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1、-环境毒理学实验-第 10 页环境毒理学实验姓名:吴天真班级：生物1501学号：201547005队友：高秋远 梁旭 实验一 污染物对藻类的生长抑制作用一、实验目的1. 了解藻类的生长规律；2. 掌握藻类的培养方法；3. 掌握化学物质对单细胞绿藻生长影响的评价方法。二、实验内容1. 运用毒理学实验方法，观察藻类在含有化学污染物的水环境中的生长抑制情况；2. 求出受试化合物对藻类生长抑制的EC50；3. 阐明受试化合物的剂量效应关系与生长抑制特征。三、实验原理单细胞藻类个体小、世代时间短，是水体中的初级生产者。因为可在短期内获得化学物质对其许多世代及种群水平上的影响，所以利用污染物对藻类生长的抑
2、制作用，能反映污染物水平对水体中的初级生产者的作用情况。通过将不同浓度的受试物加到属于对数生长期的藻类中，在规定的实验条件下继续培养，每隔24 h 测定藻类种群的浓度或生物量，以观察受试物对藻类生长的抑制作用。经方差分析或t 检验，显著低于对照(p 0.05)的生长率表明藻类生长受到抑制。四、实验仪器和试剂1. 受试物研究藻类生长抑制实验的受试物应当是挥发性低、环境稳定性好且可溶于水的物质。如果需要助溶剂，它在水中的浓度不能超过0.1 mL/L。2. 藻种斜生栅藻(Scenedesmus obliquus)或蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)。3. 培养基藻类的培养基很
3、多，其成分和浓度各不相同，小球藻和栅藻可用“水生4 号”培养基培养。配制培养基时可将营养盐类按所需浓度直接加入无菌蒸馏水或去离子水中。应按顺序逐个加入，待一种盐类完全溶解后再加另一种。亦可先配制各种营养盐类的浓度储液，经灭菌后避光冷藏保存。当需要配制营养基时，将一定量的浓储备液摇匀，依次加入到蒸馏水或去离子水中即可。 *取少量菜园土，加2-3 倍自来水，煮沸10 余分钟，冷却后用滤纸过滤即可使用。4. 实验器材电子天平(2 台)、立式压力蒸汽灭菌器(2 台)、无菌操作台(4 台)、显微镜(4 台)、生化培养箱(2 台)、pH 计(4 套)、气浴恒温摇床(4 台)、可见分光光度计(4 台)、数字
4、照度计(2 台)、血球计(4 套)、血小球记数板(200 块)、4 到7 只30W 的普通白色荧光灯、60 漏斗(4 个)、锥形瓶、温度计、滤纸和纱布等若干。5. 实验药品硫酸铵、磷酸二氢钙、碳酸氢钠、氯化钾、硫酸镁、氯化铁均为分析纯，土壤浸出液。五、实验步骤1. 藻类培养培养温度为：242 ；白色荧光灯均匀光照，光照强度为4000400 lux，连续光照或以12：12 或14：10 光暗比光照；机械震荡(10010 次/min)；培养容器用棉塞、滤纸、纱布(2-3 层)或锡箔纸等封闭，对挥发性化学物质采用磨口玻璃瓶塞完全封闭。可根据实验需要选择容量不同的实验容器，125 mL 锥形瓶中测试液
5、的体积为40-60 mL；250 mL 锥形瓶中测试液体积为70-100 mL；500 mL 锥形瓶中测试液的体积为100-150 mL。2. 藻试液的配制从储备液中取出一定的藻液，接种到新鲜的无菌培养液中，接种浓度约为 105 个/mL。在与试验要求相同的条件下进行预培养，要求在2-3 天内藻类能达到对数生长，然后再次转移到新鲜的培养液中。如此反复转接培养2-3 次，藻类生长健壮并开始处于对数生长期时即可用来制备实验中需要的藻类试验液。3. 受试物试验液的配制根据初步试验确定产生效应的浓度范围，至少设置五个构成对数间距系列的浓度，浓度比不超过2.2。较佳的浓度范围为，最低测定的浓度必须对藻类
