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1、基因工程的基本操作程序,基因工程的基本操作程序,1、目的基因的获取,2、基因表达载体的构建,3、将目的基因导入受体细胞,4、目的基因的检测与鉴定,目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。,基因操作的基本步骤,一、目的基因的获取 将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。,原核细胞的基因结构(补充内容）,非编码区,非编码区,编码区,编码区上游,编码区下游,与RNA聚合酶结合位点,启动子,终止子,不编码蛋白质。,：编码蛋白质 ,连续不间断,编码区,非编码区,原核细胞的 基因结构,调控遗传信息表达,上 游有启动子，下游有终止子
2、,启动子,真核细胞的基因结构（补充内容）,编码区,与RNA聚合酶 结合位点,内含子,外显子,启动子,终止子,编码区上游,编码区下游,真核细胞的 基因结构,编码区,非编码区,外显子：能编码蛋白质的序列 内含子：不能编码蛋白质的序列,：有调控作用,上游有启动子，下游有终止子,非编码序列：,包括非编码区和内含子,原核细胞与真核细胞的基因结构比较,连续,不连续,编码区,非编码,1下列关于基因结构的认识中，正确的是 （ ） A大豆基因中内含子是能够编码蛋白质的序列 B乳酸菌与酵母菌基因结构中都存在外显子和内含子 C大肠杆菌基因与RNA聚合酶结合位点位于编码区的下游 D水稻细胞基因的编码区中存在非编码序列
3、 2（多选）原核细胞与真核细胞基因结构的共同特点是 （ ） A编码区都有能编码蛋白质的序列 B编码区都是连续的 C非编码区都能调控遗传信息的表达 D非编码区都有RNA聚合酶结合的位点,D,ACD,一、目的基因的获取,(一)、目的基因主要是_,编码蛋白质的基因,（二）、获取目的基因的常用方法有哪些?,1、从基因文库中获取,2、利用PCR技术扩增,3、人工合成,阅读教材P8-11,如：与生物抗逆性相关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品相关的基因、与毒物降解相关的基因、与工业用酶相关的基因等也可以是具调控作用的因子等。,(1)从基因文库中获取目的基因,什么是基因文库？ 什么是基因组文库
4、？ 什么是部分基因文库？ 怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？ 目的基因的有关信息与什么相联系？,概念：基因文库 （gene library）,将含有某种生物不同基因的许多DNA片段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因,称为基因文库(gene library),基因组文库: 基因文库中包含了一种生物所有的基因,这种基因文库叫做基因组文库. 部分基因文库: 基因文库中包含了一种生物的一部分基因,这种基因文库叫做部分基因文库.,基因组文库与部分基因文库的关系,提取某种生物的全部DNA,用适当的限制酶酶切,一定大小的DNA片段,将DNA片段与载体连接,重组载体,基因组
5、文库,导入受体菌中储存,（2）.基因文库的构建方法,基因组文库的构建,思考：基因文库如何构建？,如果用某种生物发育的某个时期的mRNA 反转录产生的多种互补DNA（也叫cDNA）片段，与载体连接后储存在一个受体菌群中，那么，这个受体菌群体就构成了这种生物的cDNA文库。这种方法称反转录法,提取某种生物的某器官或特定发育时期的mRNA,单链DNA,双链cDNA片段,重组载体,与载体连接,cDNA文库,反（逆）转录酶,DNA聚合酶,导入受体菌中储存, cDNA文库的构建-逆转录法：,mRNA,RNADNA杂合双链,单链DNA,双链DNA,逆转录,（cDNA）,DNA聚合酶,真核生物的基因用逆转录法
