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1、-急性白血病M4EO型患者ETV6基因重排及其意义-第 3 页【摘要】 目的 探讨在急性髓细胞白血病（aml）m4eo型患者中检测到etv6基因重排的临床意义。 方法 对3例amlm4eo患者骨髓标本进行细胞培养，制备染色体， 分析 核型，splitsignal fish技术分析12p13染色体易位，rtpcr检测etv6/arg融合基因产物。结果 核型分析显示3例患者均有inv(16)，splitsignal fish检出12p13染色体易位1例，rtpcr证实患者etv6/arg融合基因产物阳性。这是国际上第2例报道etv6/arg融合基因在amlm4eo中表达。结论 伴有etv6/arg
2、融合基因的患者对化疗不敏感，预后较etv6/arg融合基因阴性者差。splitsignal fish是检测etv6基因重排准确可靠的手段。【关键词】 白血病；etv6；原位杂交；聚合酶链反应1 资料与方法1.1 病例资料1.2 骨髓细胞培养及染色体制备方法取患者骨髓标本,在无刺激条件下培养1624?h后收获细胞,常规制备骨髓细胞染色体,进行r显带处理,核型根据人类细胞遗传学国际命名体制(iscn 1995)识别和描述。1.3 splitsignal fish分析对3例amlm4eo患者染色体标本进行荧光原位杂交检测其etv6重排情况。荧光原位杂交试剂盒、human coti dna、链霉亲和素
3、hrp工作液、dapi均购自美国invitrogen公司,缺口平移法标记探针dignick translation mix试剂盒、biotinnick translation mix试剂盒、抗digap、hnpp/fast red tr均为roche公司产品,质粒dna提取试剂盒为qiagen公司产品,去离子甲酰胺为amresco公司产品,严格按操作说明书进行操作。1.3.1 探针选取位于etv6基因两侧的基因序列(bac)作为探针。选取的两个人工合成的细菌bac序列均购自invitrogen公司,将含bac序列(rp11434c1和rp11525i3)的大肠杆菌进行扩增,用质粒dna提取试剂
4、盒提取目的dna,即为探针dna,分别用dignick translation mix、biotinnick translation mix标记，然后用quick spin columns(roche公司产品)纯化,最终得到纯化后的探针分别为dig525i3和bio407p10。探针变性液包括去离子甲酰胺、氯化钠/柠檬酸钠混合液(ssc液)、去离子水、浓盐酸。1.3.2 步骤染色体标本从-20?的冰箱中取出后,滴片,晾干,经2ssc,脱水，rnase a, 蛋白酶k处理,72?玻片变性,探针在76?变性液中变性5?min，置冰上5?min后于37?预杂交1?h，将探针滴加在玻片上,石蜡封片,3
5、7?湿盒过夜(16?h)。次日进行洗片,封闭，特异性免疫反应,染色,dapi复染,指甲油封片，室温避光放置24?h后荧光显微镜下观察结果。1.3.3 阳性细胞判断标准细胞核中可观察到3种情况： 2个红绿毗邻信号或者黄色荧光信号(由红色和绿色组合成的融合信号),提示etv6基因未发生重排； 1个红绿毗邻或黄色荧光信号和1红1绿分离存在的2个荧光信号，提示etv6基因发生重排； 2红2绿分离存在的4个荧光信号，提示同源染色体上etv6基因都发生重排。只要患者细胞中出现红绿荧光信号分离即为阳性。1.4 逆转录聚合酶链反应 对涉及12p13和1q25易位的患者采用rtpcr检测etv6/arg融合基因。trizol试剂盒购自美国invitrogen公司,逆转录pcr试剂盒购自大连宝生物工程有限公司。先从病人骨髓单个核细胞中提取rna,然后反转录成cdna。以etv6 f1:5atcgggaagacctggcttaca3 f2:5tgaagagcacgccatgcccattg3和arg r1:5tgcctggggttcaacatcac3r2:5tactgcctccagtcttgtct3为引物进行pcr扩增。扩增后取产物在琼脂糖凝胶中电泳,扫描并分析结果。