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1、-生物技术制药重点(1)(1)-第 13 页生物技术制药重点第一章 绪论2.生物技术：又称生物工程，是指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。3.生物技术药物：是指采用DNA重组技术或其他生物技术生产的用于预防、治疗和诊断疾病的药物，主要是重组蛋白或核酸类药物，如细胞因子、纤溶酶原激活剂等。4.生物技术制药：是指利用基因工程、细胞工程、发酵工程、酶工程、蛋白质工程等生物技术的原理和方法，来研究、开发和生产用于预防、治疗和诊断疾病的药物的一门科学。第二章 基因工程制药1.基因工程
2、：又称重组DNA技术，即在体外将DNA片段与载体连接，形成重组DNA，在宿主细胞中复制、扩增和表达蛋白质所用的方法和技术。2.基因工程制药：利用重组DNA技术将外源基因导入宿主菌或宿主细胞进行大规模培养和诱导表达以获得蛋白质药物的过程。3.基因工程制药的基本流程：目的基因的获得；表达载体的选择；目的基因与表达载体的连接；重组DNA转入受体细胞；重组子的筛选与鉴定；工程菌株发酵表达重组蛋白；重组蛋白产品的纯化；重组蛋白制剂的生产。4.限制性核酸内切酶：主要指来自于细菌、能够识别DNA特定序列、并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。具有专一性。5.DNA连接酶：可以催化DNA片段中两个相
3、邻的3-OH和5-磷酸基团（互相配对的两个粘性末端连接起来）形成3，5-磷酸二酯键，从而使DNA片段或单链断裂形成的缺口连接起来。6.获得目的基因的主要方法：化学合成法：已知目的基因的核苷酸序列或其编码产物的氨基酸残基序列。100个碱基。小片段粘接法：12-15个碱基，退火形成双链；大片段酶促法：100个碱基以下，利用聚合酶和连接酶形成。PCR：（已知目的基因的序列）根据生物体内DNA复制原理在DNA聚合酶催化和dNTP参与下，引物依赖DNA模板特异性地扩增DNA。PCR体外扩增常容易带入突变，为保证目的基因片段序列的正确性，一般建议使用高保真的DNA聚合酶和相对保守的PCR扩增条件。同时PC
4、R得到的片段在克隆后必须进行测序分析。cDNA文库法：表示表达信息的微生物。代表了细胞或组织所表达的全部蛋白质，从中获取的基因序列也都是直接编码蛋白质的序列基因组DNA文库法：表示遗传信息的微生物。是指某一特定生物体全部基因组DNA序列的随机克隆群体的集合，以DNA片段的形式贮存了所有的基因组DNA信息，包括所有外显子和内含子。7质粒的结构和特点：（1）细胞拟核之外的小的环状DNA分子（2）存在于细菌、霉菌、酵母菌等细胞里，对细胞的正常生活几乎没有影响（3）能够在宿主细胞中自主复制（4）可以容易地从细胞中取出或放入2.载体的要素、分类 P13（1）质粒载体的三个要素:复制子（复制起始点），选择
5、标记（用于鉴定和筛选转化有质粒的宿主细胞），多克隆位点（质粒载体中由多个限制性核酸内切酶识别序列密集排列形成的序列，用于将目的基因插入多克隆位点中相应的酶切部位）。分为克隆载体（用于外源DNA的扩增），表达载体（用于外源目的基因的有效转录和翻译），突变载体（通过对载体抗性的选择来实现筛选突变克隆的目的），报告载体（以易于检测的基因作为报告基因，通过报告基因的表达强度来研究外源调控因子的功能）。（2）载体分质粒载体和噬菌体载体（常用于构建基因组文库和cDNA文库）。入噬菌体载体分为插入型和置换型两类。常用方法：转化；感染；转染；显微注射；电穿孔重组DNA导入细菌： 化学转化法：对数生长期细菌 感
6、染法：以病毒形式 穿孔法：高压脉冲重组DNA导入酵母：电转化法（方便、快速、高效）；化学转化法（简单、设备要求低）；原生质体转化法重组DNA导入哺乳动物细胞：显微注射法和电转化法；转染法；病毒感染法。1)载体遗传标记法：抗生素抗性筛选法；-互补筛选法；营养缺陷型筛选法；噬菌斑筛选法2)核酸分子杂交法3)限制性内切酶图谱法4)DNA序列测定法5)目的基因表达产物测定法3. 基因重组蛋白的主要纯化技术 P26-28（1）离子交换层析:利用蛋白质等电点的差异，通过带电的溶质分子与离子交换剂中可以交换的离子进行交换。 a.离子交换剂：阴离子交换剂、阳离子交换剂、两性离子交换剂、选择性离子交换剂。 b.