6、得到的cDNA与原基因相同吗？有哪些差异？原核生物基因呢？,思考？,基因组DNA文库,cDNA文库,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,基因组DNA文库与cDNA文库的比较,依据：目的基因的有关信息。 如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因表达产物蛋白质等特性,（4）从基因文库中得到目的基因的方法,直接分离法(鸟枪法),1、构建基因组DNA文库时，首先应分离细胞的 A、染色体DNA B、线粒体DNA C、总mRNA D、tRNA,2、目的基因可从基因文库中获得，下列有关基因文库的描述正确的是 A、某生物的全套基因就是一个基因文库 B、将含有某
7、种生物不同的许多DNA片段，导入某个生物 体内，则这个生物就是一个基因文库 C、含有一种生物所有基因的基因文库叫做基因组文库 D、含有一种生物的一部分基因的基因文库叫cDNA文库,A,C,（2）利用PCR技术扩增目的基因,PCR聚合酶链式反应 是一项生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。通过此技术，可获取大量的目的基因。,PCR技术,原理： 前提： 原料 方式,PCR扩增仪,DNA复制,一段已知目的基因的核苷酸序列,：以_方式扩增， 即_（n为扩增循环的次数）,指数,2n,模板DNA；DNA引物；四种脱氧核苷酸；TaqDNA聚合酶；离子,过程,变性、退火、延伸三步曲,变性：加热至9095双
8、链DNA解链成为单链DNA 退火：冷却至5560部分引物与模板的单链DNA的特定互补部位相配对和结合 延伸：加热至7075以目的基因为模板，合成互补的新DNA链,1、在遗传工程中，若有一个控制有利性状的DNA分子片段为ATGTGTACAC，要使其数量增多，可用PCR技术进行人工复制，复制时应给予的条件是 双链DNA分子为模板 ATGTG或TACAC模板链 四种脱氧核苷酸 四种核苷酸 DNA聚合酶 热稳定DNA聚合酶引物 温度变化 恒温 A B C D,D,2、在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌呤脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应
9、放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是 A.540个 B.8100个 C.17280个D.7560个,B,（3） 人工合成,根据已知的氨基酸序列合成DNA,蛋白质的氨基酸序列,mRNA的核苷酸序列,结构基因的核苷酸序列,推测,推测,目的基因,化学合成,1、在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是 A、化学合成法 B、基因组文库法 C、cDNA文库法 D、聚合酶链反应,2、下列获取目的基因的方法中需要模板链的是 从基因文库中获取目的基因 利用PCR技术扩增目的基因 反转录法 通过DNA合成仪利用化学方法人工合成 A B C D,A,D,3、目的基因主要是指_的结构基因。获得目的基因的常见方法有三
10、种：（1）从基因文库中获取目的基因，根据基因的_序列，基因在_上的位置，基因的_产物mRNA，基因的_产物蛋白质等获取目的基因。（2）利用PCR技术扩增目的基因，该技术是一项在_完成的核酸合成技术，前提条件是有一段已知目的基因的_序列，以便于合成_。（3）如果基因较小且核苷酸序列已知，可以通过_方法。,编码蛋白质,核苷酸,染色体,转录,表达,体外,核苷酸,引物,人工合成,二、基因表达载体的构建核心,（1）用一定的_切割质粒，使其出现一个切口，露出_。 （2）用_切断目 的基因，使其产生_ _。,（3）将切下的目的基因片段插入质粒的_处，再加入适量_，形成了一个重组 DNA分子（重组质粒）,限制
11、酶,黏性末端,同一种限制酶,的黏性末端,切口,DNA连接酶,相同,1.过程:,质粒,目的基因,限制酶处理,一个切口 两个黏性末端,两个切口 获得目的基因,DNA连接酶,表达载体,同种,1.过程:,a、使目的基因在受体细胞中稳定存在并遗传给子代,b、同时使目的基因能表达和发挥作用,思考：作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？为什么？,不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。必须构建上述元件的主要理由是： （1） 生物之间进行基因交流，只有使用受体生物自身基因的启动子才能比较有利于基因的表达； （2） 通过cDNA文
