克隆操作中使用的工具酶.ppt

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1、现在学习的是第1页，共52页现在学习的是第2页，共52页酶酶酶酶限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶逆转录酶逆转录酶DNA连接酶连接酶末端转移酶末端转移酶大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合酶聚合酶 S1核酸酶核酸酶Klenow酶酶DNA酶酶 Taq DNA 聚合酶聚合酶RNA酶酶A多核苷酸激酶多核苷酸激酶碱性磷酸酶碱性磷酸酶基因工程操作中最常用的工具酶基因工程操作中最常用的工具酶现在学习的是第3页，共52页1 1 限制性核酸内切酶限制性核酸内切酶2 2 DNADNA连接酶连接酶3 3 DNADNA聚合酶聚合酶4 4 修修 饰饰 酶酶5 5 小小 结结现在学习的是第4页，共52页酶酶主要用途主要用途限制性核

2、酸内切酶限制性核酸内切酶识别识别DNA特定序列，切割特定序列，切割DNA分子分子DNA连接酶连接酶连接两个连接两个DNA分子或片段分子或片段大肠杆菌大肠杆菌DNA聚合聚合酶酶 或或Klenow酶酶1 制作制作DNA探针；探针；2 合成合成cDNA第二链；第二链；3 填补双链填补双链DNA 3凹端；凹端；4 DNA测序。测序。Taq DNA 聚合酶聚合酶聚合酶链式反应（聚合酶链式反应（PCR）多核苷酸激酶多核苷酸激酶多核苷酸多核苷酸5-OH磷酸化，制末端标记探针磷酸化，制末端标记探针末端转移酶末端转移酶使使3-末端加同聚物尾末端加同聚物尾S1核酸酶核酸酶降解单链降解单链DNA或或RNADNA酶酶

3、在双链在双链DNA上产生随机切口上产生随机切口RNA酶酶A降解降解RNA逆转录酶逆转录酶补平反应，合成补平反应，合成cDNA或制探针或制探针碱性磷酸酶碱性磷酸酶切除核酸末端磷酸基切除核酸末端磷酸基SUMMARYHome现在学习的是第5页，共52页Home现在学习的是第6页，共52页核酸酶核酸酶（Nuclease）： 通过切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键，导致通过切割相邻两个核苷酸残基间磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶。（1）按作用对象分）按作用对象分: DNAase & RNAase（2）按断裂核酸分子不同方式分：）按断裂核酸分子不同方式

4、分： Endonuclease & Exonuclease现在学习的是第7页，共52页限制性内切核酸酶限制性内切核酸酶（restriction endonuclease): 指一类能识别双链指一类能识别双链DNADNA分子中特定核苷酸序列，分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链并在识别序列内或附近特异切割双链DNADNA的核酸内的核酸内切酶。切酶。 限制酶与甲基化酶共同构成细菌的限制酶与甲基化酶共同构成细菌的限制限制- -修饰修饰系统系统（Restriction-Modification System)。Back现在学习的是第8页，共52页命名原则：命名原则：第一个字母第一个字

5、母（大写（大写, 斜体斜体）：）： 该酶来源的微生物该酶来源的微生物属名属名；第二、三个字母第二、三个字母（小写、（小写、斜体斜体）：微生物）：微生物种名种名；若该微生物有不同的若该微生物有不同的变种和品系变种和品系，再加上该变种和品系的，再加上该变种和品系的第一个字母第一个字母（大写）（大写）若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的若从同一微生物发现多种限制性内切酶，则依照发现和分离的先后顺序先后顺序用罗马字母表示用罗马字母表示。例如：例如：EcoR 从大肠杆菌从大肠杆菌R株分离的第一种限制酶命名为株分离的第一种限制酶命名为EcoR， 其中其中E 代表属名（代表属名（Esche

6、richia)，co 代表种名（代表种名（coli)，R 代表株系代表株系（RY13），）， 代表该菌株中首次分离到。代表该菌株中首次分离到。Back现在学习的是第9页，共52页1.3.1 型限制性内切酶型限制性内切酶1.3.2 型限制性内切酶型限制性内切酶1.3.3 型限制性内切酶型限制性内切酶Back现在学习的是第10页，共52页（1 1）功能：）功能：限制、修饰限制、修饰（2 2）特点：）特点：需辅助因子需辅助因子MgMg2+2+、ATPATP和和S-S-腺苷蛋氨腺苷蛋氨酸为酸为；随机切割，随机切割，切割位点识别位点和不一切割位点识别位点和不一致，无固定切割位点；致，无固定切割位点；（3