7、影响因素：盐离子浓度、离子大小、洗脱梯度与流速。（2）亲和层析：利用固定化配基于目的蛋白之间特异的生物亲和力进行吸附。 a.亲和作用包括酶与激活剂/受体/底物之间、抗体与抗原之间、受体与激素/配体之间、蛋白质与DNA/RNA结合域之间。 b.亲和层析步骤：配基固定化；亲和吸附；洗涤；洗脱解离；再生。 c.合适的配基：特异性、亲和力适中（3）凝胶过滤层析：根据生物大分子的Mr的大小来实现目的蛋白的分离纯化。 a.主要用于脱盐、分级分离及Mr的测定：脱盐是将无机盐与生物大分子分离；分级分离将不同Mr大小的分子分开；标准样品作对照时，用凝胶过滤可以测定生物大分子的Mr。 b.优点：分离蛋白质的Mr范
8、围广、不带电荷的惰性基质不与溶质分子发生任何作用、凝胶介质可以反复使用。（4）反相层析和疏水层析：根据蛋白质疏水性的差异来实现分离纯化。 a.反相层析：利用溶质分子中非极性基因和非极性固定相之间相互作用力的大小，以及溶质分子中极性基因与流动相中极性分子之间在相反方向作用力的大小的差异进行分离。 b.疏水层析：利用蛋白质分子表面的疏水区域和介质的疏水基因之间的相互作用。 c.反相层析：有机溶液洗脱，蛋白质可能变性，疏水层析：盐溶液洗脱第三章 动物细胞工程制药1.体外培养动物细胞的类型：贴壁依赖性细胞：培养时需要贴附因子。大多数动物细胞，包括非淋巴组织细胞和许多异倍体细胞；非贴壁依赖性细胞：无需固
9、体支持物，在培养液中悬浮生长。一般来源于血液、淋巴组织的细胞和杂交瘤细胞；兼性贴壁细胞2.动物细胞培养的环境条件：培养温度：哺乳类37；昆虫细胞25-28pH：大多数动物细胞适合在pH7.2-7.4生长。低于6.8或者高于7.6时，对细胞生长不利。加适量磷酸盐缓冲液维持相对稳定的pH。加空气、氧气、二氧化碳和氮气的混合气体进行供氧和调节。酸碱指示剂 通氧量：CO2比例 防止污染 基本营养物质：除三大营养物质外，还需一定量的维生素、激素类物质和促细胞生长因子。 透压：理想范围：260-320mOsm/L3.动物细胞工程制药：利用动物细胞（包括原代细胞、二倍体细胞、异倍体细胞、融合或重组的细胞）为
10、宿主或者反应器，也包括利用转基因动物作为反应器，进行疫苗、多肽和蛋白质等生物制品的生产。4. 细胞传代，细胞冻存及复苏（重点掌握关键步骤及原则） P50-51(1)细胞的传代培养:将细胞从一个培养器皿中消化、分散并接种至另一个培养器皿中的操作称为细胞传代。为了维持细胞的生长和获得更多的细胞量往往要进行细胞的传代培养(subculture)。否则会因密度过大、生存空间不足、代谢产物在培养液里的浓度过高等因素造成细胞衰老。在传代过程中要注意减少对细胞的损伤以及培养基和培养条件的相对稳定。(2)动物细胞的冻存与复苏 细胞的冻存 在-70以下时，细胞内的酶活性均已停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长
11、期保存。目前保存细胞，都采用液氮低温(-196)冻存的方法。 细胞低温保存的关键在于通过0-20阶段的处理过程。冷冻速度太慢细胞内、外环境的水会形成冰晶，易损伤细胞，太快不足以使水分排出。 注意事项：a. 冻存的细胞应在对数生长期且存活率高的状态;b. 冻存的细胞营养状态良好;c. 细胞密度以110 6 210 6 细胞/mL为好;d. 配制冻存用培养基要与实际使用的一致，加保护剂10%(v/v)二甲基亚砜或甘油;e. 细胞冻存管口密封性要良好;f. 做好相关标注。 细胞复苏的原则是快速融化 必须将冻存在-196液氮中的细胞快速融化至37，使细胞外冻存时的冰晶迅速融化，避免冰晶缓慢融化时进入细
12、胞形成再结晶，对细胞造成损害。 注意事项：a. 注意防护，以防渗入液氮引起安瓿爆炸；b. 从液氮取出应立即37水浴，并不断摇动使液体迅速融化；c. 液体溶解后取出，用乙醇擦拭外壁；d. 尽早离心，以去除二甲基亚砜；或先直接种入培养瓶内，加培养液，待细胞贴壁后立即换液；e. 隔天观察生长情况，再换液一次。第四章 抗体工程制药5. 抗体的结构，各部分功能及对应缩写 P79（1）基本结构：抗体单体由4条多肽链（2条相同的重链H和2条相同的轻链L）通过二硫键（-S-S-）链接而成，为“Y”字形结构。（2）轻链 重链 可变区与恒定区 超变区与骨架区 铰链区（图片）（3）恒定区C区的功能 抗体（IgM、I
