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1、-现代生物学进展-第 13 页王立安：电泳技术原理一、概 述电泳：指带电胶粒或大分子在外加电场中，向着与其电荷相反的电极做定向移动的现（electrophoresis EP）。生物分子都带电荷，其电荷的多少取决于分子性质及其所处介质的pH及其组成。由于混合物中各组分所带电荷性质、电荷数量以及分子量的不同，在同一电场的作用下，各组分泳动的方向和速度也各异。因此，在一定时间内各组分移动的距离不同，从而达到分离鉴定各组分的目的。 1808年Reuss（俄国）首次发现电泳现象。1937年，瑞典科学家Tiselius设计了世界上第一台电泳仪，建立了移界电泳法（moving boundary EP），将血
2、清蛋白分为了5个组分，并于1948年荣获诺贝尔奖。20世纪50年代，以支持介质为主的电泳模式不断涌现，如滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉薄膜等。60年代以后发展了以凝胶为主的支持物的电泳方法，如聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶电泳等。1967年Shapiro A L等在凝胶电泳的基础上建立了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳技术。70年代以后根据不同需要推出了多种电泳模式，如圆盘电泳、垂直板电泳、双向电泳、脉冲电泳、等电聚焦电泳、印迹转移电泳等技术。90年代又推出了分辨率极高的高效毛细管电泳。长期以来，电泳技术围绕制胶、电泳、染色三个技术环节，不断改进，以期实现下列目标：1、提高分辨率及灵敏度。2、简化操作，缩短
3、电泳时间。3、扩大应用范围。目前，各类电泳技术已广泛应用于生命科学各个领域。1. 电荷来源物质带电是一普遍现象。任何物质由于其自身的解离作用或表面上吸附其他带电质点均表现带电。两性电解质的带电与pI有关。如氨基酸、蛋白质、核酸。电泳过程必须在一种支持介质中进行。Tiselius等在1937年进行的自由界面电泳没有固定支持介质，所以扩散和对流都比较强，影响分离效果。后来出现了固定支持介质的电泳，样品在固定的介质中进行电泳，减少了扩散和对流等干扰作用。2. 支持介质最初的支持介质是滤纸和醋酸纤维素膜，目前这些介质在实验室已经应用得较少。在很长一段时间里，小分子物质如氨基酸、多肽、糖等通常用滤纸或纤
4、维素、硅胶薄层平板为介质的电泳进行分离、分析，但目前则一般使用更灵敏的技术如HPLC等来进行分析。这些介质适合分离小分子物质，操作简单、方便。但对于复杂的生物大分子则分离效果较差。凝胶支持介质的引入大大促进了电泳技术的发展，使电泳技术成为分析蛋白质、核酸等生物大分子的重要手段之一。最初使用的凝胶是淀粉凝胶，目前使用得最多的是琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。蛋白质电泳主要使用聚丙烯酰胺凝胶。3. 电泳装置电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。凝胶电泳系统主要包括电泳仪、电泳槽及附属设备三大类。根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类：(1)常压
5、电泳仪(600V)：用于净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；(2)高压电泳仪(3000V)：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序；(3)超高压电泳仪(30000-50000V)：用于毛细管电泳。3. 电泳装置电泳装置主要包括两个部分：电源和电泳槽。电源提供直流电，在电泳槽中产生电场，驱动带电分子的迁移。凝胶电泳系统主要包括电泳仪、电泳槽及附属设备三大类。根据电泳仪的电压设计范围可将其分为三类：(1)常压电泳仪(600V)：用于净电荷和SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；(2)高压电泳仪(3000V)：用于载体两性电解质等电聚焦电泳和DNA测序；(3)超高压电泳仪(30000-50000V)：用于
