《动物细胞培养的应用.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《动物细胞培养的应用.ppt（22页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、动物细胞培养的应用,表1 动物细胞培养的产物,表2 微生物和动物细胞培养方法的比较,与微生物细胞培养类似，动物细胞的体外培养有两种类型：一类是非贴壁依赖性细胞，这类细胞可以采用与微生物培养类似的方法进行悬浮培养；另一类是贴壁依赖性细胞，它们需要附着于带适量电荷的固体或半固体表面上生长。,5、动物细胞大规模培养工艺,大规模动物细胞培养的工艺流程如图11-15所示。工艺过程中，先将组织切成碎片，然后用溶解蛋白质的酶处理而得到单个细胞，再用离心法收集细胞。将细胞植入营养培养基，使细胞在培养基中增殖到覆盖瓶壁表面，用酶把细胞从瓶壁上消化下来，再接种到若干培养瓶中进行扩大培养，将培养所得的细胞“种子”冷
2、藏于液氮中，从液氮中取出一部分细胞“种子”进行解冻、复活培养，进行扩大培养以获得足够的细胞量，将细胞接种于大规模生物反应器中进行大规模培养，按照产物的不同形式进行产物分离纯化。对于积累在细胞内的产物，可通过收集细胞后进行破胞，再经过分离纯化获得产物；对于由细胞分泌到培养液中产物，可以通过浓缩、纯化培养液来获得产品；而对于那些必须加入诱导剂进行培养或病毒感染培养才能得到的产物的细胞，可加入上述诱导剂诱导或病毒感染后，收集细胞，再经分离纯化得到产物。,图11-15 大规模动物细胞培养工艺流程图,细胞培养反应器,提取,细胞,诱生剂,细胞,产品（肿瘤抗原）,纯化,产品（干扰素）,纯化,提取,产品（单克
3、隆抗体）,浓缩纯化,7,9,8,6,5,4,3,2,1,10,内容（一）,单克隆抗体,哺乳动物细胞中有一套复杂的防御系统保护自己不受有毒物质和病原物的侵害，其中一部分防御反应就是淋巴细胞经诱导产生特异的蛋白，这些蛋白可以在其他免疫系统蛋白的帮助下与外来物质结合，并抵消其生物学功能。这些特异的蛋白，就是抗体；相对于抗体，诱发产生抗体的外来物质即称为抗原。 抗体最早是由德国微生物学家贝林发现的，它们存在于人和脊椎动物的血清之中，是这些生物体内免疫系统的重要组成成分。由于抗体分子具有极其精确的结合特异性，可以识别各种不同的抗原，还可以激活细胞的其他防卫系统以消灭抗原，因此抗体在基础研究和临床诊断中获
4、得了广泛的重视和应用。随着杂交瘤技术、蛋白质工程和转基因技术等技术的发展，抗体已逐步在疾病治疗等应用领域显示出越来越广阔的应用前景。,抗体,由B细胞产生的免疫球蛋白，它能识别抗原的某一特定位点。抗体分子由两个完全相同的重链分子以及两个完全相同的轻链分子组成。存在于人或哺乳动物的血清之中。,抗原,指诱导产生抗体的物质。,如前所述，抗体分子是免疫系统反应的一个重要组分，因为抗体分子可以识别各种不同的外来抗原，同时可激活宿主的防卫系统。 对于一个免疫刺激（有毒物质或病原物侵入，即抗原），每一个淋巴细胞都会合成并分泌一种单个的抗体，这些抗体可以高度特异地识别免疫抗原的特定区域，也就是抗原决定簇。由于一
5、个抗原通常都有几个不同的抗原决定簇，因此每个免疫淋巴细胞都可能产生一种针对某一个抗原决定簇的抗体，这些由同一抗原而产生的不同的抗体统称为多克隆抗体。,有毒物质或病原物侵入，即抗原,侵入,抗体2,抗体1,于是，人们认识到要把抗体应用于临床诊断或是治疗，必须要制备单一类型的只对某一特定抗原决定簇的抗体分子，也就是单克隆抗体。,多克隆抗体,在一个血清样品中包含了对同一抗原分子上不同抗原决定簇的多种抗体。,单克隆抗体,由杂交瘤细胞系产生的针对某一特定抗原决定簇的单一类型的抗体。,补充,要根据糖基化的结构，选择适宜的细胞系糖代谢特点，氨基酸代谢特点，选择适宜的细胞系。,动物细胞制药的表达系统与特征 昆虫
