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1、-限制性内切酶综合资料-第 53 页限 制 性 内 切 酶 综 述(Restriction Endonucleases: An Overview) 30多年前，当人们在对噬菌体的宿主特异性的限制-修饰现象进行研究时，首次发现了限制性内切酶。细菌可以抵御新病毒的入侵，而这种限制病毒生存的办法则可归功于细胞内部可摧毁外源DNA的限制性内切酶。首批被发现的限制性内切酶包括来源于大肠杆菌的EcoR I和EcoR II，以及来源于Heamophilus influenzae的Hind II和Hind III。这些酶可在特定位点切开DNA，产生可体外连接的基因片段。研究者很快发现内切酶是研究基因组成、功能
2、及表达非常有用的工具。当限制性内切酶的应用在上世纪七十年代流传开来的时候，以NEB为代表的许多公司开始寻找更多的限制性内切酶。除了某些病毒以外，限制性内切酶只在原核生物中被发现。人们正在从数以千计的细菌及古细菌中寻找新的限制性内切酶。而对已测序的原核基因组数据分析表明，限制性内切酶在原核生物中普遍存在-所有自由生存的细菌和古细菌似乎都能编码限制性内切酶。限制性内切酶的形式多样，从大小上来说，它们可以小到如Pvu II（157个氨基酸），也可以比1250个氨基酸的Cje I更大。在已纯化分类的3000种限制性内切酶中，已发现了超过250种的特异识别序列。其中有30%是在NEB发现的。对具有未知特
3、异识别序列的限制性内切酶的研究发现工作仍在继续。人们从分析细胞提取物的生化角度研究的同时，也采用计算机分析已知的基因组数据，以期有更多的发现。尽管很多新发现的酶的识别序列与已有的重复-即同裂酶，仍然有识别新位点的酶不断被发现。上世纪80年代，NEB开始克隆并表达限制性内切酶。克隆技术由于将限制性内切酶的表达与原有细胞环境分离开来，避免了原细胞中其它内切酶的污染，从而提高了酶的纯度。此外，克隆技术提高了限制性内切酶的产量，简化了纯化过程，使得生产成本显著降低；克隆的基因很容易进行测序分析，表达出的蛋白也能进行X射线结晶分析，这使得我们对于克隆产物更加确定。 限制性内切酶的主要功能是保护细菌不受噬
4、菌体的感染，这一观点已被人们广泛接受。它们作为微生物免疫机制的一部分行使其功能。当一个没有限制性内切酶的细菌被病毒感染时，大部分病毒颗粒都能成功地进行感染。然而一个有限制性内切酶的同种细菌被成功感染的比率显著下降。出现更多的限制性内切酶将会起到多重保护作用；而一个拥有4到5种各自独立的限制性内切酶将会使细胞坚不可摧。限制性内切酶常常伴随一到两种修饰酶（甲基化酶）出现。后者的作用是保护细胞自身的DNA不被限制性内切酶破坏。修饰酶识别的位点与相应的限制性内切酶相同，但只甲基化每条链中的一个碱基，而不是切开DNA链。限制性内切酶识别位点处的甲基基团伸入到双螺旋的大沟中去，阻碍了限制性内切酶的作用。这
5、样，限制性内切酶和它的搭档-甲基化酶一起就构成了限制-修饰（R-M）系统。在一些R-M系统中，限制性内切酶和修饰酶是两种不同的蛋白，它们各自独立行使自己的功能；而在另一些系统中，两种功能由同一种限制-修饰酶的不同亚基，或是同一亚基的不同结构域来执行。传统上将限制性内切酶按照亚基组成、酶切位置、识别位点、辅助因子等因素划分为三大类。然而，蛋白测序的结果表明，限制性内切酶的变化多种多样，若从分子水平上分类，则应当远远不止这三种。 I型限制性内切酶是一类兼有限制性内切酶和修饰酶活性的多个亚基的蛋白复合体。它们在识别位点很远的地方任意切割DNA链。以前人们认为I型限制性内切酶很稀有，但现在通过对基因组
6、测序的结果发现这一类酶其实很常见；尽管I型酶在生化研究中很有意义，但由于不产生确定的限制片段和明确的跑胶条带，因而不具备实用性。II型酶在其识别位点之中或临近的确定位点特异地切开DNA链。它们产生确定的限制片段和跑胶条带，因此是三类限制性内切酶中唯一用于DNA分析和克隆的一类。II型限制性内切酶由一群性状和来源都不尽相同的蛋白组成，因而任意一种限制性内切酶的氨基酸序列可能与另一种限制性内切酶的氨基酸序列截然不同。实际上，从已知的情况上看，这些酶很可能是在进化过程中各自独立产生的，而非来源于同一个祖先。 II型限制性内切酶中最普遍的是象Hha I、Hind III和Not I这样在识别序列中进行
7、切割的酶。这一类酶是构成商业化酶的主要部分。大部分这类酶都以同二聚体的形式结合到DNA上，因而识别的是对称序列；但有极少的酶作为单聚体结合到DNA上，识别非对称序列。一些酶识别连续的序列（如EcoR I识别GAATTC）；而另一些识别不连续的序列（如Bgl I识别GCCNNNNNGGC）。限制性内切酶的切割后产生一个3羟基端和一个5磷酸基团。它们的活性要求镁离子，而相应的修饰酶则需要S-甲硫氨酸腺苷的存在。这些酶一般都比较小，亚基一般都在200-300个氨基酸左右。另一种比较常见的酶是所谓的IIS型酶，比如Fok I和Alw I，它们在识别位点之外切开DNA。这些酶的大小居中，约为400-65
8、0个氨基酸左右；它们识别连续的非对称序列，有一个结合识别位点的域和一个专门切割DNA的功能域。一般认为这些酶主要以单体的形式结合到DNA上，但与临近的酶结合成二聚体，协同切开DNA链。因此一些IIS型的酶在切割有多个识别位点的DNA分子时，活性可能更高。第三种II型限制性内切酶（有时也被称为IV型限制性内切酶）是一类较大的、集限制和修饰功能于一体的酶，通常由850-1250个碱基组成，在同一条多肽链上同时具有限制和修饰酶活性。有些酶识别连续序列，并在识别位点的一端切开DNA链；而另一些酶识别不连续的序列（如Bcg I：CGANNNNNNTGC），并在识别位点的两端切开DNA链，产生一小段含识别