6、毛细管电泳。电泳槽 根据电泳种类不同，对电泳槽的设计也不一样。电泳槽主要有自由界面电泳槽、管状电泳槽、板式电泳槽。 (1)自由界面电泳槽 Tiselius设计的自由界面电泳槽，是一个U形玻璃管，在U形管下部放待分离的蛋白溶液，管臂联接到电极上，在电场的作用下，缓冲系统中蛋白质界面的移动可用光学系统“纹影法(schlieren)”照相，得到电泳图谱。这种电泳槽目前已不使用。但90年代初发展起来的高效毛细管电泳就是根据自由界面电泳槽的原理而设计的。(2)管状电泳槽 50年代末商品圆盘电泳槽问世。圆盘电泳槽有上下两个电泳槽和带有铂金电极的盖，上电泳槽具有若干个孔，可插电泳管。将丙烯酰胺凝胶贮液装在玻
7、璃管内，凝胶在电泳管中聚合成柱状胶条，样品经电泳分离，蛋白区带染色后呈圆盘状，因而称圆盘电泳(disc electrophoresis)。(3)板状电泳槽 板状电泳槽是目前使用最多的电泳槽，是将凝胶灌装在两块平行的玻璃板中间，因而称板状电泳(slab electrophoresis)。板状电泳的最大优点是包括标准相对分子质量蛋白在内的多个样品可在同一块凝胶上在相同的条件下进行电泳，便于利用各种鉴定方法，直接比较各样品的区带，保证结果的准确可靠；还可进行双向电泳。另外，板胶电泳时产生的热量容易消散，凝胶电泳结果便于照相和制成干胶。板状电泳槽有垂直板电泳槽和水平板电泳槽。垂直板式电泳是较为常见的一
8、种，常用于聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白质的分离。电泳槽中间是夹在一起的两块玻璃板，玻璃板两边由塑料条隔开，在玻璃平板中间制备电泳凝胶，凝胶的大小通常是12cm ，厚度为1mm2 mm，近年来新研制的电泳槽，胶面更小、更薄，以节省试剂和缩短电泳时间。制胶时在凝胶溶液中放一个塑料梳子，在胶聚合后移去，形成上样品的凹槽。水平式电泳，凝胶铺在水平的玻璃或塑料板上，用一薄层湿滤纸连接凝胶和电泳缓冲液，或将凝胶直接浸入缓冲液中。由于pH值的改变会引起带电分子电荷的改变，进而影响其电泳迁移的速度，所以，电泳过程应在适当的缓冲液中进行，缓冲液可以保持待分离物的带电性质的稳定。附属设备随着电泳技术的发展，电泳技术的
9、种类逐渐增加，凝胶电泳在制胶、电泳系统的冷却、凝胶染色及结果分析等方面手段日趋完善，科学家们研制出各种电泳附属设备，如梯度混合仪、外循环恒温系统、制胶板、脱色仪、凝胶干燥系统、凝胶扫描仪、凝胶成像仪等。4. 影响电泳速度的外界因素待分离生物大分子的性质待分离生物大分子所带的电荷、分子大小和性质都会对电泳有明显影响。一般来说，分子带的电荷量越大、直径越小、形状越接近球形，则其电泳迁移速度越快。电场强度：指每厘米的电位降，也称电位梯度。强度越高，泳动越快。多用常压（100-500V，2-10V/cm）。溶液pH：要求恒定，所以用缓冲液作电极缓液，决定带电颗粒的解离程度；与pI有关。溶液的离子强度：
10、缓液离子强度越高，电动势越小，颗粒泳动速度越慢；反之，则越快。最适值在之间。电渗现象：液体在电场中，对一个固定支持物的相对移动。由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，如滤纸表面通常有一些羧基，琼脂可能会含有一些硫酸基，而玻璃表面通常有Si-OH基团等等。这些基团电离后会使支持介质表面带电，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。在pH值高于3时，玻璃表面带负电，吸附溶液中的正电离子，引起玻璃表面附近溶液层带正电，在电场的作用下，向负极迁移，带动电极液产生向负极的电渗流。如果电渗方向与待分离分子电泳方向相同，则加快电泳速度；如果相反，则
11、降低电泳速度。电渗现象是电泳的干扰因素，可选中性支持物克服。影响因素支持物：要求均匀、吸附力小，否则会造成电场强度不均匀，影响区带分离，结果重复性差。支持介质的筛孔大小对待分离生物大分子的电泳迁移速度有明显的影响。在筛孔大的介质中泳动速度快，反之，则泳动速度慢。温度：要求恒定。通过控制电压或电流、冷却散热解决。二、电泳分类1、按分离原理分为：区带电泳：电泳过程中，不同离子成分在均一的缓冲体系中分离成独立的区带，目前应用最广。移界电泳：Tiselius建立，在U形管中进行，目前已不用。等速电泳：需专用电泳仪，当电泳达平衡后，各区带相随分成清晰的界面，并以等速移动。等电聚焦：据不同pI 的两性电解