6、系统、哺乳动物细胞系统，最成功、重要表达活性外源蛋白的有效系统，应用于药物蛋白质的表达。 一、哺乳动物细胞表达系统与特征 1. 动物细胞的特征 细胞膜、 细胞质和细胞核，没有细胞壁。亚细胞器，功能独特。,内容（二）,2哺乳动物细胞株系 CHO细胞：中国仓鼠卵巢中分离的上皮样细胞系，贴壁型生长，是目前使用最为普遍和成熟的表达糖基化蛋白药物的宿主细胞。核型为亚二倍体，分泌表达外源蛋白，而内源蛋白分泌很少。贴壁型生长细胞，但可进行悬浮培养，对剪切力和渗透压有较高的忍受能力。蛋白质翻译后的修饰准确，表达产物的结构、性质和生物活性接近天然。 有多种衍生突变株应用于药物的生产，培养时需要添加脯氨酸。二氢叶
7、酸还原酶缺陷株表达的药物有tPA、EPO、HBsAg疫苗、G-CSF、凝血因子、DNA酶，已上市。 使用氨甲酰喋呤，增加外源基因的拷贝数，提高蛋白质表达水平。,BHK21：幼仓鼠肾脏中分离的成纤维样细胞，非整倍体。用于增殖病毒、制备疫苗和重组蛋白。BHK-21表达的重组凝血因子已被获准上市。 C127：从小鼠乳腺肿瘤中分离获得的上皮样细胞，贴壁型生长。C127细胞系已表达多种外源基因，其中EPO的水平达10 mg/L，生产rhGH已被批准上市。 3T3：HIN Swiss小鼠胚胎培养物中分离建立的连续细胞系，能大量表达外源蛋白，广泛用于药物毒理学研究。 骨髓瘤细胞：J558L是小鼠BALB/c
8、骨髓瘤细胞，分泌IgA，用于转染研究。NSO和SP2/OAg14不分泌Ig，与淋巴细胞融合筛选杂交瘤，分泌制备特异性抗体。,杂交瘤细胞：从小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞的融合细胞中分离获得杂交瘤细胞系，能在无血清培养基中高密度悬浮生长，容易转染和生长，能进行糖基化等加工修饰，大量分泌和高效表达。很多杂交瘤细胞系用于抗体的制备。 Vero：从成年非洲绿猴肾中分离获得的贴壁型成纤维细胞，多倍体核型，能适应灌流操作，进行连续培养。已有突变细胞系能用无血清培养。最为常用Vero E6增殖多种病毒，如脊髓灰质炎、狂犬病毒、乙脑病毒等，生产病毒性疫苗，已被批准用于人体。也可作为转染的宿主细胞，用于表达外源基因的蛋
9、白质药物和病毒的检测。 COS：是从SV40 DNA转化的非洲绿猴肾细胞CV1中分离得到的，广泛用于外源基因瞬时表达的研究。 GH3用于生长激素研究，293细胞系用于基因治疗的研究。,3昆虫细胞株系 Sf21：从秋粘虫卵巢细胞中分离得到，细胞较大，容易放大，高效表达外源基因。 Sf9：从秋粘虫的卵巢细胞（SF21）中分离得到，是最常用的昆虫表达细胞。对杆状病毒高度敏感，生长快，能高效表达外源基因。抗机械剪切，能在无血清培养基的搅拌反应器中生长。 TN-5B1-4：从粉纹夜蛾卵细胞匀浆中分离得到，无血清培养，快速倍增。分泌表达重组蛋白的能力比Sf9细胞系高20多倍，能适应悬浮培养。,三、细胞转染
10、 转染（是将外源基因导入哺乳动物细胞的技术通用名称。基因导入真核细胞的方法很多，主要有化学转染、物理转染和病毒介导的转化。,生物转染特点,化学转染是最常用的转染方法。 其基本原理是磷酸钙、二乙氨乙基（DEAE）葡聚糖（dextran）和阳离子树脂与核酸形成复合物，附着于细胞表面，通过细胞的内吞作用进入细胞。 磷酸钙与DNA形成不溶性沉淀，带正电荷的DEAE葡聚糖与带负电荷的DNA磷酸基团结合，阳离子树脂包裹DNA形成脂质体。 渗透性休克和DMSO等化学试剂能促进DNA进入细胞。转染试剂盒商业化供应，特别是脂质体材料的转染试剂。 影响因素：细胞培养物的密度、DNA的大小、纯度与用量、化学试剂的用量与处理时间、促进剂的使用等。,化学转染的特点,四、转染体筛选与分离 转染后16天收获细胞，进行核酸分子杂交或蛋白质杂交，检测外源基因的瞬时表达。 为了获得稳定整合的细胞系，先在非选择性培养基上培养2448小时，让细胞倍增12代，使转染DNA表达。再按1：15比例转移到选择性培养基上，每24天更换培养基，持续23周，促进抗性细胞生长，清除死细胞残骸，最后得到独立的克隆。 在转染中大约有万分之一的细胞将稳定整合外源基因，因此需要显性选择标记来分离转染细胞。 哺乳动物细胞的选择标记，使用与之相对应的选择剂。,