6、生长影响较小(如生长抑制率10%)，最高测定浓度对藻类生长的抑制率接近100%。至少设置3个平行样，每一系列设一个对照。实验前应测定受试液的pH，必要时用盐酸或氢氧化钠溶液将pH调到7.50.2。试验结束时应测定被测物质的实际浓度。4. 测试液的配制先在每个试验锥形瓶中加入10 mL藻液，再加10 mL受试物溶液。对照组只加10 mL培养液。将各瓶摇动混匀后，放入光照培养箱中培养。实验开始后，每隔24h(即在24，48h)测定各组藻类的细胞密度。六、实验结果1. 藻类生长的测定藻类生长是指在试验期间每毫升溶液中藻类细胞数目的增加量。一般用以下三种方法测定藻类的生长：细胞计数；测光密度；测叶绿素
7、含量。推荐使用方法和。2. 数据处理将不同浓度试验培养液和对照培养液的藻细胞浓度与测试时间绘制成曲线图，再用下面方法确定浓度效应关系。生长率是单位时间内(tn-t1)藻类细胞增长的量(Nn-Nt)。对数生长期的藻类平均特定生长率可用下式计算：（1）式中：藻类平均生长率；t培养时间，t1为起始时间，tn为终了时间；N藻类细胞生长量，N1为起始细胞数，Nn为最终细胞数。以不同浓度组中藻类生长率的下降比例与对数浓度作图，可直接从图上读出EC50，再标明测定时间，如24 h EC50。也可求出回归关系式，再算出EC50。表2 实验记录表格根据直线内插法或概率单位图解法估算24 h、48 h和72 h藻
8、类生长受到抑制的EC50。测得的实验数据如下：生物量单位：105个/mL根据直线内插法或概率单位图解法估算24 h、48 h和72 h藻类生长受到抑制的EC50:24h EC50=3.35 七、注意事项1. 在正式试验前必须进行必要的预试验。2. 实验藻种的选择和预培养应注意：藻细胞大小均匀，颜色鲜绿，处于对数生长期。试验开始3天内，对照组藻细胞浓度至少应增加16倍。3. 需要明确受试化合物的理化特性，有针对性的进行实验。八、讨论与思考1.干扰藻类EC50正常测定的因素有哪些？（1）各锥形瓶在培养箱内的位置不同，受光程度不同，导致藻类生长情况受影响。（2）在藻类培养过程中，部分藻类沉淀，影响受
9、光（3）测定吸光度时，藻液未混合均匀，导致测得的数据与实际不符、2.受试物质对藻类的生长在不同时期起的作用有何不同？有无促进作用？随着时间增加，高浓度抑制作用加强，低浓度促进作用加强。3.根据实验结果，提示进一步开展哪方面的研究？可进行以下几个方面的研究：（1） 探究受试物影响藻类生长的具体原因；（2） 探究该受试物是否对其他植物有类似的左右；（3） 实验成果的具体应用。实验二 污染物对发光细菌的急性毒性测试发光菌毒性测试是 20 世纪70 年代后兴起的一种微生物监测环境污染及检测污染物毒性的新方法。1978 年美国 Beckman 公司即推出功能完备的生物发光光度计“Microtox”，自此