12、质在电场中，自动形成pH梯度，使被分离物按各自pI 聚集成很窄的区带，分辨率较高。2、按有无固定支持物分类自由电泳，包括：显微电泳（细胞电泳），显微镜下观察细胞或细菌的电泳行为；移界电泳；柱电泳（在层析柱中进行）自由流动幕电泳；等速电泳等。持物电泳，应用最多。无阻滞支持物，如滤纸、醋酸纤维薄膜、纤维素粉、淀粉、玻璃粉凝胶颗粒等。高密度凝胶，如淀粉凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂或琼脂糖凝胶。三、聚丙烯酰胺凝胶电泳1、基本原理 聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂N，N-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在加速剂（TEMED）和催化剂（AP）的作用下聚合、交联成三维网状结构的凝胶，以此胶为支持物的电
13、泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。PAGE根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。PAGE的历史1959年Raymond和Weintraub利用人工合成的凝胶作为支持介质，创建了聚丙烯酰胺凝胶电泳，极大地提高了电泳技术的分辨率，开创了近代电泳的新时代。30多年来，聚丙烯酰胺凝胶电泳仍是生物化学和分子生物学中对蛋白质、多肽、核酸等生物大分子使用最普遍，分辨率最高的分析鉴定技术，是检验生化物质的最高纯度：即“电泳纯”（一维电泳一条带或二维电泳一个点）的标准分析鉴定方法，至今仍被人们称为是对生物大分子进行分析鉴定的最后、最准确的手段，即“Last Check”。聚丙烯酰胺凝胶的优点凝
14、胶透明，有弹性，机械性能好。化学性能稳定，与被分离物不起化学反应。对pH制和温度变化较稳定。几乎无电渗作用，样品重复性好。样品不易扩散，且用量少，灵敏度可达10-6g。凝胶孔径可调。分辨率高，尤其在不连续电泳体系中，即浓缩、分子筛和电荷效应为一体。应用广泛。可用于蛋白质、酶、核酸等生物分子的分离、定性、定量及少量制备，还可测定分子量、pI等。连续与不连续凝胶电泳连续凝胶电泳：电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷及分子筛效应。不连续凝胶电泳：电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓
15、缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率都较前者佳，应用较广。2、不连续凝胶体系为了增加分辨率通常采用不连续凝胶体系，该体系是由浓缩胶、分离胶两部分组成。浓缩胶与分离胶由于有不同的凝胶浓度和缓冲液pH值，蛋白质样品在浓缩胶中受到浓缩效应、电荷效应和分子筛效应的影响，可被浓缩成一条极为狭窄的条带，因此，当蛋白质样品进入分离胶时就形成了彼此分离的清晰条带，大大提高了分辨率。 不连续凝胶体系中离子运动最广泛使用的不连续缓冲系统是由Ornstein和Davis（1964）设计的。样品和浓缩胶中含Tris-HCl(pH 6.8)，上下槽缓液为Tris-甘氨酸 (pH 8.3)，分离胶中含Tris-HCl(p
16、H 8.8)，系统所有组分中都含0.1% SDS。样品和和浓缩胶中的Cl-形成移动界面的先导界面，甘氨酸 组成尾随界面，在移动界面的两边界之间是一电导较低而电位梯度较陡的区域，它推动样品中的蛋白质前移并在分离胶前积聚。此处pH较高，甘氨酸被离子化后穿过被堆集的蛋白质并紧随Cl-之后，沿分离胶移动。从移动界面解脱后的蛋白质-SDS复合物形成一电位和pH均匀的区带涌动穿过分离胶，并被筛分而依各自的大小分开。3、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳在蛋白质样品中加入SDS和巯基乙醇后，蛋白质分子在巯基乙醇的作用下，还原成单链，再进一步与SDS结合形成带大量负电荷的SDS- 蛋白复合物，他们在水溶液中呈长椭圆棒
17、状，短轴基本一致，但长轴随蛋白质分子量成正比的改变。因此蛋白质在电场中的移动主要取决于蛋白质分子量的大小，不在受蛋白质原有电荷和形状本身的等电点（带电荷）无关。 由于SDS和巯基乙醇的作用，蛋白质完全变性和解聚，解离成亚基或单个肽链，因此，该方法用于分子量测定时，电泳结果显示的只是亚基或单个肽链的分子量。利用SDS-PAGE测蛋白分子量根据已知分子量的蛋白质的电泳迁移率和分子量的对数做出标准曲线，再根据未知蛋白质的电泳迁移率求得分子量。优点：仪器设备简单，操作方便、样品用量少，耗时少（仅需1天），分辨率高，重复性好等。不足处：对电荷异常或构象异常的蛋白、带有较大辅基的蛋白（如糖蛋白）及一些结构
