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1、PCR技术的原理与方法,钟召迪,PCR定义,聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称，是一项在短时间内大量扩增特定的片段的分子生物学技术。 是指在DNA 聚合酶的催化下，以母链DNA 为模板，一特定引物为延伸起点，经过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出于母链模板DNA互补的子链DNA的过程。 可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等。,PCR反应特点,特异性强 灵敏度高 简便、快速 对标本的纯度要求低,PCR技术的基本原理,PCR的反应成分 PCR的反应基本步骤 PCR的反应体系,PCR的反应成分,模板DNA 引物 四种脱氧核糖核苷酸 DNA聚
2、合酶 反应缓冲液，Mg2,PCR的反应基本步骤,PCR的反应基本步骤 变性：高温使双链DNA解离成单链（94 ，30s） 退火：低温下，引物与DNA模板互补区结合（55 ， 30s ） 延伸：中温延伸，DNA聚合酶催化以引物为起点的DNA链延伸反应（7072 ，3060s）,PCR的反应体系,10扩增缓冲液 1/10体积 4种dNTP混合物 各200umol/L 引物 (2个) 0.2umol/L 模板DNA 102 105 Taq DNA聚合酶 1 2.5单位/反应体系 Mg2+ 1.52.5mmol/L 加双或三蒸水至 25 50ul,PCR反应五要素,引物（primer） 酶 （Taq
3、DNA polymerase） dNTP （dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 模板 （template） Mg2+ （magnesium）,引物,引物是PCR特异性反应的关键 PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度 理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，用 PCR就可将模板DNA在体外大量扩增,引物设计的原则,引物最好在模板cDNA的保守区内设计 引物长度一般在1530碱基之间 引物GC含量在40%60%之间，Tm值最好接近72 引物3端要避开密码子的第3位 引物3端不能选择A，最好选择T 碱基要随机分布 引物自身及引物之间不应存在互
4、补序列,引物设计的原则,引物5 端和中间G值应该相对较高，而3 端G值较低 引物的5端可以修饰，而3端不可修饰 扩增产物的单链不能形成二级结构 引物应具有特异性,酶及其浓度,目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应 天然酶：从栖热水生杆菌中提纯 基因工程酶：大肠菌合成 一个典型的 PCR反应约需酶量 2.5U（指总反应体积为100 ul时） 浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少,dNTP 的质量与浓度,dNTP的质量与浓度和 PCR扩增效率有密切关系 dNTP呈颗粒状， 保存不当易变性失活 dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris-HCl的缓冲液
5、将其pH调节到7.07.5，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解 在PCR反应中，dNTP应为50200umol/L，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制 ）， 如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量 dNTP 能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低,模板（靶基因，target gene）,模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一 传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K 来消化处理标本 SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SD
6、S 还能与蛋白质结合而沉淀 蛋白酶K 能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白, 再用有机溶剂酚与氯仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸,Mg2+浓度,Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响 在一般的 PCR反应中，各种NTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.52.0 mmol/L为宜 Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增， 浓度过低会降低 Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少,PCR反应条件的选择,PCR反应条件: 温度 时间 循环次数,温度与时间的设置,设置变性-退火-延伸三个温度点 标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变
7、性，再迅速冷却至40 60，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸 对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二温度点法， 将退火与延伸温度合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸,变性温度与时间,变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因 一般9394lmin足以使模板DNA变性 若低于93则需延长时间 但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。 此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败,退火(复性)温度与时间,退火温度是影响PCR特异性的较重要因素 变性后温度快速冷却至4060，可
8、使引物和模板发生结合。由于模板DNA 比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰撞 退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度 对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想,延伸温度与时间,延伸温度：一般选择在7075之间 常用温度为72 过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。 延伸反应时间：根据待扩增片段长度而定 1Kb以内的DNA片段，延伸时间1min（足够） 34kb的靶序列需34min 扩增10Kb需延伸至15min 延伸进间过长会导致非特异性扩增 对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些,循环次数,循环次数 决定PCR扩增程度 循环次数 主要取决于模板DNA的浓度 循环次数：选在3040次之间 循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多,谢谢！,