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1、红河州第三人民医院检验科 文件编号：0001版本：第一版主题内容呼吸道感染病原体九联检操作程序生效日期：2016第 页 呼吸道九联检操作程序一、 呼吸道感染概述呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统。分为上呼吸道感染和下呼吸道感染，上呼吸道感染常见的是急性上呼吸道感染（acute upper respir tract infection），指鼻腔、咽或喉部急性炎症的概称，是呼吸道最常见的一种传染病。常见病因为病毒，少数由细菌引起。患者不分年龄、性别、职业和地区。不仅具有较强的传染性，而且可引起严重并发症。下呼吸道感染是最常见的感染性疾患，包括急性气管支气管炎、慢性支气
2、管炎、肺炎、支气管扩张等，由病毒、细菌、支原体、衣原体、军团菌等微生物引起，其防治应遵循预防为主、准确诊断、及时治疗的原则，治疗时必须明确引起感染的病原体以选择有效的抗生素。二、 免疫荧光法介绍免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（
3、fluorescent antibody technique）。 用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。这两种方法总称免疫荧光技术，因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。用免疫荧光技术显示和检查细胞或组织内抗原或半抗原物质等方法称为免疫荧光细胞（或组织）化学技术。荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作
4、简便，便于推广。该技术的主要特点是：特异性强、敏感性高、速度快。主要缺点是：非特异性染色问题尚未完全解决，结果判定的客观性不足，技术程序也还比较复杂。但近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，已经很好改善了这些缺点，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，应用在临床检验中。1原理免疫学的基本反应是抗原-抗体反应。由于抗原抗体反应具有高度的特异性，所以当抗原抗体发生反应时，只要知道其中的一个因素，就可以查出另一个因素。免疫荧光技术就是将不影响抗原抗体活性的荧光色素标记在抗体（或抗原）上，与其相应的抗原（或抗体）结合后，在荧光显微镜下呈现一种特异性荧光反应。其根据反应体系的不同可分为：直接法：将标记的特异性荧
5、光抗体，直接加在抗原标本上，经一定的温度和时间的染色，用水洗去未参加反应的多余荧光抗体，室温下干燥后封片、镜检。间接法：如检查未知抗原，先用已知未标记的特异抗体（第一抗体）与抗原标本进行反应，用水洗去未反应的抗体，再用标记的抗抗体（第二抗体）与抗原标本反应，使之形成抗原抗体抗体复合物，再用水洗去未反应的标记抗体，干燥、封片后镜检。如果检查未知抗体，则表明抗原标本是已知的，待检血清为第一抗体，其它步骤的抗原检查相同。根据抗原抗体反应后定量方法的不同可分为：荧光抗体技术(荧光显微镜技术)：抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判定结果的检测方法。免疫荧光测定技术：抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定荧光强度而
6、推算被测物浓度的检测方法。2.荧光物质 许多物质都可产生荧光现象，但并非都可用作荧光色素。只有那些能产生明显的荧光并能作为染料使用的有机化合物才能称为免疫荧光色素或荧光染料。所用荧光物质介绍：异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）：为黄色或橙黄色结晶粉末，易溶于水或酒精等溶剂。分子量为389.4，最大吸收光波长为490495nm，最大发射光波长520530nm，呈现明亮的黄绿色荧光，有两种同分异结构，其中异构体型在效率、稳定性、与蛋白质结合能力等方面都更好，在冷暗干燥处可保存多年，是应用最广泛的荧光素。其主要优点是：人眼对黄绿色较为敏感，通常切片标本中的