18、蛋白等测定结果不太可靠。常用的是连续SDS-PAGE，近几年趋向用不连续SDS-PAGE，其分辨率比连续SDS-PAGE高出倍。SDS-PAGA常用试剂10% SDS，蛋白变性；消除颗粒电颗，使其统一带负电。丙稀酰胺Acr和甲叉双丙稀酰胺Bis（ 29 ： 1）。注意： Arc和Bis有神经毒性并易于吸附皮肤。 10%过硫酸铵（AP）（聚合的引发剂），提供甲叉双丙稀酰胺和丙稀酰胺聚合时所需的自由基，须现用现配。 四甲基乙二胺（TEMED）是加速剂，通过催化AP形成自由基而加快甲叉双丙稀酰胺和丙稀酰胺聚合的速度 。电极缓冲液:（内含0.1%SDS，甘氨酸缓液）：称Tris ，甘氨酸，加入SDS
19、1g，加蒸馏水使其溶解后定容至1000mL。 样品溶解液：50 mM）；2% SDS ，5%巯基乙醇, 10%甘油 ，0.1%溴酚蓝。（样品缓冲液中的甘油可使样品溶液的密度变大，避免加样后样品上漂；2-巯基乙醇使蛋白质中的二硫键断裂，并不再形成新的二硫键，溴酚蓝是指示剂，显示电泳前沿线的位置）。样品缓冲液中的甘油可使样品溶液的密度变大，避免加样后样品上漂；2-巯基乙醇使蛋白质中的二硫键断裂，并不再形成新的二硫键，溴 酚蓝是指示剂，显示电泳前沿线的位置。 分离胶缓冲液 ：1.5 M Tris-HCl ，严格调pH至；Tris 加水溶解，用6NHCl调pH，定容至100ml。缩胶缓冲液： Tris
20、-HCl，严格调pH至；Tris 加水溶解，用6NHCl调pH，定容至25ml。低分子量标准蛋白试剂盒（1750094000），每种蛋白含量40g，用时加入200L样品溶解液，经处理后，上样10L。染色液： 0.1 % CBB-R250 ， 40%甲醇，10%冰乙酸。染色1小时或过夜。脱色液：10%冰乙酸，10%甲醇。脱色需3-10小时。凝胶选择操作步骤第一步： 倒制胶板 首先选择凝胶的浓度，高浓度凝胶的孔径较小对于小分子量的蛋白质有较高的分辨率，相反低浓度的凝胶对于大分子量的蛋白质有较高的分辨率。将两玻璃板密封好，将冰箱中贮存液取出，平衡到常温后，按上表比例混合，制备分离 胶、浓缩胶(充分混
21、匀)，加入聚合剂(10%过硫酸胺)及促聚剂(TEMED)轻搅混匀。倒入密 封好的玻璃板间隙中（如果采用倒胶槽，可将胶液直接倒入倒胶槽）用少量正丁醇或水覆盖液面，以隔绝空气，并产生整齐的上液面（注意：由于丙稀酰胺是神经毒，在制胶过程中需要戴手套，凝胶聚合后则不再有毒性）。胶液的聚合大约需要半小时，随后倒掉胶板上沿的液体并加入配置好的浓缩胶溶液，插入梳子，聚合后移去梳子。 操作步骤2）加样与电泳 将制胶板中的密封胶条除去，装入电泳槽，在正负极水槽中加入电极缓冲液，将预处理后的蛋白质样品加入对应的梳空，装好电泳槽，接好电源，开始电泳。施加在每块胶板上的电流强度应该在30mA左右。 第二步： 样品处理
22、与加样待测样品一般需10mg以上，太稀应予浓缩，含盐量高应先透析，有沉淀应先离心除去。将待测样品与4倍体积的样品缓冲液于塑料管中混匀，加热至沸保持4分钟，然后取出置冰水中冷却待用，用不完可冷冻贮存备用。标准液处理与待测液相同。加样一般加样体积为10-15 微升（2-10g 蛋白）样品槽内不能有气泡。用移液器尽可能将样品送至底部，缓慢打出。第三步：通电电泳将电泳槽中倒入电极缓液，连接电泳仪与电泳槽。上槽接负极，下槽接正极。加样后，连接稳压电源，恒定电压。开始的电压为8V/cm，当染料前沿进入分离胶后，把电压提到15V/cm，当溴酚蓝前沿接近凝胶下沿，断开电源，停止电泳。第四步：染色与脱色 电泳结
23、束后，分离玻璃板，取出凝胶进行染色，可将无色的凝胶直接放入考马斯亮蓝中振荡染色约1h，再转入脱色液中脱色。脱色过程中需要更换34次脱色液（如果在脱色液中加入海绵和泡沫碎片以吸附染液中的考马氏亮蓝，可加快脱色速度并且可不必更换脱色液）。经染色、脱色后可得到条带清晰的凝胶，在有图象记录和分析的条件下，可用凝胶成像系统对凝胶进行数字化 。成像、储存及定量分析。 结果与讨论1）制胶与实验结果重复性的关系：由于每次制胶时试剂量的加入量有误差，可通过采用一次配制多块胶板的方法来提高实验的重复性。 2）样品分子量与凝胶浓度的关系：目标蛋白质的分子量较大时，应采用浓度较低的凝胶，以获得较高的分辨率；反之，对分