10、，这一急性毒性测试技术在世界范围内迅速推广。因此人们也将发光菌毒性测试称为Microtox 测试。采用现代光电检测手段(生物发光光度计)的发光菌生物毒性实验是毒理学中生物测定的方法之一。 该方法快速、简便、灵敏、廉价,在有毒物质的筛选，环境污染生物学评价等方面有重要的意义，因而备受各国有关研究者的关注。1995 年3 月，国家环境保护局、国家技术监督局将发光菌毒性测试定为水质监测标准方法(GB/T 15441-1995)。一、实验目的1. 掌握发光细菌毒性测试的标准方法；2. 根据发光细菌发光强度的变化判断受试化合物的毒性；3. 初步了解发光细菌毒性测试的影响因素。二、实验内容1. 发光细菌的
11、复苏；2. 发光细菌发光强度的测定；3. 受试化合物毒性的计算。三、实验原理发光细菌是一种非致病性的普通细菌，具有发光能力，在正常条件下经培养后能发出肉眼可见的兰绿色光，这种发光过程是细菌体内一种新陈代谢反应，是氧化呼吸链上的一个侧支。发光细菌的发光反应模式图(1)所示。发光细菌发光反应途径可简单概述为：FMNH2O2RCHO荧光FMNH2O+RCOOH (1)这个发光现象是呼吸代谢耦合，作为光能被散发。当细菌体内合成萤光酶、萤光素、长链脂肪醛时，在氧的参与下发生生化反应，反应的结果便产生光。发光菌的发光现象是其正常的代谢活动, 在一定条件下发光强度是恒定的，与外来受试物(无机、有机毒物, 抑
12、菌、杀菌物等) 接触后, 其发光强度即有所改变。变化的大小与受试物的浓度呈相关关系, 同时与该物质的毒性大小有关。通常认为外来受试物通过下面两个途径抑制细菌发光: (1) 直接抑制参与发光反应的酶类活性; (2) 抑制细胞内与发光反应有关的代谢过程(如细胞呼吸等)。毒物的毒性可以用EC50 表示, 即发光菌发光强度降低50% 时毒物的浓度。实验结果显示, 毒物浓度与菌体发光强度呈线性负相关关系。因而可以根据发光菌发光强度判断毒物毒性大小, 用发光强度表征毒物所在环境的急性毒性。图 (1) 发光细菌的发光反应模式。E1: 细菌荧光素酶，由、 2 个亚基组成， 为40000-42000D， 为37
13、000-39000D。单独、 亚基均无发光活性，只有、 共存时才有活性。E2: NADH：FMN 氧化还原酶，分子量为3000D，对FMN 有高度特异性。E3: 脂肪酸还原酶。四、实验仪器与材料1. 试剂：氯化汞（分析纯）；氯化钠（化学纯）；蒸馏水。氯化钠溶液，2.0 g/100 ml (3.0 g/100 ml)，称取2.0 g (3.0 g)氯化钠溶于100ml 蒸馏水中，置于2-5冰箱备用。氯化汞母液，2 000 mg/L，万分之一分析天平精称密封保存良好的无结晶水氯化汞0.1000 g 于50 ml 容量瓶中，用3.0 g/100ml 氯化钠溶液稀释至刻度，置于2-5冰箱备用，保存期6
14、 个月。氯化汞工作液，2.0 mg/L，用移液管吸取氯化汞母液10 ml 入1000 ml 容量瓶，用3.0g/100ml 氯化钠溶液定容。再用移液管吸取氯化汞20 mg/L 液25 ml 入250 ml 容量瓶，用3.0 g/100 ml 氯化钠溶液定容，将此液倒入配有半微量滴定管的试液瓶，然后，用3.0 g/100 ml氯化钠溶液将氯化汞2.0 mg/L 溶液按表1 稀释成系列浓度(稀释至50 ml 容量瓶中)。配制的稀释液保存期不超过24 小时。2. 明亮发光杆菌T3 小种 (Photobacterium phosphoreum T3 spp.)冻干粉，安培瓶包装，在2-5冰箱内有效保存