7、 3）应用：）应用：不常用不常用。Back现在学习的是第11页，共52页（1 1）功能：）功能：限制、修饰限制、修饰（2 2）特点：）特点：需辅助因子需辅助因子MgMg2+2+、ATPATP和和S-S-腺苷蛋氨酸腺苷蛋氨酸为为；特异切割特异切割，切割位点在距识别位点，切割位点在距识别位点33端端24-26 bp24-26 bp处。处。（3 3）应用：）应用：数量很少，数量很少，无实际作用无实际作用。Back现在学习的是第12页，共52页（1 1）功能：）功能：识别并特异切割识别并特异切割DNADNA分子。分子。 即通常所指即通常所指DNADNA限制性核酸内切酶；限制性核酸内切酶；（2 2）特点

8、：）特点：仅仅需辅助因子需辅助因子MgMg2+ 2+ 作催化反应；作催化反应；特异特异切割，切割，能识别双链能识别双链DNADNA特殊序列，并产生特异片特殊序列，并产生特异片段；段；（3 3）应用：）应用：种类繁多，分子克隆中种类繁多，分子克隆中最为常用最为常用现在学习的是第13页，共52页 识别序列：长度：识别序列：长度：为为4-84-8个核苷酸的特异序列；个核苷酸的特异序列；结构：结构：且许多识别序列具且许多识别序列具回文结构回文结构，如，如HinHind d 的识别序列：的识别序列： 5 AAGCTT 35 AAGCTT 3 3 TTCGAA 5 3 TTCGAA 5 切割产生的末端切割

9、产生的末端有有粘端粘端 (cohesive/sticky (cohesive/sticky end) end) 如如BamBamH I (GGATCC) H I (GGATCC) 和和平端平端 (blunt end) (blunt end) 如如SmaSma I (CCC GGG) I (CCC GGG)现在学习的是第14页，共52页Enzyme Recognition seuqenceEnzymeRecognition seuqenceBamH IGGATCCPst ICTGCA GBgl II A GATCTSal IG TCGACEcoR IG AATTCSau3A IGATCHind

10、IIGTPy PuACSfi IGGCCNNNN NGGCCHind IIIA AGCTTSma ICCC GGGKpn IGGTAC CXba IT CTAGANot IGC GGCCGCXho IC TCGAGRecognition Sequences and Cutting sites of Restriction Endonucleases 现在学习的是第15页，共52页 定义：来源不同但能识别和切割同一位点的酶。定义：来源不同但能识别和切割同一位点的酶。又称同裂酶。又称同裂酶。如：如：BamH I 和和Bst I (G GATCC)注：有一些同功异源酶对于切割位点上的甲基化注：有一些

11、同功异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感度有所不同。碱基的敏感度有所不同。现在学习的是第16页，共52页 定义：定义：识别序列不同，但产生相同粘性末端的限制酶。识别序列不同，但产生相同粘性末端的限制酶。 如：如：BamH I : GGATCC Bgl II : AGATCTBack现在学习的是第17页，共52页(1) 活性大小：酶对活性大小：酶对DNA水解程度不同。水解程度不同。(2) 酶的活性单位：酶的活性单位： 指指1g 纯的指定纯的指定DNA在指定缓冲液中，于在指定缓冲液中，于37（最适温度更准确）（最适温度更准确）1 h完全酶解完全酶解DNA中所有该限中所有该限制酶识别位点所需的酶量

12、。制酶识别位点所需的酶量。现在学习的是第18页，共52页 DNA模板的纯度模板的纯度 DNA的甲基化程度的甲基化程度 酶切反应温度酶切反应温度 DNA的分子结构的分子结构 缓冲液缓冲液Back现在学习的是第19页，共52页2.1 定义定义2.2 种类及作用机理种类及作用机理2.3 使用时的注意事项使用时的注意事项Home现在学习的是第20页，共52页 定义：定义：可使一段可使一段DNA 3-OHDNA 3-OH末端和末端和5-P 5-P 末末端形成端形成3,5-3,5-磷酸二酯键，把两磷酸二酯键，把两DNADNA片段连片段连在一起封闭双链上形成的切口的酶在一起封闭双链上形成的切口的酶（DNA