24、子量较小的蛋白质，应采用浓度较高的凝胶。 3）凝胶聚合时间长短与凝胶质量的关系：凝胶的聚合应该在3060min内完成，聚合太快凝胶不均匀，太慢则浪费时间。聚合的快慢可通过增减TEMED（四甲基乙二胺）的加入量来改变。 4）电泳的快慢与电流之间强弱的关系：电流强时电泳速度加快，但产热较多影响奋力效果；电流过低时产热虽少，但对蛋白质泳动不利。常用的电流强度应该是每块胶板30mA左右。绘制标准曲线相对迁移率rf=蛋白样品距加样端的迁移距离（cm）/溴酚蓝区带中心距加样端的距离（cm）以标准蛋白的相对迁移率为横坐标，标准蛋白的分子量为纵坐标，在半对数坐标纸上得到一条标准曲线。根据未知蛋白样品的相对迁移
25、率可直接在标准曲线查出分子量。4、蛋白质染色液氨基黑10B，酸性染料，其磺酸基与蛋白质反应构成复合盐。对SDS-PAGE效果不好。CBB R250，染色灵敏度比氨基黑高5倍，靠范德瓦尔力与蛋白质结合。尤其适合SDS-PAGE微量蛋白染色。CBB G250，比R250多两个甲基，灵敏度不如R250，但比氨基黑高5倍。染色稳定，适合定量。固绿（Fast green FG），灵敏度近似氨基黑，但脱色时不易和蛋白质分离，克服了CBB脱色时的缺点。荧光染料，常用有丹磺酰氯、荧光胺、MDPF、ANS等。可与蛋白质末端氨基结合，荧光标记。银染，（AgNO3）较CBB灵敏100倍，染色机理不详。蛋白染染料 用
26、染料和生物大分子结合形成有色的复合物是电泳后检测最常用的方法。选择高吸光系数的染料，与生物大分子紧密结合，形成有色不溶的复合物，而支持介质不吸附染料，便于背景的脱色，有利于蛋白质条带的辨别和定量扫描，从而检测出蛋白质的纯度、含量及生物活性。 可用于蛋白质电泳条带的染色方法很多，常用的主要有以下几种：氨基黑类染色： 蛋白质染色最早是用氨基黑类染料，是一类含有磺酸基的酸性染料，它通过磺酸基与蛋白质的碱性基团形成复合盐。常用的有：氨基黑10B(amino black 10B)，萘黑12B 200(naphthalene black 12B 200)，萘酚篮黑6B(naphthol 6B)，水牛黑(b
27、uffalo black)等。 这类染料对不同的蛋白质着色不同，有蓝色、棕色、黑色，借此可以鉴别不同类型的蛋白质。这类染料对不同的蛋白质结合量不同，染色不均一和高背景影响蛋白质的定量。染色灵敏度较低，现在这类染料已很少应用，被灵敏度较高的考马斯亮蓝所代替。 考马斯亮蓝(coomassie brilliant blue，简称CBB)在蛋白质染色中，目前考马斯亮蓝染色法最为常用，1965年考马斯亮蓝应用于聚丙烯酰胺凝胶染色，它步骤简便、灵敏度较高，可进行定量扫描。它可分为R和G型两类：R型为三苯基甲烷(triphenylmethane)，每个分子含有两个SO3H基团，本身偏酸性，磺酸基与蛋白质的碱
28、性基团结合形成染料蛋白质复合物。 G型为二甲花青亮蓝(xylene cyanine brilliant blue)，是一种甲基取代的三苯基甲烷。考马考马斯亮蓝R-250是通过范德瓦尔键与蛋白质结合，尤其适用于SDS电泳微量蛋白质染色。它与不同蛋白质结合呈现出基本相同的颜色，并且在比较宽的范围内（15-20 mg），扫描峰的面积与蛋白量呈线性关系。考马斯亮蓝G-250染色灵敏度不如R-250，其优点是在三氯乙酸中以胶体形式存在，能选择性地和蛋白质形成复合物，染色迅速，着色深的蛋白质区带在数秒内即可显现出来，约45分钟后着色最深，本底低，重复性好，适用于定量分析。 荧光染料： 是一种在电泳前用荧光
29、分子将蛋白质共价偶联标记，于电泳后通过扫描来测定荧光区带的方法，但由于荧光标记蛋白质的定量需要特殊的扫描装置，影响了此方法的广泛应用。研究工作中使用的荧光染料有以下几种：(1)磺酰氯(2,5-二甲氨基萘磺酰，dansyl chloride，简称DNS-Cl)：是最早应用的荧光染料，它在碱性条件下与氨基酸、肽、蛋白质末端氨基酸发生反应，使它们获得荧光性质，在280nm和320nm波长的紫外灯下可观察到电泳条带。(2) 荧光胺(fluorescamine，又称fluram)：作用与丹磺酰氯相似。在碱性条件下与氨基酸、肽、蛋白质末端氨基酸发生反应，产生荧光。其优点是由于自身及分解产物均不显示荧光，标