13、gG）与抗原结合形成复合物可通过启动C1q激活补体经典途径；IgG4、IgA和IgE的聚合物可以激活补体旁路途径。 抗体的调理作用；ADCC作用；介导超敏反应。 IgG是唯一能够从母体通过胎盘屏障转运到胎儿体内的抗体（胎儿抗感染）。 分泌型IgA合成和主要作用部位在黏膜（黏膜局部抗感染）（4）可变区V区的功能识别并特异性结合抗原： a.与毒素结合可以中和其毒性b.与病原体结合，可以组织其对机体细胞的黏附和感染水解片段（图片） 6.基因工程抗体 P92抗体及抗体片段 (1)人鼠嵌合抗体（chimeric antibody） 鼠IgV-人IgC 人一鼠嵌合抗体是将鼠源单抗的可变区与人抗体的恒定区融
14、合而得到的抗体。 (2)改形抗体(Reshaped antibody) 也称CDR移植抗体 、人源化抗体。Ig分子中参与构成抗原结合部位的区域是 H和L链 V区中的互补性决定区 (CDR区) (3）小分子抗体小分子抗体包括Fab、Fv或ScFv、单域抗体及最小识别单位等几种Fab和Fv抗体（1）Fab抗体：完整的轻链+重链（VH和CH1）（2）FV抗体：VH+VL，天然FV片段中VH和VL为非共价性结合,不稳定。（在VH与VL之间加上一段连接肽，把VH与VL连成一条单链，得到ScFv，即单链抗体）单链抗体 VH-linker-VL 单域抗体和分子识别单位（1）单域抗体:由VH(VL)单个可变区
15、组成的，只有抗体分子的1/12，而且表面疏水性强，与抗原非特异结合能力也强。（2）分子识别单位（MRU）:也称为超变区多肽，是由单个CDR区构成的小分子抗体，亲和力较低。双链抗体(bispecific antibody, bsAb)有两个不同的抗原结合部位，可分别结合两种不同的抗原表位。其中一个可与靶细胞表面抗原结合，另一个则可与效应物结合，将效应物直接导向靶细胞。抗体偶联物放射性同位素标记的抗体治疗药物、抗癌药物偶联的抗体药物、毒素偶联的抗体药物抗体融合蛋白Fv抗体融合蛋白：与毒素、酶、细胞因子等融合，导向治疗 Fc抗体融合蛋白：与抗体、蛋白融合，检测、纯化、介导抗体效应功能、提高蛋白半衰期
16、第五章 疫苗及其制备技术1.疫苗：将病原微生物（细菌、病毒、真菌、立克次氏体、支原体、衣原体等）及其代谢产物，经过人工减毒、灭活或利用基因工程等方法制成的用于预防传染病的免疫制剂，例如流感疫苗、乙肝疫苗、霍乱疫苗等。2.疫苗的组成：具有免疫保护性的抗原（免疫原性，产生免疫效应物质；免疫反应性，产生免疫反应），如蛋白质、多肽、多糖或核酸等，与免疫佐剂（增强免疫应答；改变免疫应答类型）混合制备而成。3.疫苗的作用原理：当机体通过注射或口服等途径接种疫苗后，疫苗中的抗原分子就会发挥免疫原性作用，刺激机体免疫系统产生高效价特异性的免疫保护物质，如特异性抗体、免疫细胞及免疫因子等，当机体再次接触到相同的
17、病原菌抗原时，机体的免疫系统便会依循其免疫记忆，迅速制造出更多的保护物质来阻断病原菌的入侵，从而使机体获得针对病原体特异性的免疫力，使其免受侵害二得到保护。3.减毒活疫苗、灭活疫苗的优缺点 P114-1154.减毒活疫苗的优点:（1）通过自然感染途径接种，可诱导更全面的免疫应答；（2）可诱导较强的免疫反应，理论上只需要接种一次；（3）可能引起水平传播，扩大免疫效果；（4）一般不需要添加佐剂，生产工艺简单，价格低廉。减毒活疫苗的缺点 ：（1） 对免疫缺陷者较危险，且有可能出现毒力回复 ；（2） 可能造成环境污染而引发交叉感染等，并可能滞留在环境中形成传染源 ；（3） 缺损颗粒可能干扰免疫效果，产