15、期为6 个月。新制备的发光细菌休眠细胞(冻干粉)密度不低于每克800万个细胞；冻干粉复苏2 min 后即发光，可在暗室内检验，肉眼可见微光，稀释成工作液后，经稀释平板法测定，每毫升菌液不低于1.6 万个细胞(5 毫升测试管)或2 万个细胞(2 毫升测试管)。在DXY-2 型毒性测试仪上测出的初始发光量应在600-1900 mV之间，低于600 mV 允许将倍率调至“X2”档，高于1900 mV 允许将倍率调至“X0.5”档。仍达不到标准者， 更换冻干粉。发光细菌的毒性实验在美国Maxwell（MSI.） LuminMax-C 冷光仪完成。发光细菌的复苏：从冰箱内取出含有0.5 g 发光细菌冻干
16、粉和氯化钠溶液，置于含有冰块的小号保温瓶，用1 ml 注射器吸取0.5 ml 冷的氯化钠2.0 g/100 ml 溶液(适用于5ml 的测试管)或1 ml 冷的氯化钠2.5溶液(适用于2 ml 的测试管)注入冻干粉中，充分混匀。2 min 后菌即复苏发光，可在暗室观察，肉眼可见微光。备用。发光细菌的培养：(1) 培养液：酵母浸出汁5.0g，胰蛋白胨5.0g，NaCl 30.0g，NaHPO4 5.0g，KH2PO4 1.0g，甘油3.0g，加蒸馏水至1000ml,pH 调至70.5，趁热分装于150ml 三角瓶中，每瓶约50ml，塞上棉球，用牛皮纸包扎好，经115、20-30min 高压蒸汽灭
17、菌后置于4左右冰箱中备用。(2) 固体培养基：取上述培养液100ml，加入-2g 琼脂粉，电炉加热使溶解至透明，调节pH 值为70.5，趁热用漏斗分装于试管中，每支试管各约10ml，塞上棉球，用牛皮纸包扎好，经121高压灭菌20-30min 后，取出制成斜面。(3) 斜面菌种培养：将发光菌冻干粉用0.5ml 3%NaCl 溶解，迅速转入50ml 培养液中，20恒温培养，每24h后转接一次斜面，将培养好的第三代斜面置4冰箱中备用。(4) 摇瓶菌液培养：将培养好的第三代新鲜斜面菌种T3 接入装有50ml 培养液的150ml 锥形瓶中，接种量不得超过一接种环，于20振荡(180r/min)培养12h
18、(即对数生长期)后备用。(5) 工作菌液培养：吸取一定量刚培养好的摇瓶菌液，用3%的NaCl 溶液稀释并磁力搅拌均匀。控制对照(2.0ml 3%NaCl 溶液+0.1ml 工作菌液)发光强度300mv-900mv。3. 仪器：生物发光光度计，配制2 或5 ml 测试管，当氯化汞标准液浓度为0.10 mg/L 时，发光细菌的相对发光度为50，其误差不超过10。2 或5 ml 测试样品管，具标准磨口塞，为制造比色管的玻璃料制作，由专业玻璃仪器厂制造，分别适用于相应型号的生物放光光度计。注射器(1 ml)、微量注射器(10 l)、定量加液瓶(5 ml)、吸管(2、10、25 ml)、试剂瓶(100
19、ml)、量桶(100、500 ml)、棕色容量瓶(50、250、1000 ml)、半微量滴定管(配磨口试液瓶，全套仪器均为棕色，10 ml)等若干。五、测定在预实验的基础上，将待测物配成 5-7 个浓度梯度，各取不同浓度梯度溶液2ml 加入具塞磨口比色管中，取0.2ml 工作菌液与各比色管中，加塞上下振荡摇匀，去塞，暴露15min，以2ml3%的NaCl 溶液做空白对照。测发光强度。每个浓度梯度设3 组平行。六、实验结果受试化合物的毒性作用用发光细菌的发光强度相对抑制率表示。计算公式如下： (2)光强的相对抑制率与毒物毒性的大小成正比。通常用发光细菌光抑制50的受试化合物浓度来表征其毒性效应(