7、绿色荧光少于红色。三、 呼吸道九联检产品介绍九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂盒，采用间接免疫荧光法（IFA），同时检测人血清中呼吸道感染主要病原体的IgM抗体，可检的病原体包括：嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒1、2和3型。用于呼吸道感染疾病的辅助诊断。1.检测原理间接免疫荧光法（IFA）（图1）是基于待测样本中的抗体与吸附在载玻片上的抗原发生的反应。样本中存在的特异性抗体和抗原反应，未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤步骤中除去。在下一步骤中，抗原-抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应，用免疫荧光显微镜
8、观察结果。 图1图1：九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测试剂盒检测原理2. 试剂盒组成及用途组分成分和用途载玻片检测的物理载体，覆有聚四氟乙烯并包被有针对检测物的特异性抗原，包装袋内有一袋硅胶以防潮。质控品用于证明试剂盒及试验的有效性，含有人血清及防腐剂。吸附剂羊抗人IgG用来吸附人IgG避免干扰IgM 检测，含有防腐剂。FITC结合物荧光素标记的抗人免疫球蛋白结合物，含有染色液、防腐剂和蛋白稳定剂。和抗原抗体复合物反应，并显色。封闭介质甘油缓冲液，便于观察。磷酸盐缓冲液(PBS)用于洗涤步骤，从反应介质中除去未结合的免疫球蛋白和结合物。3. 操作步骤3.1 实验前准备1）实验所需物品准备：1
9、000ml量筒、1000ml烧杯、离心管、微量移液器、温育湿盒、洗瓶、水平摇床、恒温箱、盖玻片、荧光显微镜。2）PBS洗液的准备：将1瓶PBS粉末倒入烧杯中，加入1L蒸馏水中，摇匀直至完全溶解，配好后储存在2-8C备用。3）使用前，将所有试剂平衡至室温，将恒温箱调至37。3.2 实验步骤1）样本的稀释：按1:1比例稀释血清标本，即15L血清加入15L PBS中。阴阳性对照不需要稀释。2）用吸附剂处理稀释后的血清：将30L稀释后的血清加入150L吸附剂中，彻底混匀。阴阳性对照不需吸附剂处理。处理后的血清要离心10-15分钟除去沉淀，以防干扰检测。3）在载玻片的每孔中加15L吸附剂处理过的血清。在
10、一个载玻片的每孔中加入15L不稀释的阳性对照，在另一个载玻片的每孔中加入15L不稀释的阴性对照。4）将载玻片放入湿盒中，37温育90分钟。5）用PBS洗液的缓慢水流冲洗载玻片（避免直接冲入孔内）后，浸泡在PBS中并放置在水平摇床上轻轻摇动10分钟。将载玻片用蒸馏水缓慢水流冲洗（避免直接冲入孔内）。6）载玻片自然晾干。7）每孔加入15L FITC结合物溶液（不需稀释）。8）将载玻片放入湿盒，37温育30分钟。9）重复6和7的洗涤步骤。10）加几小滴封闭介质，小心盖上盖玻片。11）尽快用荧光显微镜在400倍放大率下观察结果。如果不能立即观察，可将其避光放置于2-8C不超过24小时。4结果判断4.1
11、有效性判断每一次试验都应设立阳性和阴性对照，以确认试验和试剂盒的有效性。观察到的荧光模式应为：阳性对照：腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性质控的1-15%细胞出现苹果绿细胞核、胞浆或胞膜荧光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时观察到着色的合胞）；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿荧光；支原体对阳性质控在细胞外围呈现苹果绿色荧光。阴性对照：军团菌、肺炎衣原体和立克次体无荧光，支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色。4.2样本结果判断阳性结果：可以观察到腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性血清的1-15%细胞的细胞
