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1、PCR实验室设置、仪器配制,技术服务部 曾飞,目录,生物安全的概念,生物安全是指由动物、植物、微生物等生物体给人类健康和自然环境造成的危害以及人们所采取的防范措施。 生物安全是一个广义的概念，它涉及三个方面：,外来物种迁入导致的原生态系统不良改变或破坏； 人为造成的环境剧烈变化危机生物的多样性； 科学研究、开发、生产和应用中，病原或变异生物体的泄露对人类健康或生存环境所造成的危害。,PCR实验室安全防护等级,1. 危害等级I （低个体危害，低群体危害）不会导致健康工作者和动物致病的细菌、真菌、病毒和寄生虫等生物因子。 2. 危害等级 (中等个体危害，有限群体危害) 能引起人或动物发病，但一般情
2、况下对健康工作者、群体、家畜或环境不会引起严重危害的病原体。实验室感染不导致严重疾病，具备有效治疗和预防措施，并且传播风险有限。 3. 危害等级 III （高个体危害，低群体危害） 能引起人类或动物严重疾病，或造成严重经济损失，但通常不能因偶然接触而在个体间传播，或能使用抗生素、抗寄生虫药治疗的病原体。 4. 危害等级 (高个体危害，高群体危害) 能引起人类或动物非常严重的疾病，一般不能治愈，容易直接或间接或因偶然接触在人与人，或动物与人，或人与动物，或动物与动物间传播的病原体。,生物因子危害程度分级,PCR实验室安全防护等级,PCR实验室安全防护等级,根据安全防护等级，分子生物实验室一般分为
3、以下四级：,依据： 卫生部颁发的临床基因扩增检验实验室管理暂行办法（卫医发200210号） 医疗机构临床基因扩增管理办法（卫办医政发2010194号）,PCR实验室设计的一般原则,各区独立 注意风向 因地制宜 方便工作,“十六字口诀”,PCR实验室设计的一般原则,各区独立： 1.PCR实验室分区及各区独立： 1.1试剂储存和准备区； 1.2标本制备区； 1.3扩增区； 1.4扩增产物分析区； 如使用全自动分析仪，区域可适当合并； 2.各区物品独立： 各区必须有明确的标记，避免不同区域内的设备、物品混用。,PCR实验室设计的一般原则,注意风向： 1. 工作流向（进入实验室方向）：为避免交叉污染，
4、进入各个工 作区域必须严格遵循单一方向进行，即只能从试剂贮存和准备区 标本制备区扩增反应混合物配制和扩增区扩增产物分析区 ； 2.空气流向：应在样本制备区、扩增及产物分析区等相对可能出 现的“污染物”的区域安装负压系统（排风装置），在试剂准备 区安装正压系统（新风进气系统），以实现空气按照试剂准备区 标本制备区扩增（及产物分析）区方向流动；,PCR实验室设计的一般原则,理想的PCR诊断实验室设计方案,PCR实验室设计的一般原则,合理的PCR诊断实验室设计方案,PCR实验室设计的一般原则,PCR实验室设计的一般原则,传递窗：双刃剑 方便试剂物品在不同实验区间的传递； 增加交叉污染的风险； 设计原
5、则： 1.必须为双开门密封严实的； 2.两边门最好是连锁装置； 3.传递窗内应有紫外照射装置；,各区的工作内容及配置 -试剂储存和准备区,试剂准备区主要进行试剂的储存、分装和主反应混合液的制备。该区对于气流压力的控制，本区并没有严格的要求。,该区所需的主要物品包括： 1、冰箱（2-8、-20），用于试剂的储存； 2、超净工作台（最好配备），试剂配制的区域； 3、移液器一套（覆盖1-1000ul，一般0.1-10ul、5-50ul、20-200ul、100-1000ul）及配套吸头（带滤芯） ，用于试剂配制； 4、掌上迷你离心机； 5、震荡混匀仪； 6、离心管架、废液缸（利器盒）等； 7、消耗品
6、：一次性无粉乳胶手套、耐高压处理的离心管、一次性吸水纸； 8、安全级防护品：移动紫外线灯、专用工作服、 9、专用办公用品（签字笔及记录本等）；,标本制备区主要进行的操作为临床标本的保存、核酸(RNA、DNA)提 取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。 本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域（扩增区）为正压，以避免 从邻近区进入本区的气溶胶污染。 另外，由于在加样操作中可能会发生气溶胶所致的污染，所以应避免 在本区内不必要的走动。 该区所需的主要物品包括： 1、冰箱（2-8、-20或-80 ）； 2、生物安全柜； 3、移液器一套（覆盖1-1000ul，一般0.1-10ul、5-
7、50ul、20-200ul、100-1000ul）及配套吸头（带滤芯） ；,各区的工作内容及配置 -样本制备区,4、高速台式离心机（冷冻）、掌上迷你离心机（双转子）； 5、水浴锅或金属浴； 6、震荡混匀仪； 7、离心管架、废液缸（利器盒）等； 8、消耗品：一次性无粉乳胶手套、耐高压处理的离心管、一次性吸水纸； 9、安全级防护品：移动紫外线灯、专用工作服、 10、专用办公用品（签字笔及记录本等）； 11、核酸提取仪； 标本制备区是唯一直接与标本接触的区域，因此要注意生物安全问题，应 有洗眼器、并配备一个急救箱，箱内可放置75%乙醇、棉签、创可贴等急 用药具。,各区的工作内容及配置 -样本制备区,该区主要进行PCR扩增，本区的压力梯度要求为：相对于邻近区域（ 样本制备区）为负压，以避免气溶胶从本区漏出。为避免气溶胶所致 的污染，应尽量减少在本区内的不必要的走动。 所需的主要物品包括： 1、实时荧光PCR仪（含电脑打印机等）； 2、移动紫外线灯； 3、专用工作服； 4、消耗品：一次性手套、一次性吸水纸,各区的工作内容及配置 -PCR扩增区,实验室配置及预算,假装是超链接,