20、EC50)。将计算的光相对抑制率与受试化合物的浓度进行回归分析，根据所得回归方程可求出相应的EC 值七、注意事项1、实验前判断发光细菌是否符合测试要求。2、平行或批处理样品的处理与测试应注意操作时间的一致性。八、讨论与思考1. 测试结果误差的主要来源？加液时间差导致各组暴露时间不同。2. 测试过程中，暴露时间、温度以及体系的pH 等对发光细菌的发光特性是否有影响，及影响如何？暴露时间过长，温度过高，pH过酸过碱均会抑制发光菌发光特性3. 与藻类生长抑制实验结果进行比较讨论。FH-53B在某浓度范围对藻类生长有促进作用，氯化汞只对发光菌有抑制作用。实验三 小鼠骨髓细胞微核试验一、实验目的主要通过
21、检测哺乳动物骨髓细胞中嗜多染红细胞（PCE）的微核出现率，间接反映骨髓细胞染色体畸变发生率的高低，从而判断受试动物是否具有致突变作用。主要用于测试干扰细胞有丝分裂的物质。二、实验内容1.PCE 的涂片制作及观察；2. 计算PCE 的微核发生率；3. 受试化合物毒性的判定。三、实验原理微核试验是用于染色体损伤和干扰细胞有丝分裂的化学毒物的快速检测方法。微核是指存在于细胞中主核之外的一种颗粒，大小相当于细胞直径的1/20-1/5，呈圆形或杏仁状，其染色与细胞核一致在间期细胞中可以出现一个或多个。一般认为微核是细胞内染色体断裂或纺锤丝受影响而在细胞有丝分裂后期滞留在细胞核外的遗传物质。所以微核试验能
22、检测化学毒物或物理因素诱导产生的染色体完整性改变和染色体分离改变这两种遗传学终点。微核可以出现在多种细胞中，但在有核细胞中较难与正常核的分叶及核突出物相区别。红细胞在成熟之前最后一次分离后数小时可将主核排出，而仍保留微核于PCE 细胞中，因此通常计数PCE 细胞中微核。四、实验仪器和试剂1. 仪器手术刀、手术剪、无齿镊、小型弯止血钳、干净纱布，带橡皮头吸管、台式离心机、刻度离心管、晾片架、电吹风机、玻璃染色缸、2ml 注射器及针头、载玻片及推片、定时钟、带油镜头显微镜细胞计数器。2. 试剂甲醇（分析纯）、甘油（分析纯）、小牛血清、生理盐水、吉姆萨 (Giemsa) 储备液、pH6.8的磷酸盐缓
23、冲液。Giemsa 储备液的制备取Giemsa 染料1g，甘油66ml，甲醇60ml。先将染料置于研钵内，加入小量甘油混合研细，置60C 水浴2h，取出待冷却后加入甲醇，混合静置2 周后，过滤于棕色瓶内，存放阴凉处。该贮备液存放的时间越长，染色效果越好。临用时用Ph6.4 的磷酸盐缓冲液配置为10%的使用液。pH6.8 的磷酸盐缓冲液a.甲液1/15mol/L 磷酸二氢钾（KH2PO4）。称取9.06g KH2PO4（分析纯），用蒸馏水溶解后定容至1000ml。b.乙液1/15mol/L 磷酸氢二钠（Na2HPO4）。称取9.45g Na2HPO4（分析纯）（含2、7和12 份结晶水时，则分别
24、称取11.89g、17.87 g 和23.88g），用蒸馏水溶解后定容至1000ml。c.pH6.8 的磷酸盐缓冲液。分别取50.40mL 的甲液和49.60mL 的乙液，将两者混合均匀。阳性对照物环磷酰胺或丝裂霉素C五、实验步骤动物选择一般情况下，选择大鼠或小鼠作为微核实验的实验动物。本实验选择小鼠。小鼠体重18-20g。每组小鼠数量为10 只，雌雄各半。染毒途径根据实验目的和受试化合物的性质，可选择经口、经皮、经呼吸道及注射等染毒方式。原则上微核实验尽可能采用与人类实际接触受试环境毒物相同的染毒途径。染毒次数及取样时间不同的环境毒物诱发微核出现的高峰时间差异很大。一般采用4 次连续染毒比较
