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1、-食品毒理学详案 文档-第 10 页教 案20142015学年第1学期课程编号： 授课专业： 食品科学与工程专业 授课班级： 2012级食品质量与安全 任课教师： 宋慕波 二级学院： 化学与生物工程学院 教 研 室： 食品科学与工程教研室 课程基本信息课程名称食品毒理学课程类型必修课公共课（ ） 专业课（ ）选修课限选课（ ） 任选课（ ）授课方式理论课讲授（ ）实验（践）课（ ）考核方式考试（ ）考查（ ）课程教学总学时数48学分数3学时分配理论讲授： 48 学时 实验（践）： 0 学时 上机： 0 学时一、教材基本信息教材选用李建科主编中国计量出版社（2012年12月）出版的食品毒理学（第
2、1版）（“十一五”高等学校通用教材）。本教材以系统性、科学性、新颖性和普遍适用性为原则，在系统介绍食品毒理学基本概念、原理和方法的基础上、理论联系实际，全面介绍了与食品安全相关的毒理学问题；同时，也力求反映毒理学研究和安全性评价的最新进展，力求将相关学科的最新技术应用到食品毒理学研究中来。列如本书第九章将分子生物学的最新成果在食品毒理学的应用做了非常全面的介绍。全书共分二十章。第一章至第五章阐述学科定义、术语以及论述毒物的体内过程，毒物动力学及毒理机制；第六章至第十章介绍食品安全性毒理学试验方法、安全性评价程序和规范，食品中有互有害物质安全限量标准制定的方法，步骤和风险评估；第十一章至第十九分
3、别介绍食品中天然存在的有毒有害物质、外源性危害物（包括食品添加剂，农药、兽药钱留，有害元素，霉菌毒素加工污染，食品容顺和包装材料等）的毒理学问题；安全标准及预防和控制措施；第二十章介绍食品毒理学汉行病学调查方法。本教材内容全面，融系统性、科学性、新颖性和普遍性为一体，非常适合作为我校食品科学与工程类本科生教材。二、课程目标食品毒理学是研究食品中外源化学物质的性质、来源于形成以及他们的不良反应与可能的有益作用和机制，并确定这些物质的安全限量和评价食品安全性的一门科学是食品安全的重要组成部分，也是食品质量与安全专业学生的必修课程。通过本课程的学习使学生能够掌握通过毒理学角度分析食品中可能含有的外源
4、化学物质对食用者健康的危害，检验和评价食品的安全性或安全范围的知识和技能。具体目标如下： （1）掌握食品毒理学的基本概念，了解食品毒理学的研究内容、研究方法和发展趋势。 （2）培养学生从毒理学的观点出发，掌握食品中外源化学物在体内的生物转运和转化、毒作用机制、毒性特点和一些基本实验设计思路和方法。（3）了解在食品工业的流程中的毒理安全性，掌握相关预防手段。例如在生产、包装和运输过程中容易出现的食品安全问题。（4）教学过程中注重培养学生自学能力、知识的应用于创新能力。让学生及时了解食品毒理学的最新国内外研究进展。三、教学重点及难点重点讲授毒理学基础知识，包括毒物的体内过程、毒物动力学和化学物质的
5、毒理机制等内容。同时，与食品工业生产实践联系紧密的内容，例如食品安全性评价程序与规范、食品中有害物质的限量标准和食品包装材料的毒理学安全性等也是本课程的教学重点。难点：毒物的体内过程、毒物动力学和化学物质的毒理机制等章节内容较多、概念比较抽象，需要重点讲授，帮助学生理解。注：表中（ ）选项请打“”。附件3：章节或分次(课时)详细教案 食品毒理学 课程授课教案周次11课次1课时3课型理论课 讨论课 实验课 习题课 其他章节名称第8章 毒理学评价的分子生物学方法一、教材分析本课程选用的食品毒理学教材，特别强调了对毒理学最新发展趋势的相关内容。毒理学评价的分子生物学方法是毒理学的研究前沿，是帮助学生
