，然后用无菌水洗3-5次。花药在消毒前，也可进行预处理，将花蕾剪下放入水中，在冰箱4-5、下保持3-4d。低温贮藏后，