18、品的分析评估较为困难 ；（4） 保存、运输条件要求较高 。5.灭活疫苗的优点（1） 制造工艺简单；（2）免疫原性的稳定性高；（3）易于制备多价疫苗。灭活疫苗的缺点 （1） 需要严格的灭活操作，保证疫苗中不含有灭活不完全的颗粒。（2） 常需进行多次接种，通常需2-3剂，且通常引起的是体液免疫，对细胞外感染的病原体较为有效，对病毒、细胞内寄生的细菌和寄生虫效果差甚至无效。（3） 接种灭活疫苗产生的抗体滴度随时间而下降，可用于免疫缺陷者（4） 灭活疫苗需要量大 6.纯化亚单位疫苗 P116（1）纯化亚单位疫苗：由单个蛋白或寡糖组成的疫苗，如从致病微生物中纯化出来的细菌脂多糖、病毒表面蛋白和去掉了毒性
19、的毒素，称为纯化亚单位疫苗。例如23价肺炎多糖疫苗，无细胞百白破疫苗等。（2）纯化亚单位疫苗常需要佐剂或各种偶合物来增强它们的免疫原性，而且，这些疫苗的生产通常需要大规模培养致病微生物，成本较高，也具有一定的病原微生物扩散的隐患。减毒疫苗、灭火疫苗和亚单位疫苗的区别：7.治疗性疫苗：以治疗疾病为目的的疫苗。8.预防性疫苗与治疗性疫苗的区别：第六章 酶工程制药1.酶的来源：动物、植物、微生物。常见的产酶微生物：大肠杆菌；枯草杆菌；啤酒酵母；青霉菌；链霉菌（微生物种类繁多；微生物生长繁殖快；生产成本低；微生物较易育种）2.酶纯化的主要方法：酶初步纯化：一般采用盐析、等电点沉淀、有机溶剂沉淀和离心分
20、离等技术将目的酶与其他杂蛋白分离开来。（简便、处理量大）酶的高度纯化：凝胶过滤、离子交换层析、吸附层析、亲和层析等分辨率高的手段对酶进行进一步纯化。一般用总活力回收率和比活力提高倍数两个指标来衡量评价分离纯化的效率。3.固定化酶的优缺点：优点：易于纯化，产品质量高；可以在长时间内多次使用；在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；酶反应过程能够加以严格控制；酶的利用率提高；较游离酶更适合于多酶反应；资源获取方便，减少污染缺点：固定化时，酶的活性有损失；增加了生产成本，工厂的初始投资大；只适用于可溶性底物，而且较适用于小分子底物，对大分子底物不适用；与完整菌相比，不适宜于多酶反应，特别是需要辅助因子的
21、反应；胞内酶通常需要经过酶的分离纯化过程5. 酶固定化法：传统： 载体结合法：将酶结合于不溶性载体上。A.物理吸附法：对酶的催化活性影响小，但酶和载体之间的结合力弱（范德华力、氢键、疏水作用、静电作用等）；B.离子结合法：能得到酶活回收率较高的固定化酶，但酶和载体结合力较弱（多糖类离子交换剂和合成高分子树脂）；C.共价结合法：固定化酶与载体结合比较牢固，有良好的为稳定性和重复使用性，但固定化酶活性损失较严重。 交联法：不使用载体；制备较难，酶活损失较大，一般作为辅助手段 包埋法：优点：条件温和，基本无酶构象及分子的化学变化，酶活力回收率高缺点：易泄漏，机械强度差、扩散受限制、传质阻力较大，不宜
22、催化大分子底物新型：（条件较温和、酶活损失较小、固定化效率较高），包括耦合固定化；无载体固定化；定向固定化6.固定化细胞的方法：吸附法；包埋法；交联法；细胞絮凝法7.固定化酶（细胞）性质的改变： 酶活力的改变：固定化酶活力小于天然酶，专一性也会发生改变 酶稳定性的提高：热稳定性；对有机试剂及酶抑制剂的稳定性；对pH、蛋白酶、贮存和操作条件的稳定性 酶最适pH的改变：负电荷载体制备的固定化酶，最适pH提高；反之亦然 酶最适温度提高 氏常数Km的改变：Km随载体的带电性能变化。8. 酶反应器：用于各种酶进行催化反应的容器及其附属设备9. 修饰酶的特点 P171（1） 热稳定性提高（2）抗原性减弱（
23、3）半衰期延长（4）最适pH改变（5）酶学性质改变10.突变酶 P163（1）突变酶mutational enzyme是指采用基因工程技术对天然酶基因进行剪切、修饰或突变，通过表达修改的基因获得在酶学性质上复合需要的酶。（2）DNA突变的方法主要有两类：定点突变和随机突变。第七章 发酵工程制药1.微生物发酵类型，重点掌握每一类的代表性应用 P185-186（1）微生物菌体发酵，主要应用于面包业的酵母发酵及用于人类或动物食品的微生物菌体蛋白发酵两种类型。特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高。（2）微生物的酶，如用于抗癌的天冬氨酸酶、用