9、序列的片段。这些酶的氨基酸序列各不相同，但其结构组成是一致的。他们在N端由一个负责切开DNA的功能域，这个域又与DNA修饰域连接；此外还有一到两个识别特异DNA序列的功能域构成C端，或以独立的亚基形式存在。当这些酶与底物结合时，它们或行使限制性内切酶的功能切开底物，或作为修饰酶将其甲基化。III型限制性内切酶也是兼有限制-修饰两种功能的酶。它们在识别位点之外切开DNA链，并且要求识别位点是反向重复序列；它们很少能产生完全切割的片段，因而不具备实用价值，也没有人将其商业化。酶 切 反 应(Setting Up a Restriction Endonuclease Reaction)一、 建立一个
10、标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即10个单位的内切酶可以切割1g不同来源和纯度的DNA。通常，一个50l的反应体系中，1l的酶在1X NEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1g已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。二、 选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别4个碱基的酶将平均在每44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均
11、在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3或5突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的Compatible Cohesive Ends And Recleavable Blunt Ends一文。三、 酶内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。酶应当是最后一个被加入到反应体系中（在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的DNA通常需要超过1U/g的酶才能被完全切割。参见目录第244和264之切割质粒DNA和包埋法切割DNA。四
12、、 DNA待切割的DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容，参见第252页至253页之甲基化相关内容。五、 缓冲液对于每一种酶NEB都提供相应的最佳缓冲液，可保证几乎100%的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为1X。有的酶要求100g/ml的BSA以实现最佳活性。在这种情况下，我们也相应提供100X的BSA（10mg/ml）。不需要BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。关于缓冲液更详细的信息参见第234页。六、 反应体积内切酶活力单位的定义是：1小时内，50l反应体积中，降解1g的底物DNA
13、所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）。七、 混合这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！八、 反应温度大部分酶的反应温度为37C；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。一般为50-65C不等。参看第244页 Activity of thermophiles at 37C。九、 反应时间1酶活单位的定义时间
14、为1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全。参见第241页酶在反应中的存活时间。十、 终止反应如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。在NEB我们使用如下反应终止液：50%的甘油，50mM EDTA（pH8.0），和0.05%溴酚蓝（10l/50l反应液）。如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（65C或85C，20分钟）。热失活并不能适用于所有的酶，详情参见第240页热失活表。此外，酚/氯仿抽提也可以用于终止反应。十一、贮存大部分酶应贮存于-20C。少部分酶则须在-70C长期保存。详情请参见相关酶的DATA S
15、HEET 或目录相关部分。10X BUFFER 和100X BSA于-20C保存。BSA不能与NEBuffer混合后保存，否则将会出现BSA沉淀。十二、稳定性每隔1-2个月都会对所有的酶有一个活性检测；最近的一次检测结果将被贴在售出的每一管酶上。通过三十多年来的经验，我们发现大部分酶在推荐的保存缓冲液里在-20C条件下十分稳定。高于-20C条件下稳定性将有所降低。 十三、对照反应如果发现您的DNA底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下：将不加内切酶的底物DNA（待切底物）与加入了内切酶的对照DNA（有多个已知酶切位点）同时进行反应。若实验结果表明底物DNA降解，则说明DN