6、了解食品毒理学研究趋势的重要章节。本书第8章分为三节全面介绍了应用在食品毒理学中的分子生物学技术，内容都是在毒理学研究中应用的最新技术。食品毒理学是一门交叉学科，了解其他学科研究的最新成果能够拓展学生的视野。 本章之前同学们对食品毒理学的基本概念和基础的实验评价方法有了充分的理解，在这个基础之上进行最新技术的介绍非常适合。二、教学目的及要求1.了解应用于毒理学评价的分子生物学技术；2.掌握亚细胞组分制备、核算提取和PCR技术的原理和简单操作技术； 3.了解这些技术在各自应用领域发挥的作用。三、教学重点与难点重点：亚细胞组分制备、核算提取和PCR技术的原理的理解，了解各分子生物学技术的应用范围。
7、难点：分子生物学技术原理；实验操作材料和仪器的认知。 三、教学方式方法、手段结合多媒体讲授与课堂讨论结合进行授课。 四、教学过程第一节亚细胞组分的制备1.分子生物学理论和技术的概念以及在毒理学评价方面的应用（10min）分子生物学时在分子水平上研究生命现象的科学。通过研究生物大分子(核酸、蛋白质)的结构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的本质。进十几年来，分子生物学理论和技术飞速发展，为生物、医学和毒理学的研究和发展提供了新的思维和研究工具。（举例：人类基因组计划的完成对医学的影响；转基因技术的应用对食品科学的影响。）同时，随着基因芯片技术、蛋白芯片技术和基因测序技术的引入，大大提高了现
8、代毒理学研究的整体水平。因此，未来会有更多的分子生物学技术运用于毒理学评价中，了解这些前沿技术非常有必要。2.亚细胞组分的制备（20min）亚细胞组分的概念回顾在第三章学习过的细胞结构，通过细胞器的概念指导学生认识亚细胞组分的概念。细胞是由许多亚细胞组分组成的，如核、线粒体、内质网膜、溶酶体及高尔基体等，它们在维持细胞正常生理功能方面起着重要的作用。研究亚细胞组分对毒理学评价的意义因为亚细胞结构承载着重要作用，因此许多外源化学物引起机体的损害作用有可能与亚细胞组分的结构与功能损伤有关。(举例：亚细胞组分作为遗传毒性测定中的代谢活化系统，如S9的普遍运用)因此，为了深入了解外源化学物的毒作用机理
9、需要对亚细胞组分进行研究。2.3亚细胞组分的分离 为什么要对亚细胞组分进行分离？为了深入的研究外源化学物的靶位点、探讨化学无毒性效应，需要将细胞中各亚细胞组分分离和纯化是十分必要的。细胞膜的制备细胞膜的结构特点回顾第三章细胞的结构。（提问：细胞膜的结构模型是什么？）细胞膜又称细胞质膜（plasma membrane）。细胞表面的一层薄膜。有时称为细胞外膜或原生质膜。细胞膜的化学组成基本相同，主要由脂类、蛋白质和糖类组成。2.4.2 细胞膜的分离技术在毒理学研究中经常分离的细胞膜结构包括：肝细胞膜、红细胞膜、脂质体细胞膜，脂质体和突触体膜。细胞组分的分离技术包括：离心技术、流式细胞技术和细胞电泳
10、。本节可主要讲授离心技术。通过肝细胞膜的分离讲解密度梯度离心的原理。（提问:为什么针对肝细胞膜的研究较多?）肝脏是机体主要的代谢器官，肝细胞膜的制备，对于研究膜蛋白的理化性质、结构和功能具有重要意义。密度梯度离心的原理(结合密度梯度离心flash 动画讲解)：密度梯度离心是用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。（在此强调：不同的亚细胞组分会停留在不同的密度层中，因此分离。）这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。分离活细胞的介质要求：a能产生密度梯度，且