24、于治疗血栓的纳豆素酶和链激酶以及用于医药工业的青霉素酰化酶等。特点：为了提高酶的生产能力，就必须解除酶合成的控制机制。（3）微生物的代谢产物发酵，抗生素是最大一类由发酵生产的微生物次级代谢产物，具有广泛的抗菌和抗癌、抗病毒、抗虫等生物活性。A.初级代谢产物：对数生长期产生；对菌体的生长、分化、繁殖是必需的；氨基酸、蛋白质、核苷酸、核酸、维生素、糖类等B.次级代谢产物：生长稳定期产生；与菌体生长繁殖无明显关系；抗生素、生物碱、色素、酶的抑制剂、细胞毒素等（4）微生物转化发酵，应用最广泛的微生物转化发酵是甾体的生物转化，能制备许多载体药物中间体，并能使化学方法难以反应的部位发生反应。具有立体专一性
25、强、转化条件温和、转化效率高和对环境无污染等优点。（5）生物工程菌发酵，发酵制药所用的生物菌种不仅仅局限于天然微生物范围，已发展了大量的新型工程菌株，以生产天然菌株不能生产或产量很低的生理活性物质，拓宽了微生物制药的范围。1.按发酵类型分，微生物发酵生产药品产品有哪几种？各有什么特点？（1）抗生素类特点:70%以上由微生物发酵产生（2） 氨基酸类特点:单个氨基酸制剂，复方氨基酸制剂（3）核苷酸类: 肌酐酸、三磷酸腺苷（4）维生素类: 维生素或维生素前体（5）甾体类激素生产过程中的特异转化反应（6）多糖类:透明质酸、右旋糖酐（7）治疗酶及酶抑制剂酶抑制剂：钝化酶抑制剂、代谢酶抑制剂2.发酵工程制
26、药的特点：微生物菌种室进行发酵的根本因素，通过变异和菌种选育，可以获得高产的额优良菌株并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得常规方法难以生产的产品；发酵的理论产量很难从物料平衡中 计算，存在一个“生物学变量”的概念，一般为10%左右；在常温常压下进行，反应安全，要求条件简单；必须在无菌条件下进行；反应的专一性，可以得到较为单一的代谢产物；在发酵中可采用定向发酵、突变生物合成和杂合生物合成等手段得到化合物结构明确的产物；投资少、见效快、并可以取得较显著的经济效益。3.理想的工业发酵菌种应符合的要求：4.菌种选育的方法：自然选育：产量低，需进一步人工改造；自发突变（频率低，出现高产菌株的几率极低
27、）与定向培育（成功例子：抗性突变株的筛选）；诱变育种：方法简单、快速和收效显著，能产生营养缺陷型菌株；杂交育种：具有更强的方向性或目的性；原生质体融合：又称细胞融合；基因工程育种11. 菌种保藏方法 P193-194菌种保存方法优缺点斜面低温保藏法（16个月）1.简便易行，容易推广，存活率高2.保藏期短，传代次数多，易被污染石蜡油封存法（12年）1.广泛适用于各大类微生物菌种的中期保存 砂土管保藏法（110年）1.保藏期长，效果好，经济简便麸皮保藏法（产孢子的霉菌和某些放线菌，1年以上）操作简便，经济实惠，工厂采用较多甘油悬液保藏法（-20，0.51年；-70 ，10年）简便，但需置备低温冰箱
28、冷冻真空干燥保藏法（515年）液氮超低温保藏法（15年以上）宿主保藏法（专性活细胞寄生微生物）无体现12发酵工程制药的过程与控制（1）种子的扩大培养：是指将保存的生产菌种接入试管斜面活化后，再经过扁瓶或摇瓶及种子罐逐级扩大培养，最终获得一定数量和质量的纯种过程。级数越大，越难控制，易染菌，异变易，一般控制在24级。目的：满足发酵罐所需种子的需求。接种量：10%的接种量。种龄：对数生长期（2） 微生物的发酵方式：根据操作方式的不同液体发酵可分为：分批发酵；补料分批发酵;半连续发酵;连续发酵（3） 发酵过程中的中间分析项目： 产物产量：测定方法：化学测定法（简单迅速，但容易受其他杂质或类似化合物的