16、A在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染；若实验结果发现底物DNA保持完整，而对照DNA被成功切开，则可以排除酶质量的原因，此时可以将对照DNA和待切底物DNA混合起来再次进行反应，以确定样品中是否有抑制剂。如果有抑制剂存在（通常是盐、EDTA或酚），则混合物里的对照DNA也无法被切开。限制性内切酶质量控制(Restriction Endonucleases: Quality Control)单位定义 限制性内切酶的一个活性单位是指，在50l 的反应体系里，采用随酶提供的 NEBuffer，用1个小时的时间，彻底消化1g底物DNA所需要的酶量。 酶切反应应在带盖的Eppendorf 管中进行，
17、选用技术数据卡上所标明的适宜温度。在确定酶活性之前，浓缩的酶应该用推荐的贮存液稀释成大约1,000 单位/ml。 质量控制 所有质量控制鉴定结果都公布在随酶提供的技术数据卡上。 非特异性内切酶鉴定 为鉴定非特异性内切酶污染，限制性内切酶与缺少该酶识别序列的超螺旋DNA底物温育。对于RF I型DNA(超螺旋形式)，一个单一的非特异性缺口就会将它转变成RF II型DNA(带缺口环状)。小份的限制性内切酶与1gDNA在50l反应体系中，采用推荐的NEBuffer，在推荐的温度下温育4小时。两种形式的DNA在琼脂糖凝胶上很容易区分，可以计算出从RF I 到 RF II的转化率。 核酸酶污染的过夜鉴定
18、所有的限制性内切酶与1g 底物DNA在50l反应体系中，采用推荐的NEBuffer温育过夜。比较酶切1小时的特征带型和过夜酶切的带型。如果两种情况下带型均明显、没有改变，则说明测试的酶中不存在非特异性的DNA酶。我们报道了可以温育过夜的最大酶单位数。 核酸外切酶污染鉴定 所有的限制性内切酶与1g 单双链混合的、3H标记的E.coli DNA (200,000 cpm/g)在50l反应体系中，采用随酶提供的NEBuffer，在推荐的温度下温育4小时。通过可溶解的TCA着色，可以计算出反应体系中被标记的DAN的百分比，进而可以显示出核酸外切酶的污染。该种方法可检测出的底线是0.05%。 DNA片段
19、的连接 DNA片段通过用每一种限制性内切酶过量消化底物DNA而获得。这些片段随后用T4 DNA连接酶连接( 5 末端浓度为0.1-1.0 M)。连接的片段然后用同一种限制性内切酶重切。仅当3 和 5末端都保留完整，连接反应才会发生；而且只有那些识别位点完全恢复的分子才能被重切。切割后正常的带型说明3 和 5末端都是完整的，而且准备的酶样品中检测不到核酸外切酶和磷酸酶。采用PstI的一个例子显示如下： 蓝白斑筛选鉴定 用于克隆的酶还须通过额外的质量鉴定蓝白斑筛选鉴定，以确定经酶过量消化后DNA末端的完整性。该种鉴定方法为：用酶10倍过量消化适当的载体上lacZ基因中单一的酶切位点，连接，转化，并
20、涂XGal/IPTG/Amp平板。成功地切割、连接和表达b-galactosidase可以说明克隆后基因是完整的，一个完整的基因产生蓝斑，一个不完整的基因(例如，降解的DNA末端)产生白斑。在进行蓝白斑鉴定中，所有的限制性内切酶产生的白斑数量不应超过3。限制酶在各种NEBuffer 中的活性(NEBuffer Activity Chart for Restriction Enzymes) 对应每一种限制性内切酶，New England Biolabs 均提供彩色盖子的10X NEBuffer，以保证100%活性。下面表格中列出每一种酶及其随酶提供的最适宜的NEBuffer。同时也列出每种酶在四
21、种不同的NEBuffer中的大致活性，以帮助选择双酶切时最适宜的环境。除非特别指出，温育温度均为37C。注意事项：表格中所列出的酶活性是近似值，计算酶活性时所采用的底物与计算该酶的单位时所采用的底物相同。 缓冲液在使用前应充分解冻，并混合均匀。 点击英文缩写注解与缓冲液成份. | A | B | C | D | E | F | H | K | M | N | P | R | S | T | X | Z | EnzymeSupplied NEBuffer% Activity in NEBuffers1234Aat II405050100Acc I4505010100Acc65 I3 + BSA1
22、07510025Aci I3255010050Acl I4 + BSA10100100Afe I *SE-Y255025100Afl II2 + BSA5010025100Afl III3 + BSA257510050Age I1100501075Ahd I4 + BSA25750100Ale I4102010100Alu I210010075100Alw I45010010100AlwN I45010050100Apa I 25C4 + BSA25500100ApaL I4 + BSA10010010100Apo I 50C3 + BSA107510075Asc I401010100Ase
23、I3NR75dd100NRAsiS I3 + BSA5010010050Ava I4107510100Ava II4507510100Avr II210010050100Bae I 25C2 + BSA + SAM501005075BamH IUdd + BSA751005075Ban I45010050100Ban II41001050100Bbs I21001002575Bbv I2 1001002575BbvC I45010010100BceA IUdd + BSA25NRNR75Bcg IU + SAM507510050BciV I41002510100Bcl I 50C350100d