30、记的蛋白质是唯一的荧光物质，因此，凝胶没有荧光背景。(3) 2-甲氧基-2,4-二苯基-3-呋喃酮2-methoxy-2,4-diphenyl-3(2H)-furanone，简称MDPF：其作用与丹磺酰氯和荧光胺相似，其优点是凝胶上MDPF标记蛋白质的荧光可保持数月。用MDPF标记时，荧光强度在蛋白质浓度1500ng范围内呈线性关系，标记蛋白做SDS-PAGE分析时，其相对分子质量的对数(log10)与相对迁移率之间呈线性关系。(4)1-苯胺基-8-萘磺酸(1-amino-naphthal-sulfonic acid，简称ANS)：染料本身无色，但与蛋白质结合后，在紫外光下可显出黄绿色荧光。电
31、泳后将凝胶置于此染料溶液中，13分钟后在长波紫外光下即可观察到荧光蛋白条带。硝酸银染色： 目前染色机理尚不清楚，可能是将结合在蛋白质上的银离子还原成金属银而显色，研究表明蛋白质上碱性和含硫氨基酸在银染中的重要性，染色灵敏度是考马斯亮蓝R-250的100倍左右，可以检测0.38ng /mm2的牛血清白蛋白。银染显色的方法大致可以分化学显色和光显色两类。(1)化学显色法(chemical development)： 又分为双胺银染法(diamine silver stains)和非双胺银染法(non-diamine silver stains)。双胺法：是用碱性的NH4OH形成银双胺复合物，固定后
32、的凝胶浸泡在此溶液中，通过酸化（通常用柠檬酸）显像，使用较广泛。非双胺法：是将固定的凝胶置于酸性的硝酸银溶液中，银离子与蛋白质发生作用，在碱性条件下，用甲醛将银离子还原为金属银而显像，用酸性溶液（柠檬酸或醋酸）终止显色反应，用碳酸钠处理凝胶可进一步增强银染色的强度。非双胺法的灵敏度较双胺法高10倍。特殊蛋白质染色:(1)糖蛋白染色：糖蛋白可以通过对蛋白或碳水化合物的染色来检测。如与糖链的反应，用过碘酸-Schiff试剂(periodic-Schiffs reagent)染色，简称PAS染色，显色结果在543nm处可观测到颜色。检测灵敏度，最高可以达到40 ng糖蛋白。(2)脂蛋白染色：脂蛋白可
33、以用常规的染色方法，苏丹黑B(sudan black)是常用的染料，银染法仍然是最灵敏的方法。近年有报道一种双染色方法，先用一种发荧光的染料Filipin使脂蛋白染色，再用考马斯亮蓝使其它蛋白染色，这样就可以在一块凝胶上同时检测出脂蛋白和其它蛋白，灵敏度高，可检测低至20 ng低密度脂蛋白。(3) 铁蛋白染色：血红蛋白、转铁蛋白和其它含铁蛋白能用多种方法检测，如普鲁士蓝(prussian blue)显色，它与蛋白质分子中的铁离子结合，方法十分简便。 (4) 铜蛋白染色：可用茜素蓝S(alizalin S)显色，它与蛋白质分子中的铜离子结合，蛋白条带为蓝色。四、转移电泳 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电
34、泳的主要功能是将混合的蛋白质样品分离成可观察的条带，但如果需要用特定抗体在凝胶中寻找特异的蛋白质条带或需要切割下某一条带进行氨基酸序列分析，在凝胶上操作就极为不方便，这时就需要将所有蛋白质转移或印记到硝酸纤维素膜上，这一过程叫做蛋白质转移电泳，也叫做蛋白质印记。 在电场作用下，带负电荷的蛋白质分子向正极移动，在转移膜的表面沉积下来，转移到膜上的蛋白质条带的分布形式与原来的凝胶中的蛋白质分布形式完全一样。 试剂和仪器转移电泳槽、转移缓冲液。转移电泳分槽式和半干式两种，由于半干式转移有方便、快速和费用低等特点逐渐成为人们主要选择的方法。 结果和讨论转移效果评价在采用免疫印记的方法识别特定蛋白质前，
35、可直接将转移膜染色来观察转移的结果，评定转移电泳实验是否成功，试看是否能够将凝胶中的大部分蛋白质转移到膜上。可以在SDS-PAGE电泳时加入预先染色的蛋白质分子量标准品（也叫Marker），这样在电泳后可以直接比较凝胶中和转移膜中的蛋白质标准品条带，观察凝胶中的标准品条带是否已经消失，膜上的标准品是否明显。如果没有预染的蛋白质标准品。可以将转移后的凝胶染色，通过观察凝胶中蛋白质的残留量来判断转移数率。由于大分子蛋白质的转移需要较长的时间，当蛋白质样品中含有较多的大分子量蛋白质时，应该适当延长转移的时间。五、琼脂糖凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳对于分离生物大分子具有较高的分辨率，但由于核酸分子比蛋