12、库获得的目的基因没有启动子，只将编码序列导入受体生物中无法转录； （3） 目的基因是否导入受体生物中需要有筛选标记； （4） 为了增强目的基因的表达水平，往往还要增加一些其他调控元件，如增强子等； （5） 有时需要确定目的基因表达的产物存在于细胞的什么部位，往往要加上可以标识存在部位的基因（或做成目的基因与标识基因的融合基因），如绿色荧光蛋白基因等。,3.基因表达载体的组成：,它们有什么作用？,a、目的基因,b、启动子,c、终止子,d、标记基因,位于基因的首端,是mRNA结合位点,位于基因的末端,终止转录,检测目的基因是否导入受体细胞,1、（多选）一个基因表达载体的构建应包括 A目的基因 B启
13、动子 C终止子 D标记基因,ABCD,2、下列关于基因表达载体的叙述不正确的是 A启动子是与RNA聚合酶识别和结合的部位，是起始密码 B启动子和终止子都是特殊结构的DNA短片段，对mRNA的转录起调控作用 C标记基因是为了鉴别受体细胞中是否有目的基因从而便于筛选 D基因表达载体的构建视受体细胞及导入方式不同而有所差别,A,3、目前转基因工程可以 A. 打破地理隔离但不能突破生殖隔离 B. 打破生殖隔离但不能突破地理隔离 C. 完全突破地理隔离和生殖隔离 D. 部分突破地理隔离和生殖隔离,C,常用的受体细胞：,有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞等。,将目的基因导入受体细胞的原理
14、,借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。,三、将目的基因导入受体细胞,吸附、注入、合成、装配、释放,1、将目的基因导入植物细胞,（1）农杆菌转化法,特点:,能感染双子叶植物和祼子植物,对单子叶植物无感染能力,Ti质粒的TDNA可转移至受体细胞并整合到其染色体上,转化过程:,Ti质粒 目的基因,构建,表达载体,植物细胞,植物细胞染色DNA,新性状,农杆菌,（2）基因枪法,基因枪法又称微弹轰击法，是利用压缩气体产生的动力，将包裹在金属颗粒表面的表达载体DNA打入受体细胞中，使目的基因与其整合并表达的方法。,（3）花粉通道法,植物花粉在柱头上萌发后，花粉管要穿过花柱直通胚囊。花粉管通道法就是在植物受粉后，花
15、粉形成的花粉管还未愈合前，剪去柱头，然后，滴加DNA（含目的基因），使目的基因借助花粉管通道进入受体细胞。,2、将目的基因导入动物细胞,方法:,显微注射技术,操作程序:,提纯含目的基因表达载体,取受精卵,显微注射,移植到子宫,受精卵发育,新性状动物,3、将目的基因导入微生物细胞,常用法：Ca2+处理,常用菌：大肠杆菌,微生物作受体细胞原因： 繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对少,过程：,Ca2+处理大肠杆菌,感受态细胞,表达载体与感受态细胞混合,感受态细胞吸收DNA,1、基因工程中科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是 A结构简单、操作方便 B繁殖速度快 C遗传物质含量少、简单 D性
16、状稳定、变异少 2、基因工程常用的受体细胞有 大肠杆菌 枯草杆菌 支原体 动植物细胞 A B C D,B,D,3、基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 A.人工合成基因 B.目的基因与运载体结合 C.将目的基因导入受体细胞 D.目的基因的检测和表达,C,4. 采用基因工程的方法培育抗虫棉，下列导入目的基因的做法正确的是 将毒素蛋白质注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列注射到棉受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与细菌质粒重组，注射到棉的子房并进入受精卵中 将编码毒素蛋白的DNA序列与质粒重组，导入细菌感染棉的体细胞，再进行组织培