25、方便、合理。最后一次染毒后，经过24h，取小鼠骨髓样品，制作骨髓涂片。剂量选择最高剂量组受试环境毒物的剂量一般采用该毒物的而最大耐受量。也可根据受试化合物的1/2 LD50 作为最高剂量。在此以下再设3-5 个剂量组。同时，还应该设立阳性对照组和阴性对照组。阳性对照组腹腔注射一次或二次环磷酰胺（50-100mg）或丝裂霉素C（100mg/kg）。阴性对照组使用等体积的溶剂。2. 骨髓液的制备和涂片最后一次染毒后，经过24h，用颈椎脱臼或乙醚麻醉的方法处死动物，迅速取下胸骨，剔去肌肉，剪去每节骨骺端，用小型弯止血钳挤出骨髓，点在清洁载玻片一端事先滴好的一滴小牛血清上，混合均匀后推片。阳性及阴性对
26、照组按上述方法同时进行处理。3. 固定将推好晾干的骨髓涂片放入玻璃染色缸中，用甲醇溶液固定15min，取出晾干。4. 染色将固定晾干后的骨髓涂片，用新鲜配制的吉姆萨使用液染色10-6.98）冲洗载玻片上的染色残液，晾干。5. 观察计数镜检先以低倍镜、高倍镜粗检，选择细胞完整、分布均匀和染色良好的区域，再以油镜检查计数。可用细胞形态是否完好，作为判断制片优劣的标准。嗜多染红细胞（PCE）呈灰蓝色，成熟的正染红细胞（NCE）呈粉红色。细胞中微核多数呈圆形，边缘光滑整齐，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可出现一个或多个微核。计数200 个PCE中含微核的PCE 数。六、实验结果分析与评
27、价微核率以千分率表示，实验组微核率与阴性对照组进行统计学比较，评定受试化合物的致突变性。1. 阳性判断标准实验组中至少有一个剂量组微核阳性率显著高于对照组，而且实验结果还具有重现性；具有剂量-反应关系。2. 阴性判断标准由于实验剂量不够，染毒次数不合适，计数的细胞数不足，实验动物自发微核率高等原因，均可以使实验结果出现阴性。当实验设计符合标准，实验剂量足够大，染毒次数足够时，实验结果仍为阴性，方可认为受试化合物微核实验为阴性。计数200个PCE，6个有微核阴性：1-5，阳性：3%七、注意事项1.实验所用的仪器必须干净，小牛血清无污染；2.骨髓涂片上，细胞疏密程度要合适，细胞之间互不重叠；3.正
28、确区分微核和涂片上的异物；4.实验动物年龄不宜过大。八、讨论与思考1. 制作涂片过程中，有哪些因素可能会影响到之后的微核观察？（1）骨髓取得过多，导致细胞重叠。（2）小鼠的毛发或其他组织细胞沾染了载玻片。（3）血清滴太少，导致推片时无法覆盖载玻片。（4）未固定细胞便进行染色，导致细胞被冲去。（5）冲洗过度，导致细胞被冲去。2. 根据实验结果对受试化学物的毒性进行讨论。该化学物遗传毒性显著，使小鼠的骨髓细胞微核率较阴性对照组有明显提高。反思与总结这次实验进行过程中出现了一些问题问题：一是第二次测藻液荧光强度时，个别藻液未摇匀，导致测得的结果偏大：二是小鼠骨髓涂片染色后冲洗时冲洗过度，导致大量细胞被冲去。通过这次实验，我有很大收获，了解了环境毒理学方面的一点基本知识，同时也提高了自己的实验操作技巧，学到了很多。感谢刘薇老师的指导和教诲，感谢学姐的指点与帮助，同时感谢队友高秋远同学和梁旭同学的协作与配合，谢谢你们!