29、干扰）；生物测定法（生物法以抗生素的杀菌能力为衡量效价的标准。灵敏度高，需用的检品量较小，这是其它方法不能比的。但此法得到结果比较慢，需经过1618小时培养。生物法常用于发酵终了产品效价的测定。） pH的变化 糖：糖的消耗反映产生菌的生长繁殖情况；反映产物合成的活力 氨基氮和氨氮：氮利用快慢可分析出菌体生长情况，含氮产物合成情况。但是氮源太多会促使菌体大量生长。有些产物合成受到过量铵离子的抑制，因此必须控制适量的氮。通过氨基氮和氨氮的分析可控制发酵过程，适时采取补氨措施。发酵后期氨基氮回升，这时就要放罐，否则影响提取过程。 磷含量 菌浓度和菌含量：菌形态和菌浓度直接反映菌生长的情况。菌形态：显
30、微镜观察12. pH对发酵的影响：pH影响酶的活性；pH值影响微生物细胞膜所带电荷的改变；pH值影响培养基某些成分和中间代谢物的解离；pH影响代谢方向13. 影响发酵pH的因素：引起发酵液pH下降的因素：培养基中碳、氮比例不当，碳源过多，特别是葡萄糖过量，或中间补糖过多，加之溶解氧不足，致使有机酸大量积累而使pH下降；消沫剂加的过多，生理酸性物质的存在及氮被利用等。引起发酵液pH上升的因素：培养基中碳、氮比例不当，氮源过多，氨基酸释放等；生理碱性物质存在，中间补料中氨水或尿素等碱性物质加入过多等。14. PH的控制方式： 基础培养基调节pH 在基础料中加入维持pH的物质 过补料调节pH 补料与
31、调pH发生矛盾时，加酸碱调pH 择合适的pH调节剂 酵的不同阶段采取不同的pH值第八章 微生物转化1.微生物转化：是微生物通过其代谢过程中产生的某一个酶或一组酶催化将一种物质（底物）转化成另一种高活性物质（产物）的一种或多种化学反应。包括羟化反应、氧化反应、还原反应、水解反应、缩合反应等多种类型。2.微生物转化反应的特点：以具有活性中心和特殊空间结构的酶作为催化剂； 对作用的基质具有严格的选择性和专一性； 催化反应的速度极高，非一般催化剂可比； 一般在常温常压下进行，反应条件温和。3. 甾体微生物转化反应的特点：不同于常规的发酵过程，甾体药物大都不溶于水，且终反应产物对改造位点的专一性要求高。
32、影响转化率的重要因素：专一、有效的菌体量的多少，以及甾体底物在水相的溶解性等4.甾体微生物转化的主要反应类型：羟化反应；氧化反应；脱氢反应；甾体边链降解5.甾体微生物转化羟化的机制：微生物转化甾体的羟化酶多是细胞色素P450依赖型，P450作为末端氧化酶，需要利用分子氧以及与NADPH-依赖的脱氢酶相连接的电子转移系统。羟化酶所转化的羟基由空气中的氧直接取代甾体上的氢形成，因此工业上利用黑根霉菌 转化甾体时需要充分供氧6.微生物转化中药的途径微生物将中药中的有效成分经代谢形成新的化合物；微生物将原本没有活性的化合物转化成有活性的化合物；微生物产生的某些次级代谢产物与中药中的某些物质发生反应形成
33、新的化合物； 生物在中药的特殊环境中有可能改变自身的代谢途径，从而形成新的活性物质或者改变活性成分的比例； 生物的分解作用有可能将中药中的有毒物质降解，从而降低药物的毒副作用第九章 蛋白质药物的化学修饰1.蛋白质药物化学修饰的概念、意义、修饰后蛋白质性能改善的原因。（1）蛋白质的药物化学修饰:通过基团的引入或去除而使蛋白质的一级结构发生改变的过程。主要是指在分子水平上对蛋白质药物进行化学改造，通过对主链的切割、剪接及化学基团的引入，实现对蛋白质药物理化性质和生物活性的改变，属于蛋白质改性的范畴。（2）意义: 循环半衰期延长 免疫原性降低或消失，毒副作用减小 物理、化学、生物稳定性增强（3）原因
34、: 蛋白质经化学修饰后，相对分子质量(Mr)增大，当Mr达到或超出肾小球过阈值时，化学修饰的蛋白质随血液循环进入肾脏后就可以逃避肾小球过滤作用;同时，由于修饰剂的屏蔽效应，使得修饰后的蛋白质或多肽不易受到各种蛋白酶的攻击，降解速率明显降低，稳定性提高，可以在血液循环中停留更长时间; 修饰剂能掩盖蛋白质表面的抗原决定簇，使得蛋白质不能与各种细胞表面受体结合，不被机体的免疫系统识别，避免了相应抗体的产生，降低了蛋白质的免疫原性; 修饰剂与蛋白质偶联后能赋予其优良的理化性质，因而改善蛋白质的生物分布和溶解性能。2.修饰剂选择要考虑的问题与修饰策略。（1）考虑的问题: 修饰剂的毒性、抗原性及稳定性 修