11、密度高时，粘度不高；b PH 中性或易调为中性；c浓度大时渗透压不大；d对细胞无毒。肝细胞分离的基本步骤和原理（结合密度梯度离心flash 动画讲解）：肝细胞的离心介质选用蔗糖。根据密度梯度离心的原理，由于肝细胞的相对密度为左右，分布于37%-41%的蔗糖之间；通过其标志酶的活性即可很好的标定肝细胞膜所在层。讨论题目:在肝细胞提取过程中选用了标志酶，那么其它技术如放射性核素标记法有什么缺点？第二节 核酸的提取与制备1.核酸提取的技术概述(10min)核酸的提取是分子生物学中很重要的基本实验技术，也是其他分子生物学分析方法的前提。核酸样品的提取质量非常重要，直接关系到分析检测的成败。因此，需要掌
12、握这项技术的一些基本操作原则。2.核酸提取技术操作过程重点(20min)尽量简化操作步骤；（举例：在样品研磨时应迅速完成）减少物理因素对核酸的降解。（举例：操作时尽量轻的搅动溶液，操作应保持在低温环境等）减少化学因素对核酸的降解。（举例：过高或过低的PH值对核酸提取质量的不良影响）防止核酸的生物降解。（举例：RNA酶在自然界中大量存在，包括人的唾液，如果在实验过程中不带口罩，容易造成样品的严重降解）3.核酸提取的原理(20min)提出问题:如果要将一种物质从混合物种提取出来有哪两种途径？采用某种手段直接将这种物质从混合物种抽提出来。将混合物的其它成分去除，留下的部分即为我们需要的物质。提取核酸
13、的原理符合第种思路。提出第二个问题：细胞组织中除了核酸外其余的成分有哪些？答：细胞中大量存在的蛋白质、多糖、脂类等生物大分子。因此明确提取核酸的原理就是要去除这些蛋白质、多糖、脂类等生物大分子。核酸提取的主要步骤:切取组织5g左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。 倒入液氮,磨成粉末,加10ml分离缓冲液。 加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。 加50ul或1mg 蛋白酶 K, 37保温1-2小时, 直到组织完全解体。 加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm离心数秒钟。 取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽
14、提。待分层后,3000rpm离心 5分钟。 取上层水相至干净离心管, 加2倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。 移去上层乙醚,保留下层水相。 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20分钟，DNA沉淀形成白色絮状物。 用玻棒钩出DNA沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE中,-20保存。 学生可以简要了解各个步骤，但要理解主要试剂的用途，例如SDS的作用是使蛋白变性，积酚:氯仿:异戊醇是用来分离脂类。核酸提取操作的注意事项（引导学生讨论为什么需要注意这些事项）: 裂解液要预热,以抑制DNase,加速蛋白变性,促进D
15、NA溶解。(避免生物降解) 各操作步骤要轻柔,尽量减少DNA的人为降解。（避免物理降解） 取各上清时,不应贪多,以防非核酸类成分干扰。（避免样品污染） 异丙醇,乙醇等要预冷,以减少DNA的降解,促进DNA与蛋白等的分相及DNA沉淀。（避免物理降解） 提取DNA过程中所用到的试剂和器材要通过高压烤干等办法进行无核酸酶化处理。 （强调这是为了避免生物降解）4.核酸提取的浓度检测(10min)核酸在波长为260nm处有吸收峰，可以通过测定在波长为260nm处的吸光值来计算核酸浓度，计算公式为：DNA浓度=A260 50。污染物的检测可用波长从200-300nm的扫描紫外分光光度测定法，测定A260n