13、DNA ligaseligase） 。现在学习的是第21页，共52页OH P53355335DNA ligaseDNA ligase DNA ligase 连接缺刻连接缺刻(nick)(nick)Back现在学习的是第22页，共52页（1）种类）种类: T4 DNA连接酶连接酶(ATP提供能量）提供能量） 大肠杆菌大肠杆菌DNA连接酶（连接酶（NAD+提供能量）提供能量）2.2 种类及作用机理种类及作用机理现在学习的是第23页，共52页（2）作用机理：）作用机理：T4 DNA ligaseBack现在学习的是第24页，共52页（1)1)不能催化两单链不能催化两单链DNADNA分子连接；分子连接

14、；（2)2)只能连双链只能连双链DNADNA分子的单链缺刻分子的单链缺刻(nick)(nick)；不能连接双链；不能连接双链中一个或多个核苷酸缺失所致缺口中一个或多个核苷酸缺失所致缺口(gap)(gap)。2.3 使用注意使用注意现在学习的是第25页，共52页DNA ligase 的活性的活性Back现在学习的是第26页，共52页3.1 DNA聚合酶聚合酶 I3.2 Klenow聚合酶聚合酶3.3 Taq DNA聚合酶聚合酶3.4 逆转录酶逆转录酶3.5 T4 DNA聚合酶聚合酶3.6 T7 DNA聚合酶聚合酶Home现在学习的是第27页，共52页活性：活性：5353聚合活性，聚合活性，535

15、3外切和外切和35 35 外切活性。外切活性。发挥生物学活性的条件：发挥生物学活性的条件：（1 1）DNADNA模板（可以是单链或双链）模板（可以是单链或双链）（2 2）带有）带有3-3-端游离羟基的引物链端游离羟基的引物链（3 3）底物和激活剂）底物和激活剂注：注：对双链对双链DNADNA，当有，当有dNTPdNTP存在时，存在时， 3535降解活降解活性会被性会被5353方向的聚合活性所抑制。方向的聚合活性所抑制。应用：应用：缺口平移法制备缺口平移法制备DNADNA分子杂交探针分子杂交探针现在学习的是第28页，共52页缺口缺口DNase IDNA聚合酶聚合酶 IDNA聚合酶聚合酶 IdNT

16、P*缺口缺口缺口平移法制备缺口平移法制备DNADNA分子探针分子探针Back现在学习的是第29页，共52页活性：活性： 53聚合活性，聚合活性，35 外切酶活性。外切酶活性。无无53 外切酶活性。外切酶活性。用途：用途： （1）填补或标记）填补或标记DNA的的3隐蔽末端；隐蔽末端； （2）催化合成）催化合成cDNA第二链；第二链； （3）DNA序列测定序列测定现在学习的是第30页，共52页EcoR I 酶切末端酶切末端同位素标记的同位素标记的EcoR I 酶切末端酶切末端- 32P-dATPBack现在学习的是第31页，共52页（1 1）显著特点：热稳定性。）显著特点：热稳定性。7070反应反

17、应2h2h残留活性残留活性90 %90 %； 93 93 反应反应 2 h2 h残留活性残留活性60% 60% ；94 94 反应反应 2 h2 h残残留活性留活性40%40%。（2 2）应用：）应用： 特定特定DNADNA片段的片段的体外扩增；体外扩增； DNA DNA测序。测序。Back现在学习的是第32页，共52页（1）定义：）定义：RNA指导下的指导下的DNA聚合酶聚合酶(reverse transcriptase) 。（2）活性：）活性：53聚合酶活性和聚合酶活性和RNaseH活性。活性。聚合作用所需模板可以是聚合作用所需模板可以是RNA或或DNA，引物是，引物是带带3-OH的的RN

18、A或或DNA。现在学习的是第33页，共52页逆转录酶的活性逆转录酶的活性现在学习的是第34页，共52页 （3）用途）用途在体外以在体外以mRNA为模板为模板合成合成cDNA；对有对有5突出末端的突出末端的DNA片段作片段作末端标记或补末端标记或补平；平；双脱氧法双脱氧法测序测序；以以DNA或或RNA为模板为模板合成核酸探针合成核酸探针。Back现在学习的是第35页，共52页（1）活性：）活性： 53聚合酶活性和聚合酶活性和35外切酶外切酶活性活性。注意：。注意：35外切酶活性对单链外切酶活性对单链DNA的的作用比对双链作用比对双链DNA强；强；高浓度高浓度dNTP 环竟下前环竟下前者活性更强。