35、饰剂的反应活性及对修饰位点的选择 修饰剂与蛋白质连接键的稳定性 修饰剂对蛋白质构象及生物活性的影响 是否适合于建立快速、方便的分析、分离及纯化方法 修饰剂是否价廉易得（2）修饰策略: 随机修饰策略-蛋白质分子表面游离赖氨酸残基的-NH2和N-末端氨基酸残基的-NH2,两者具有较高的亲核反应活性，是蛋白质化学修饰中最常用的被修饰基团。 定点修饰策略-由于蛋白质分子中巯基含量较少，利用巯基的高亲和性，选取能够特异性与巯基偶联的化学修饰剂，可以对蛋白质分子进行定点修饰。3. 选择PEG修饰剂药考虑的因素、PEG随机修饰常采用的PEG活化方法和PEG定点修饰可选用的修饰靶点及修饰策略。【1】 选择PE
36、G修饰剂要考虑的因素：PEG的Mr （一般PEG的Mr越大，修饰蛋白的活性损失越大、免疫原性越低、稳定性越高、生物半衰期越长。随机修饰的风险越大） 修饰位点 （在第一代Mr20000的PEG修饰中，随机修饰，PEG交联的基因是末端的-NH2和赖氨酸的-NH2,交联度不均一,没有特异性,PEG修饰后的蛋白质产物是混合物,修饰蛋白的分离纯化困难;第二代Mr）20000de PEG修饰为定点修饰（特异性） 水解稳定性和反应活性：水解稳定性和反应活性取决于活化基团的稳定性和修饰反应的条件控制，特别是PH的控制。一般来说，PEG稀释剂的反应活性越高，则其稳定性越差，容易水解。【2】PEG随机修饰的活化方
37、法：（得到的 产物不均一；质量不易控制；活性损失大） 氰脲酰氯活化法（反应简单、易行，但由于氰脲酰氯的毒性以及卤原子过强的亲核活性使其应用受到一定的限制。） 溴化氰活化法（简单易行，而且反应环境温和，但偶联后的异脲键不稳定。另外，由于溴化氰有毒，操作须在通风橱进行。） N羟基琥珀酰亚胺活化法（无水条件下）羰基二咪唑活化法（无水条件、缓冲液不可含有胺类） 基氯甲酸酯活化法 光气参与的活化方法。【2】 PEG定点修饰可选定的修饰靶点： 氨基（易造成活性损失）：N-端-NH2的定点修饰；定点突变去多余的氨基后修饰（只保留末端氨基酸，突变赖氨酸）；保护剂定点保护与脱保护修饰（FMOCHE BOC保护剂
38、。在保护和脱保护的过程中常常会破坏蛋白质的结构，易造成蛋白质活性损失）；氧化去氨基反应后修饰（磷酸吡哆醛，该方法有利于白虎蛋白质的生物活性，但只有当蛋白质的末端氨基酸暴露在分子表面的情况下才易于PEG试剂偶联，限制其应用） 羧基：修饰位点包括天冬氨酸、谷氨酸及C-端羧基。在DCC与EDC存在下，羧基可与氨基PEG结合。一般可选用mPEG-酰肼（更适宜）或m-PEG-胺为修饰剂。 巯基（含量少、亲核性高）：包埋于蛋白质内部的巯基修饰；基因工程技术引入巯基后再进行修饰（常引入位置：糖蛋白的糖基化位点、蛋白质的抗原决定簇、蛋白质末端）；二硫键的定位修饰（此反应不会造成蛋白质的不可逆变性，二硫键还原后
39、能保持蛋白质的三级结构；双烷基化PEG试剂对二硫键的选择性高，且由于PEG分子的空间屏蔽作用，一个二硫键只能结合一个PEG分子） 非天然氨基酸【4】修饰策略：蛋白质方面，通过蛋白质的定点突变、蛋白质可逆性位点定向保护、非天然氨基酸的引入等，以引入或留有单一的供修饰团； PEG的活化形式，即通过选择PEG的活化形式来实现与特定基团的反应 反应条件的控制，即通过控制pH值、温度、金属离子或酶的催化等实现定向修饰4.蛋白质药物糖基化修饰可用的多糖及修饰策略。（1）许多糖类及其衍生物被广泛应用于蛋白质药物的化学修饰研究，常用作修饰剂的糖有： 右旋糖酐类、肝素类、甘露聚糖、硫酸软骨素、壳聚糖、-环糊精等
40、。 （2）糖类对蛋白质的化学修饰多为随机修饰。糖类用于修饰蛋白质药物之前，也需要经过活化，目前常用的活化剂有：高碘酸钠、溴化氰、氰尿酰氯和碳二亚胺等。 高碘酸钠氧化法： 高碘酸钠通过氧化邻双羟基结构而将葡萄糖环打开，形成的高活性醛基能与蛋白质分子上氨基反应，使糖基修饰剂和蛋白质共价结合。 溴化氰活化法 ： 糖分子上邻双羟基在溴化氰作用下活化，然后在碱性条件下与蛋白质分子上氨基反应,产生共价结合。 氰脲酰氯活化法 ： 用氰脲酰氯活化糖分子上羟基，然后和蛋白质分子上氨基反应。 碳二亚胺活化法：用碳二亚胺活化糖分子上的羧基，然后与蛋白质分子上氨基偶联,完成修饰反应。 6.用人血清蛋白、脂肪酸、糖肽、