24、d10075Bfa I4755010100BfrB I4 + BSA102510100BfuA I 50C307510010BfuC I4 + BSA1005025100Bgl I3507510050Bgl II3107510010Blp I45010010100Bme1580 I2751007575BmgB I3 + BSA02510010Bmr I27510075100Bmt I *SE-W251001050Bpm I3 + BSA75100100100Bpu10 I*SE-K02510025BpuE I 25C2 + SAM751001075Bsa I 50C37575100100Bsa
25、A I3757510075BsaB I 60C275100100100BsaH I4 + BSA50100100100BsaJ I 60C2100100100100BsaW I 60C2 + BSA501005050BsaX I475 100 10 100 BseR I210010075100BseY I3105010050Bsg I4 + SAM507550100BsiE I 60C2 + BSA5010010100BsiHKA I 65C3 + BSA50100100100BsiW I 55C310010010025Bsl I 55C3105010075Bsm I 65C275100757
26、5BsmA I 55C35010010050BsmB I 55C375100100100BsmF I 65C4 + BSA255050100BsoB I 65C21010010050Bsp1286 I4 + BSA252525100BspCN I 25C1 + BSA + SAM100751075BspD I4257550100BspE I30101000BspH I41010050100BspM I3NRNR100NRBsr I 65C305010010BsrB I250100100100BsrD I 60C2 + BSA501005075BsrF IU251007575BsrG I2 +
27、BSA2510010100BssH II 50C3100100dd100100BssK I 60C3 + BSA05010050BssS I3050dd10010BstAP I * 60CSE-W252510025BstB I 65C4755025100BstE II 60C3507510075BstF5 I * 65CSE-Y755025100BstN I 60C2 + BSA1010010075BstU I 60C210010050100BstX I 55C32510010050BstY I 60C25010075100BstZ17 I3NRNR100NRBsu36 I3 + BSA025
28、1000Btg I3 + BSA2550100100Bts II4 + BSA 100 50 50 100 Cac8 I3507510075Cla I4 + BSA105050100Dde I37510010075Dpn I410010075100Dpn IIUNRNRdd100NRDra I4757550100Dra III3 + BSA1007510025Drd I4255010100Eae I110010050100Eag I3102510010Ear I110010050100Eci I2 + BSA5010010050EcoN I410010075100EcoO109 I4 + BS
29、A10010075100EcoR IUdd100100100100EcoR V3 + BSA507510050Fat I *SE-G101005050Fau I * 55CSE-B100251050Fnu4H I4102525100Fok I45010075100Fse I4 + BSA100750100Fsp I4107510100Hae II4 + BSA7510050100Hae III2501002575Hga I11007550100Hha I4 + BSA75100100100Hinc II3 + BSA75100100100Hind III2501001050Hinf I2751
30、007575HinP1 I2100100100100Hpa I4255010100Hpa II11005010100Hph I4NR750100Hpy99 I4 + BSA10 10 0 100 Hpy188 I450 25 10 100 Hpy188 III4 + BSA100 100 10 100 HpyCH4III4100 50 25 100 HpyCH4IV1100 25 10 25 HpyCH4V450 50 25 100 I-Ceu I4 + BSA10100100I-Sce IU + BSA10505050Kas I2 + BSA751007575Kpn I1 + BSA1007