17、养 A B C D,C,5. 下列属于基因工程中导入目的基因方法的是 农杆菌转化法 基因枪法 花粉管道法 显微注射法 胚胎移植 DNA分子杂交法 A B C D,C,(四)目的基因的检测与鉴定,检测,导入检测：目的基因是否导入受体细胞,方法,DNA分子杂交,表达检测,转录检测分子杂交,翻译检测抗原抗体杂交,分子检测法,鉴定,抗虫鉴定 抗病鉴定 活性鉴定等,个体水平的鉴定,知识延伸DNA分子杂交技术,该方法是根据碱基互补配对原则，把互补的双链DNA解开，把单股的DNA小片段用同位素、荧光分子或化学发光催化剂等进行标记，之后同被检测的DNA中的同源互补序列杂交，从而检出所要查明的DNA或基因。,返
18、 回,1、用-珠蛋白的DNA探针可以检测出的遗传病是 A镰刀状细胞贫血症 B白血病 C坏血病 D苯丙酮尿症,A,2、应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到检测疾病的目的。这里的基因探针是 A用于检测疾病的医疗器械 B用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子 C合成-珠蛋白的DNA D合成苯丙羟化酶的DNA片段,B,A,思考与探究：,2.根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理,你能分析出不能导入单子叶植物的原因吗?若将一个抗病基因导入小麦中,理论上讲你应该怎样做?,要选择合适的农杆菌菌株，因为不是所有的农杆菌菌株都可以侵染单子叶植物；要加趋化和诱导的物质，一般为乙酰丁香酮
19、等，目的是使农杆菌向植物组织的受伤部位靠拢（趋化性）和激活农杆菌的Vir区（诱导）的基因，使T-DNA转移并插入到染色体DNA上。,3.利用大肠杆菌可以生产出人的胰岛素，联系前面有关细胞器功能的知识，结合基因工程操作程序的基本思路，思考一下，若要生产人的糖蛋白，可以用大肠杆菌吗？,有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。,4.-珠蛋白是动物血红蛋白的重要组成成分。当它的成分异常时，动物有可能患某种疾病，如镰刀形细胞贫血症。假如让你用基因工程的方法
20、，使大肠杆菌生产出鼠的-珠蛋白，想一想，应如何进行设计？,（1）从小鼠中克隆出-珠蛋白基因的编码序列（cDNA)。 （2）将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。 （3）将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。如果表达载体未进入大肠杆菌中，大肠杆菌会不含有抗四环素基因而死掉；如果培养基上长出大肠杆菌菌落，则表明-珠蛋白基因已进入其中。 （4）培养进入了-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取-珠蛋白。,复习题,1）将目的基因导入受体细胞有哪些方法?(试举例说明),2）简述农杆菌转化法,4）有关基因
21、工程的叙述正确的是 （ ） A、限制酶只在获得目的基因时才用 B、重组质粒的形成在细胞内完成 C、质粒都可作为运载体 D、蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料,D,3）有关基因工程的叙述中，错误的是（ ） A、DNA连接酶将黏性末端的碱基对连接起来 B、 限制性内切酶用于目的基因的获得 C、目的基因须由运载体导入受体细胞 D、 人工合成目的基因不用限制性内切酶,A,5）基因工程是在DNA分子水平上进行设计施工的。在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是 A、人工合成目的基因 B、目的基因的检测和表达 C、将目的基因导入受体细胞 D、目的基因与运载体结合,C,6）（多选）人们利用基因工程的方法，用大肠杆菌生产人类胰岛素，这一过程涉及到（ ） A.用适当的酶对胰岛素基因与运载体进行切割并连接 B.把重组后的DNA分子导入受体细菌内进行扩增 C.检测重组DNA分子是否导入受体细菌内并表达出性状 D.筛选出能产生胰岛素的“工程菌”,ABCD,7）下列哪项不属于基因工程技术的步骤 （ ） A基因转移 B基因扩增 C基因检测 D基因表达,B,非编码区,非编码区,编码区,RNA聚合酶结合位点,外显子,内含子,终止子,基因的结构,启动子,原核,真核,