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1、-一、二、三、四、 细胞蛋白提取及定量-第 3 页五、 蛋白获取-cell裂解（冰浴操作）试剂： RIPA-cell裂解液 蛋白酶抑制剂 100 PMSF;50 Cook tail 4 loading 待裂解cell在冰上冻融，试剂配制裂解液 RIPA 100l n00l 100 PMSF 1l n = nl50 Cook tail 2l 2nl 步骤： 去除6孔板培养基，PBS洗2遍 将配制好的裂解液按照100l/well（根据细胞量来确定需要加裂解液量）混合后加入6孔板（60mm为300l），冰上裂解30min。 用细胞刮将将裂解后的cell和裂解液混合液刮净，并转移到离心管中，以1500
2、0rpm/30min/4 离心，收上清 取2l用于测量蛋白浓度，其他用作western blottiing BCA法测蛋白浓度a) 取上清2l稀释25倍（2l上清+48l H2O）置于新EP管中b) 配制标准品c) 配制工作液(# standards + # unknowns) (# replicates) (volume of WR per sample) = total volume WR required；only 200L of WR reagent is required for each sample in the microplate procedure按25l/well将标准品
3、和待测蛋白样加至96孔板中（(working range = 20-2000g/mL) If sample size is limited, 10L of each unknown sample and standard can be used (sample to WR ratio = 1:20). However, the working range of the assay in this case will be limited to 125-2000g/mL.）d) 按200l/well 将工作液加入各孔中，并在plate shaker混匀30 se) 37/30min孵育f) 冷却
4、至室温g) 酶标仪测定562nm吸光度h) 绘制标准曲线并根据曲线算出各蛋白样的浓度i) 拿出测定分析数据，算出30g蛋白所需的体积 蛋白样处理按照4:1的比例在蛋白样中加入loading buffer，混匀后100 煮10min，冷却后放置-80 保存。(为避免反复冻融使蛋白变性，可以按照测定浓度计算每次上样量，分装蛋白样。) Western bloting1、 配胶：分离胶每块5mL，先安装好后加点水看是否漏，不漏则将配好的分离胶加入，上层加、满水或异丙醇赶出气泡(水要来回加，避免胶一侧偏低) 2、 约30min后胶凝固（有分界线），将水吸出，配好浓缩胶加满，不要产生气泡，插梳子3、30-
5、60min浓缩胶凝固后，将玻璃板拿出置于电泳架子上固定（为避免跑胶时看不清分界线，可以在架子上标出分界线所在位置），中间加满1*SDS，拔出梳子，上蛋白样品，两头为marker，大约5L（小的用3，大的用2）4、 置于电泳槽中，外面加回收的电泳液至刻度线处5、 80v电泳至条带跑到分界线处，120v电泳至溴酚蓝跑出，取出架子，倒掉电泳液。6、 转膜液750mLddH2O，150mL无水甲醇，100mL 10*转膜液，将分离胶在上样处或另 一端切下一小口作为标记，同样的方向膜上也剪下一小口(膜要先放在转膜液里平衡 15min,PVDF膜还需要无水甲醇活化)7、 将胶铺在膜上，上面垫上海绵等，赶出气泡，置于电泳槽，黑对黑，100v，70min转膜8、 剪下条带所在位置（保持膜湿润PBST）置于槽中，PBST洗3遍，加入3%BSA封闭1h（或者4过夜）9、 一抗用3%BSA(或者是PBST)稀释后（1：n000）加入，4过夜10、 回收一抗，PBST洗3遍，每次5min，PBST稀释二抗（抗的是种属而不是某一种蛋白，HRP Rabbit 1:3000；HRP Mouse 1:5000）11、 加二抗，摇床慢摇，孵育1h12、 洗三次，配显影液1:1，每槽200L的量13、 上机曝光