12、核、胞浆或胞膜出现苹果绿色荧光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时观察到着色的合胞）；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿色荧光；支原体对阳性血清在细胞外围呈现苹果绿色荧光。阴性结果：可观察到军团菌、肺炎衣原体和立克次体无荧光，支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色。4.3检验结果的解释1)每一批产品在放行前都要经过严格的内部质量控制（Q.C.）检验。质控品科溯源到经过内部确认的参考血清盘。2）如果所有细胞或第十孔出现荧光表明存在抗核和抗细胞抗体，不能判断为阳性，应用其他方法进行检验。当质控孔中吴荧光时一定要查明原因。3）由于非军团菌感染的病
13、人中经常出现交叉抗体，军团菌阳性的结果需结合临床症状综合评价。建议做较高稀释度的检测来提高阳性预测值。4）与说明书中所列结果不同不能判为阳性。5）在初次感染和再次感染的过程中。IgG和IgM抗体有不同的表现方式：初次感染时，几乎在所有的情况下IgM和IgG均出现（IgM早于IgG出现）；而再次感染时，可能会出现IgM。在许多疾病中病人的一生都可能存在高低度的IgG，而IgM一般情况下在感染后2-3个月存在血清中，因此IgM是近期感染的有效标志物。6）九种病原体IgM抗体阴性及阳性结果的荧光染色图谱：阳性结果荧光图谱：阴性结果荧光图谱：5.在使用本产品中所需注意事项如下：1）本产品用于体外诊断，
14、仅限专业人员使用。2）在使用前，建议用户仔细阅读和理解说明书，严格按照程序进行操作才能获得可靠的检测结果。特别是样本和试剂的正确吸取以及仔细的洗板、温育的时间控制对获得准确结果都很重要。另外使用前，应将所有试剂平衡至室温，载玻片要平衡至室温后再打开。3）每一次试验都应设立阳性和阴性对照，以确认试验和试剂盒的有效性。观察到的荧光模式应与说明书要求相符合，否则检验无效。4）洗涤时注意不要直接对着孔直接冲洗，以免冲洗掉已经固化反的应复合物。5）单一样本抗体检测结果不能帮助作出近期感染的诊断。应采集双份样本（急性期和康复期）同时检测来观察血清转化或抗体水平的明显升高。6）仅使用试剂盒内的组分，不要混用
15、不同试剂盒或不同厂家的试剂组分。只有PBS、吸附剂、封闭介质和载玻片可与其他批次VIRCELL IFA试剂盒通用，其它组分同批次可以混用。使用时，最好在无菌条件下操作试剂以防微生物污染。仅使用试验所需量的吸附剂、PBS、质控血清和结合物，剩余的试剂不要倒回瓶中。PBS溶解后储存在28 C一般为4个月，使用前需检查，如出现浑浊请勿使用。7）每步操作必须使用干净吸头，仅使用干净的耗材，最好是一次性使用的耗材。8）包装如有损坏请勿使用。9）切勿用嘴吸移液管加样。10）本试剂盒中的吸附剂、结合物和质控血清含有动物源性物质，质控血清还含有人源性物质。尽管本试剂盒中的人血清质控品已经测试为HBsAg、HC
16、V抗体和HIV抗体阴性,质控血清和病人样本仍应作为潜在感染性物质进行处理。孔内包被的经灭活的嗜肺军团菌血清1型、肺炎支原体、Q热立克次体、肺炎衣原体、腺病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒和副流感病毒 1、2和3型，也仍应视为具有潜在感染性并小心处置。目前没有方法可以确保这些或其他感染性物质不存在，因此所有的材料应视为具有潜在感染性进行处置，应遵守当地关于临床废弃物处理的法规。11）结合物、吸附剂、封闭介质和质控品含有叠氮钠（浓度0.1%），避免接触酸和重金属。12）封闭介质含有甘油，请勿接触酸和暴露在高温下。13）伊文斯蓝（浓度0.1%）是一种致癌物。请勿接触皮肤和眼睛。万一接触
17、到该溶液，用水彻底冲洗并到医院检查。14）仅按本说明书进行操作，不遵守规定的温育时间和温度会导致错误的结果。15）载玻片上病人样本交叉污染会导致错误结果，要小心操作防止发生。16）显微镜光学系统、光源条件和类型会影响荧光质量。17）不要将试剂不必要地放置在室温下过长的时间。18）每个载玻片只能使用一次。不要分割，也不要再使用没有用过的孔。19）试剂盒里的玻璃组分破碎时可能伤及身体，小心处理。20） 吸附剂加入样本后要注意观察是否有明显的沉淀出现。内容总结（1）呼吸道九联检操作程序呼吸道感染概述呼吸道感染是指病原体感染人体的鼻腔、咽喉、气管和支气管等呼吸系统（2）3）使用前，将所有试剂平衡至室温，将恒温箱调至37（3）PBS溶解后储存在28 C一般为4个月，使用前需检查，如出现浑浊请勿使用（4）7）每步操作必须使用干净吸头，仅使用干净的耗材，最好是一次性使用的耗材