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1、植物DNA的提取与纯化 DNA extraction,实验一,实验原理,植物DNA的分离是分子生物学、遗传学和育种学等植物科学研究的基础要求。对DNA提取一般有三个要求：,1. DNA的纯度可以满足下游操作的要求,2. DNA必须完整,3. DNA应当有足够的量,构建基因组文库，初始DNA长度必须在100kb以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。 RFLP和PCR分析，DNA长度可短至50kb，在该长度以上，可保证酶切后产生RFLP片段(20kb以下)，并可保证包含PCR所扩增的片段(一般2kb以下)。,如果对植物进行大规模筛选，操作程序应当快捷，简便，价格低廉，并尽可能避免使用有毒
2、试剂。,核酸的理化性质 RNA和核苷酸的纯品都呈白色粉末或结晶，DNA则为白色类似石棉样的纤维状物。除肌苷酸、鸟苷酸具有鲜味外，核酸和核苷酸大都呈酸味。 DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水，RNA钠盐在水中溶解度可达40g/L。DNA在水中为10g/L，呈黏性胶体溶液。在酸性溶液中，DNA、RNA易水解，在中性或弱碱性溶液中较稳定。 天然状态的DNA 是以脱氧核糖核蛋白(DNP)形式存在于细胞核中。要从细胞中提取DNA时，先把DNP抽提出来，再把蛋白质和糖去除，同时除去RNA及无机离子等，从中分离DNA 。,核酸的提取方法
3、 提取植物DNA的方法主要采用SDS和CTAB法，对它们进行稍加修改就可以应用于DNA的微量提取。两种方法均采用去污剂裂解细胞并保护DNA不受内源核酸内切酶降解。 具体方法简单说来就是利用液氮对植物组织进行研磨，从而破碎细胞。细胞提取液中含有的SDS溶解膜蛋白而破坏细胞膜，使蛋白质变性而沉淀下来。EDTA抑制DNA酶的活性。再用酚、氯仿抽提的方法去除蛋白，得到的DNA溶液经乙醇沉淀。,实验材料和试剂,实验材料：新鲜植物组织。,100 mmol/L Tris-HCl (pH8.0) 50mmol/L EDTA 500 mmol/L NaCl 1.5% SDS,DNA提取缓冲液,实验所需试剂：,2
4、4:1/氯仿:戊醇 其它试剂：液氮、TE缓冲液，无水乙醇、70%乙醇。,2CTAB buffer 100mM Tris pH8.0 1.4M NaCl 20 mM EDTA pH8.0 2% CTAB 0.2% 巯基乙醇 酚/氯仿（1:1） 氯仿：50 ml 无水乙醇,实验仪器,实验步骤： 取新鲜叶片约3g, 剪碎, 加入液氮充分研磨后转移至2ml离心管中； 2. 在65预热的提取液中按3.8g/L加入Na Bisufite, 混匀并调pH至8.0； 3. 在管中加入适量提取液，60水浴保温约30min，不时颠倒混匀； 4. 冷却至室温后加入等体积氯仿/异戊醇，用力摇匀后，放置摇床上摇动15m
5、in左右； 5. 室温下10000rpm离心15min，小心吸上清于新的离心管中，加入两倍体积的冷酒精，-20 放置1h或过夜； 6. 挑出DNA置于新的管中，挑出有困难时可以低速离心后倒去上清。加入适量70%酒精，摇动洗涤10min，重复洗涤2-3次； 7. 吹干DNA，加入适量TE在65溶解，完全溶解后离心去除杂质； 加入RNase（10mg/mL）, 室温处理0.5-1h, 除去RNA，4或-20贮存。 如需纯化DNA，再加入适量TE，氯仿/异戊醇多次抽提后吸取上清，加入3ml/L NaAc和两倍体积的乙醇， -20 放置1h或过夜； 吹干沉淀后，加入适量TE， 65溶解， 4或-20贮存。,1. 植物叶子约3g, 剪碎置预冷研钵中,加入液氮充分研磨，注意不能干磨,混合球磨仪,3. 60水浴保温30-60min,加入等体积氯仿，用力摇匀,6. 再次10000rpm离心5min； 将上清小心吸入新的离心管中；,DNA样品在1% Agarose胶上电泳（例图）,实验注意事项,微量移液枪的使用一定要规范，吸取氯仿等有机试剂要注意不要将试剂吸入枪中； 提取过程中的机械力可能使大分子DNA断裂成小片段，所以为保证DNA的完整性，各步操作均应较温和，避免剧烈震荡。 尽量取材幼嫩组织，最好在早晨取材，可以避免过多的糖分污染,