41、卵磷脂修饰蛋白质药物的方法与优越性。（1）血浆蛋白质 血浆中的天然成分，它们和其他蛋白质所形成的复合物在血液中有可能被视为“自体蛋白”而被接受。 同时，由于血浆蛋白质具有较大的分子量，在改进蛋白质性质上效果明显，因此被认为是具有较大优越性和前途的一类修饰剂。 其中，人血清白蛋白是目前研究较多的一种蛋白质化学修饰剂，其修饰方法主要有以下三种。：戊二醛法 、碳二亚胺法 、活性酯法 。（2）用脂肪酸修饰 经过活化的脂肪酸可以在温和的条件下与蛋白质药物的氨基发生酰化反应，从而在药物分子上偶联不同链长的脂肪酸，进而改善被修饰蛋白的理化性质和体内外活性。 常用作修饰剂的脂肪酸包括乙酸、丙酸、癸酸、辛酸、月
42、桂酸、棕榈酸、硬脂酸等。 以棕榈酸为例，可以用氯化亚砜对棕榈酸进行酰化，使其成为活化的棕榈酸（棕榈酰氯）后再与蛋白质反应获得修饰产物。虽然修饰后的蛋白质分子量增加不明显，但修饰后的蛋白质在热稳定性、酸碱稳定性、抗蛋白酶、抗有机溶剂方面都较未修饰蛋白有所提高。这主要是由于棕榈酸含长的疏水尾巴，可以遮盖影响蛋白质的敏感位点。 （3）用糖肽修饰 糖肽一般是通过纤维蛋白酶或蛋白水解酶降解人纤维蛋白或Y-球蛋白而得。 糖肽结构上的氨基经过活化后，可与被修饰蛋白质分子上的氨基结合。 常用以下两种方法：戊二醛法 、异氰酸法。（4） 卵磷脂 可以经多种活化剂如N-羟基玻珀酰亚胺等活化，再与蛋白质的氨基共价结合
43、。 卵磷脂-蛋白质修饰物除了可以增加被修饰蛋白质稳定性、延长其半衰期外，还可以提高被修饰蛋白对细胞膜和组织吸附能力。 第十章 新型生物技术制药1.核酸类药物：指的是那些具有特定碱基序列、可与在细胞中专一性地降低目标基因表达水平的寡聚核苷酸类药物。因此，核酸类药物制药技术的关键在于要根据分子生物学原理和目标基因的碱基序列进行药物设计。2.基因治疗：将外源正常基因的或者有治疗作用的基因导入靶细胞，以纠正或补偿基因缺陷和异常引起的疾病，以达到治疗目的的治疗方法。3.核酸类药物分类：反义核酸：是指可以与目标基因mRNA互补结合、并影响目标基因mRNA正常功能的一般寡聚核苷酸分子，又称之为反义RNA分子
44、。核酶：是一类具有催化活性的核酸分子。RNA干扰药物：是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA诱发的同源mRNA高效特异性降解的现象。4. RNAi的作用原理：双链RNA诱导RNAI的过程分为两个主要阶段：启动阶段：当细胞中由于病毒感染等原因出现双链RNA分子，或带有较长双链的发卡结构RNA时，细胞中一种称为Dicer的核酸酶就会识别这些双链RNA，并将其降解成21-23bp长的小干扰RNA。单链siRNA与一些蛋白质形成复合体，构成“RNA诱导的沉默小体”执行阶段：当目标mRNA与RISC中的siRNA完全配对时，RISC就会切割目标RNA，并由细胞中的核酸酶将其进一步降解，从而抑制目标基因
45、的表达。（1）基因治疗（gene therapy）是向靶细胞导入外源基因，以纠正或补偿基因缺陷，达到治疗遗传病目的。 （2）导入方式： a.离体导入（间接 ）In vitro ： 从患者体内分离细胞，进行体外培养，并导入正确的基因，然后将基因修饰过的细胞植回体内，通过它们在体内的定植、繁殖和表达目标基因，发挥修复基因缺陷的作用。特点：步骤繁琐、技术要求高，但效果和安全性较有保证。 b.体内导入（直接 ）In vivo ： 将携带正确基因的载体，包括病毒载体、非病毒载体、裸DNA等，直接注射到患者体内，由它们将基因导入目标细胞，进行基因表达，产生治疗作用。特点：操作简单、适用性广、是基因治疗发展的主要方向，但对基因载体要求较高。