16、m与A280nm的紫外光吸收之比，比值接近表示DNA纯度高，不含蛋白杂质。 第三节 基因突变分析与PCR检测1.基因突变分析(15min)回顾第五章第二节所讲的基因突变的种类包括：碱基置换、移码突变和变短突变。引出用于基因突变检测的几种分子生物学检测技术：DNA测序、原位杂交、基因芯片等。这部分内容不做为教学重点，仅做简单介绍，由学生自学。2.有害微生物的PCR检测(20min)说明常规检测有害微生物方法繁琐、费时等不足，提出PCR检测法快速和精确等优点。通过比较让同学明白随着食品安全性要求的不断提高，PCR技术将在食品有害微生物检测领域获得广泛应用。2.1 PCR技术原理（结合PCR原理fl
17、ash动画讲授） 首先介绍在人体内DNA复制所需要的条件，引出PCR技术是一种体外的DNA复制技术。简要介绍PCR技术的发展历程，突出rTaq酶的发现对PCR技术发展的重要意义。介绍PCR反应体系的组成：需要引物、模板、缓冲液（Buffer）、rTaq酶、dNTP。重点让学生理解各各组分在反应体系中的作用。举例说明PCR技术的实际应用：检测细胞增生李斯特菌；检测金色葡萄球菌；检测大肠杆菌。通过这写实例引导学生思考PCT检测技术可能存在的问题：污染问题；假阴性问题；灵敏度问题；加测效果问题。小结（10min）本章学习了分子生物学方法在毒理学评价方面的应用，这些交叉学科中最新成果的运用对毒理学研究
18、有很大的推动作用。我们主要学习了亚细胞组分制备技术、核酸的提取技术和PCR检测技术，这些技术的原理需要进行充分的理解。通过学习我们也知道了这些技术主要运用与食品毒理学的那些方面，在实践中发挥着什么样的作用。 同时，我们也清楚的看到这些技术所存在的问题和改进的方向。五、版书设计第八章 毒理学评价的分子生物学方法 1.分子生物学方法概述。毒理学研究为何要借助分子生物学理论和技术？第一节 亚细胞组分的制备 1. 亚细胞组分的概念； 2. 细胞膜的分离； （1）细胞膜的结构特点-细胞膜包含哪些毒理学研究的信息？ （2）亚细胞组分分离的方法：离心法、流式细胞技术、细胞电泳； （3）密度梯度离心法的原理；
19、 例如：肝细胞膜的制备； 第二节 核酸的提取与制备1. 核酸提取的技术概述-核酸提取是分子生物学分析方法的前提条件； 2.核酸提取技术操作过程简化操作步骤； 减少物理因素对核酸的降解。减少化学因素对核酸的降解。防止生物降解。 3.核酸提取的原理：去除细胞中的蛋白质、多糖、脂类等生物大分子4.核酸提取的操作过程细胞裂解 萃取 沉淀 漂洗 溶解 主要试剂的作用原理：SDS：使蛋白质变性；酚:氯仿:异戊醇：抽提脂质；5.核酸浓度和纯度检测利用核酸在260nm波长处又吸收峰，利用分光光度法进行检测。第三节基因突变分析与PCR检测1.基因突变分析技术的种类 DNA测序、原位杂交、基因芯片2.有害微生物的
20、PCR检测技术发展 rTaq酶的发现反应体系要素 引物模板缓冲液rTaq酶dNTP 小结 1.运用分子生物学方法的意义； 2.分子生物学方法存在的为题。六、讨论、练习、作业1. 亚细胞组分制备的方法有哪些？如何通过密度梯度离心法制备肝细胞膜？ 2. 为什么A260nm与A280nm的比值可以判断蛋白杂质的含量？ 3. 运用PCR技术检测食品卫生无的有点有哪些？七、教学反思本章有很多交叉学科的知识，相关概念比较抽象，学生理解上可能存在问题，应多采用多媒体等更直观的教学手段。要求同学做好课前预习，激发学生兴趣，促进学生在课后更深入的自学。八、参考书目资料 1.祝寿芬，裴秋玲：现代毒理学，北京，中国协和医科大学出版社，2003年2.杨晓泉：食品毒理学，北京：中国轻工业出版社，1999年3.李龙主：现代毒理学实验技术原理与方法，北京，化学工业出版社，2006年九、下节内容介绍 了解食品毒理学安全性评价规范和评价程序。