36、白质分子大得多，只能采用有较大孔径的琼脂糖凝胶来分离核酸。由于核酸分子本身中含有大量的磷酸根，所以核酸带有负电荷，在电场中会向正极移动。用琼脂糖凝胶做支持物的电泳，常用于核酸的分离、鉴定。琼脂糖 琼脂糖是从琼脂中提纯出来的，主要是由D半乳糖和3,6脱水L半乳糖连接而成的一种线性多糖。琼脂糖之间以分子内和分子间氢键形成较为稳定的交联结构，这种交联的结构使琼脂糖凝胶有较好的抗对流性质。琼脂糖凝胶的孔径可以通过琼脂糖的最初浓度来控制，低浓度的琼脂糖形成较大的孔径，而高浓度的琼脂糖形成较小的孔径。尽管琼脂糖本身没有电荷，但一些糖基可能会被羧基、甲氧基特别是硫酸根不同程度的取代，使得琼脂糖凝胶表面带有一
37、定的电荷，引起电泳过程中发生电渗以及样品和凝胶间的静电相互作用，影响分离效果。市售的琼脂糖有不同的提纯等级，主要以硫酸根的含量为指标，硫酸根的含量越少，提纯等级越高。琼脂糖凝胶电泳的优点操作简单，速度快，样品不需事先处理。含水量大，近似自由电泳，对样品无吸附琼脂糖本身无紫外吸收性，用UV检测。电泳后区带易染色，样品易洗脱，便于定量测定。试剂和仪器水平电泳槽、电泳仪 溴化乙锭是荧光染料与核酸结合后在紫外线照射下可产生橙红色荧光，由于溴化乙锭有潜在的致癌性（诱变剂），操作时需要戴手套。贮存液为1mg/mL,使用浓度为。目前，已有多种代替EB的染色剂，如：GelRed 和 GelGreen 等。 电
38、泳缓冲液，常用的为TAE(50)、TBE (5) ,使用时均为1。TAE缓冲能力不如TBE，但TBE贮存时间长后会出现沉淀。操作方法含有琼脂糖的缓冲液经微波炉加热后被溶解，倒入制胶系统中，插入梳子，琼脂糖凝固后，拔掉梳子，将塑料托盘放入电泳槽，加入缓冲液，经加样后即可接通电源进行电泳。注意事项1）设置电泳参数时不要超过其能达到的额定值。 2）电泳时电源线正负极不要插反（黑色线对应黑色插口，红色线对应红色插口）。 3）电泳槽放置时一定要电源线的一面朝上放置，以免向下放置时折断电源线。 4）电泳仪可以同时接四个电泳槽，如同时接多个电泳槽，应同时接上开始电泳。结果和讨论 由于通常在凝胶缓冲液中加入了
39、荧光物质溴化乙锭，荧光在254nm波长的紫外光照射下产生红色荧光，可在紫外光下照相，或者采用图像记录系统储存试验结果。 琼脂糖凝胶电泳的制胶过程比聚丙烯酰胺凝胶电泳要简单得多。琼脂糖浓度得选择与聚丙烯酰胺凝胶电泳类似，即在分离分子量较大的核酸时，应选用较小的琼脂糖浓度；反之，则选用较大的琼脂糖浓度。琼脂糖凝胶的特性（1）琼脂糖凝胶属于大孔胶，电泳分辨率低于聚丙烯酰胺凝胶电泳。这种大孔特性有利于免疫固定、免疫电泳和微量制备。琼脂糖形成凝胶后孔径的大小取决于琼脂糖百分浓度， (2)具有稳定的物理化学性质，对样品吸附极小，电泳图谱清晰，分辨率高，重复性好； (3)具有较高的机械强度，允许在1%或更低
40、的浓度下使用，且在这种浓度下仍然有筛分和抗对流作用； (4)琼脂糖无毒，具有热可逆性，胶凝过程不需催化剂，制备简单、快速。低胶凝温度及低熔点的琼脂糖有利于样品回收，达到样品制备的目的； (5)琼脂糖凝胶电泳操作简单，电泳速度快，染色、脱色程序简单快速；琼脂糖凝胶的主要性能指标： (1)电内渗(electroendosmosis，简称EEO)：是琼脂糖电泳中由多糖骨架上的带电基团引起，主要是硫酸酯和丙酮酸盐，这些阴离子基团被固定在介质中，相应的阳离子与其结合水一起向阴极移动（图3-6），电内渗对DNA的分离没有显著影响，但高电内渗时对大分子的迁移有一定阻碍作用，电泳耗时较长。(2) 胶凝温度：将
41、琼脂糖在溶液中加热至90溶解，然后将温度下降至某一温度时由液态转变为固态，此温度即为凝固点，称为胶凝温度。一般在3543。 3)熔化温度：将凝固的凝胶由固态转变为液态时的温度即熔化点，称为熔化温度。一般在7590。用于制备目的时，采用低熔点琼脂糖，熔化温度需低于30。 (4)凝胶强度：定义为每平方厘米凝胶所能承受的重量(g /cm2)，凝胶强度与凝胶浓度成正比。凝胶强度越高，所能允许使用的凝胶浓度越小。在电泳中通常使用1%的琼脂糖凝胶。尿素和碘化钾等阻碍氢键形成的试剂也会降低凝胶强度，使凝胶变软易碎，给操作带来困难。(5)脱水收缩作用：是指琼脂糖凝胶中挤压出液体的现象，使用时要用滤纸吸干凝胶表
42、面的水。琼脂糖凝胶电泳在核酸研究中的应用： 由于琼脂糖凝胶孔径相当大，对大多数蛋白质来说，其分子筛效应微不足道。以琼脂糖凝胶为支持介质的电泳已广泛应用于核酸研究中，为DNA分子及其片段的相对分子质量测定和DNA分子构象的分析提供了重要手段。琼脂糖对DNA的分离范围较广，用不同浓度的琼脂糖凝胶可以分离长度为200bp至50kb的DNA。新型凝胶介质 虽然聚丙烯酰胺和琼脂糖凝胶是目前最常用的两种支持介质，但是它们还存在一定的局限性，如聚丙烯酰胺凝胶聚焦的重复性较差，琼脂糖凝胶容易断裂等。近年来人们正在寻求新型的电泳材料。第一类：丙烯酰胺单体替代物如poly-N-acryloyl-tris(NAT)