31、5050Mbo I375100100100Mbo II210010050100McrBC2 + BSA + GTP501001075Mfe I4755010100Mlu I3257510050Mly I4 + BSA505025100Mme I4 + SAMNRNRNR100Mnl I2 + BSA751005075Msc I4757575100Mse I2 + BSA751007575Msl I210010025100Msp I2751005050MspA1 I4 + BSA5010050100Mwo I 60CU107510075Nae I1100751075N.Alw I22510025
32、50Nar I1100757575N.BbvC IA25010010100N.BbvC IB25010010100N.BstNB I 55CU0101010Nci I41002510100Nco I4100100100100Nde I47510075100NgoM IV41005010100Nhe I2 + BSA10010010100Nla III4 + BSA252525100Nla IV4 + BSA101010100Not I3 + BSA07510050Nru IU0107510Nsi IU25255010Nsp I2 + BSA1001000100Pac I1 + BSA10075
33、10100PaeR7 I42510010100Pci I * SE-O257510050PflF I4 + BSA02525100PflM I3 + BSA010010050PI-Psp I 65CU + BSA0101010PI-Sce IU + BSA0000Ple I410010075100Pme I4 + BSA05010100Pml I1 + BSA10075075PpuM I40250100PshA I4 + BSA507510100Psi I *SE-B50100025PspG I 75C27510050100PspOM I *SE-Y2510050100Pst I3 + BSA
34、757510050Pvu I3 + BSA107510010Pvu II2100100100100Rsa I110010050100Rsr II4257510100Sac I1 + BSA1005010100Sac II4257510100Sal IU + BSA00500Sap I475500100Sau3A IU + BSA1005010100Sau96 I450100100100Sbf I *SE-Y75500100Sca IU2575dd5025ScrF I4100100100100SexA I3 + BSA2525100100SfaN I307510025Sfc I4 + BSA75
35、5010100Sfi I 50C2 + BSA010010100Sfo I2251005050SgrA I41005010100Sma I 25C4000100Sml I 55C4 + BSA257525100SnaB I4 + BSA255025dd100Spe I2 + BSA751002575Sph I210010050100Ssp IU501005050Stu I210010050100Sty I3 + BSA257510010StyD4 I210100100100Swa I 25C3 + BSA101010010Taq I 65CU + BSA50757575Tfi I 65C310
36、0100dd100100Tli I 75C3 + BSA252510010Tse I 65C37510010075Tsp45 I 65C1 + BSA10025075Tsp509 I 65C1100100100NRTspR I 65C4 + BSA255025100Tth111 I 65C11002525100Xba I2 + BSA01007575Xcm I2101005050Xho I2 + BSA75100100100Xma I4 + BSA25500100Xmn I2 + BSA10010075100Zra I *SE-B10010025100内切酶在37C条件下的活性(Activit
37、y of Thermophiles at 37C) 下表中列出了最适温度不是37C的限制性内切酶在37C条件下的酶活性。酶最适温度37C%活性Apa I25C100*ApeK I75Cn/aApo I50C50Bae I25C20Bcl I50C50BfuA I50C25BpuE I25C20Bsa I55C10BsaB I60C20BsaJ I60C20BsaW I60C20BsiE I60C30BsiHKA I65C10BsiW I55C50Bsl I55C30Bsm I65C20BsmA I55C10BsmB I55C20BsmF I65C50BspCN I25C30Bsr I65C20
38、BsrD I65C30BssH II50C75BssK I60C10BstAP I60C50BstB I65C10BstE II60C10BstF5 I65C20BstN I60C30BstU I60C20BstX I55C50BstY I60C30 BtgZ I60C75 CviA II25Cn/aFat I55Cn/aFau I55C20Mwo I60C 10 N.BstNB I55C10Pho I75C10PI-Psp I65C 10 PspG I75C10Sfi I50C10Sma I25C50Sml I55C10Swa I25C50Taq I65C10Tfi I65C10Tse I65C20Tsp45 I65C10Tsp509 I65C10TspR I65C10Tth111 I65C10内切酶在PCR反应产物中的活性(Activity of Restriction Enzymes in a P