19、者活性更强。（2）应用：标记）应用：标记DNA平末端或隐蔽平末端或隐蔽3末端末端Back现在学习的是第36页，共52页（1）活性：）活性：53聚合酶活性；有单链及双链的聚合酶活性；有单链及双链的35外切酶活性。外切酶活性。但无但无53外切酶活性；外切酶活性；（2）特点：极佳的连续合成能力）特点：极佳的连续合成能力（3）应用：）应用：长长DNA片段体外扩增；片段体外扩增；通过单纯延伸或取代合成途径通过单纯延伸或取代合成途径标记标记DNA 3末端末端；补平：补平：使双链使双链DNA 5或或3突出末端变平末端。突出末端变平末端。Back现在学习的是第37页，共52页4.1 碱性磷酸酶碱性磷酸酶4.2

20、 末端转移酶末端转移酶4.3 T4多核苷酸激酶多核苷酸激酶4.4 S1核酸酶核酸酶 Home现在学习的是第38页，共52页（1）功能：催化核酸脱）功能：催化核酸脱5-磷酸基团，使磷酸基团，使DNA或或RNA片段片段5-P末末端转换成端转换成5-OH末端。末端。（2）来源：）来源：大肠杆菌：大肠杆菌： bacterial alkaline phosphatase (BAP); 小牛肠道小牛肠道: calf intestinal alkaline phosphatase (CIP)。现在学习的是第39页，共52页碱性磷酸酶的活性碱性磷酸酶的活性现在学习的是第40页，共52页 注意：注意：CIPCI

21、P的比活性比的比活性比BAPBAP高出高出10-2010-20倍，且倍，且CIPCIP在在SDSSDS中中6868就可完全失活，就可完全失活，而而BAPBAP却是热抗性酶。却是热抗性酶。Back现在学习的是第41页，共52页（1）来源）来源: 前淋巴细胞和分化早期的类淋巴细胞。前淋巴细胞和分化早期的类淋巴细胞。（2）功能：催化）功能：催化DNA进行进行53方向的聚合作用方向的聚合作用, 。现在学习的是第42页，共52页末端转移酶的催化作用末端转移酶的催化作用现在学习的是第43页，共52页 （3 3）用途：）用途： 给外源给外源DNADNA片段和及载体加互补同聚片段和及载体加互补同聚物尾巴；物尾

22、巴； 标记标记DNADNA片段的片段的33末端。末端。Back现在学习的是第44页，共52页 （1）来源）来源: T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞。噬菌体感染的大肠杆菌细胞。 （2）功能：催化）功能：催化-磷酸从磷酸从ATP分子转移给分子转移给DNA或或RNA的的5-OH末端末端（图）。（图）。现在学习的是第45页，共52页T4 多核苷酸激酶的活性（正向反应）多核苷酸激酶的活性（正向反应）现在学习的是第46页，共52页DNA/RNADNA/RNA（单链或双链）（单链或双链）T4T4多核苷酸激酶的交换活性多核苷酸激酶的交换活性过量过量现在学习的是第47页，共52页 （3）用途：）用途： 使缺失使缺失

23、5-P末端的末端的DNA发生磷发生磷酸化作用；酸化作用； 标记标记DNA的的5-末端。末端。Back现在学习的是第48页，共52页（1 1）来源：）来源：来源于稻谷曲霉来源于稻谷曲霉（Aspergillus oryzae）（2 2）功能：切割单链，）功能：切割单链，又称特异单链核酸内切酶又称特异单链核酸内切酶（3 3）应用注意：对双链）应用注意：对双链DNADNA、双链、双链RNARNA和和DNA-RNADNA-RNA杂交体不敏感。杂交体不敏感。现在学习的是第49页，共52页S1S1核酸酶的活性核酸酶的活性现在学习的是第50页，共52页 （4 4）用途：）用途：测定真核基因中间隔子序列位置；测定真核基因中间隔子序列位置；去除去除DNADNA片段中突出的单链尾巴；片段中突出的单链尾巴；打开打开cDNAcDNA合成时形成的发夹环。合成时形成的发夹环。Back现在学习的是第51页，共52页感谢大家观看感谢大家观看现在学习的是第52页，共52页