43、、N-acryloyl sugars、N-acryloylaminoethoxye thanol (AAEE)等。这类N-取代聚丙烯酰胺材料具有以下优点： 具有较强的水解稳定性，在较广的pH范围内稳定，能在pH2-13环境中进行电泳，适合作为酸碱性pH范围等电聚焦的支持介质；具有高度的亲水性和大孔性，适合大相对分子质量物质的分离；凝胶的机械强度高。 第二类：聚丙烯酰胺琼脂糖混合物(Polyacrylamide-agarose mixture)、聚丙烯酰胺琼脂糖的衍生物混合物(polyacrylamide-allylglycidyl mixture)，这类电泳支持介质具有以下优点： 具有聚丙烯酰
44、胺分辨率高和琼脂糖大孔径的优点，机械强度高，又具有良好的弹性，适合分离特大分子(2500kD)，可用于病毒、SDS变性分子和高相对分子质量的脂蛋白第三类：“电泳海绵”，是一些海绵状的支持介质材料，还处于试验阶段，但它与聚丙烯酰胺和琼脂糖相比具有很多优点：机械强度大，结构稳定，可以是亲水的也可是疏水的；可以直接测量孔径，孔径范围在nm100m。 六、醋酸纤维薄膜和纸上电泳比较醋酸纤维薄膜与滤纸相比较，有以下优点： 醋酸纤维薄膜对蛋白质样品吸附极少，无“拖尾”现象，染色后背景能完全脱色，各种蛋白质染色带分离清晰，因而提高了定量测定的精确性。 快速省时。由于醋酸纤维薄膜亲水性较滤纸小，薄膜中容纳的缓
45、冲溶液较少，电渗作用小，电泳时大部分电流是由样品传导的，所以分离速度快，电泳时间短。 灵敏度高，样品用量少。 应用面广。某些蛋白在纸上电泳不宜分离，如胰岛素等但用醋酸纤维薄膜能较好地分离。 醋酸纤维薄膜电泳染色后，经冰醋酸、乙醇混合液或其他溶液浸泡后可制成透明的干板，有利于扫描定量及长期保存。 七、等电聚焦电泳在一定抗对流介质（如凝胶）中加入两性电解质载体，当直流电通过时，便形成一个由阳极到阴极pH值逐步上升的梯度。两性化合物在此电泳过程中，就被浓集在与其等电点相等的pH值区域，从而使不同化合物能按其各自等电点得到分离。此技术已广泛应用于等电点测定、纯度分析，以及制备电泳纯样品等，但对在等电点
46、时发生沉淀或变性的样品不合适。八、 双向电泳当我们需要将大量不同的蛋白质分离成单一成分时，普通的聚丙烯酰胺凝胶电泳难以达到这一目标，这时就需要采用等电聚焦电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳相结合的双向电泳方式，将所有蛋白质完全分开。对蛋白质分子进行等电聚焦电泳时，不同的蛋白质移动到与其等电点相当的pH值位置上，使具有不同等电点的蛋白质分子得以分离。蛋白质的经等电聚焦凝胶电泳后，再进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，使蛋白质分子进一步按分子量的不同进行分离，所以大大提高了分离效果。双向电泳的分类非变性2D-PAGE：两向均在非变性条件下进行，这样分离的蛋白质点的等电点和表观分子量同生理条件下获得的这些蛋白的值
47、是一样的；非变性/SDS-2D-PAGE：第一向采用非变性IEF，之后在2%SDS溶液中平衡；第二向也在SDS存在的条件下进行。适于分析非共价键连接的蛋白蛋白间的相互作用。非变性/还原/SDS-2D-PAGE：非变性条件下IEF聚焦，之后用8M尿素5%-ME2%SDS进行平衡，再进行第二向SDS-PAG电泳。此时分离的蛋白质点可进行点的切取、蛋白酶消化、MALDI-TOF-MS分析鉴定，提供关于断裂二硫键连接的多肽的信息。变性2D-PAGE：样品先用2%SDS5%-ME95变性5min，IEF在8M尿素1%NP-40条件下进行，之后胶条用2%SDS5%-ME平衡，然后进行SDS-PAGE。该技术适于DNA序列和多肽结构的分析，或分析被碳氢键连接和其它翻译后修饰所引起的多肽结构微异质性，但此方式显示的大于100Kd的蛋白质点少于第三种方式。 双线电泳结果凝胶的图像处理分析和典型流程典型流程 凝胶图像的扫描：图像加工：斑点检测和定量：凝胶配比：数据分析：数据呈递和解释：2-DE数据库的建立：双向电泳的应用将来自于全细胞、组织或生物