DNA及染色体的结构.ppt

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1、染色体与DNA,染色体 DNA结构 DNA的变性、复性和COt曲线,原核生物染色体及基因组, 基因组（genome）：是指细胞或生物体的全套遗传物 质，即生物体维持配子或配子体正常功能的全套染色体 所含的全部基因（DNA）。,比如人基因组的全长为大约3 X 109对碱基，编码 3-4万个 蛋白分子,细菌或噬菌体、病毒单个染色体中所含的全部基因（DNA）,原核生物DNA特点（P22）： 一般只有一条染色体，且大都带有单拷贝基因，只有少数基因（如rRNA）以多拷贝形式存在； 整个染色体DNA几乎全部由功能基因和调控序列组成； 几乎每个基因序列都与它编码的蛋白质序列呈线性对应状态。, 染色体DNA成

2、分占80，其余为RNA和蛋白质, 4.6 x 106bp的基因组DNA 与多种DNA结合蛋白组装成 E.coli的染色体, 基因组DNA为双链环状，总长度为11001400m，1400 个基因都已定位,大肠杆菌的遗传物质,质粒DNA （plasmid DNA）,细菌中另一类遗传物质,环状DNA，存在于染色 体之外，能自我复制,质粒也携带许多基因， 如：抗生素抗性基因,原核生物基因组特点（P30）,结构简练 存在转录单元（多顺反子） 存在重叠基因,真核生物染色体及基因组, C值（C-value）：在真核生物中，每种生物的单倍体 基因组的DNA总量总是恒定的，称为C-值,C值是每种生物的一个特征，

3、不同生物之间差别很大,低等真核生物中与形态学复杂程度相关，但高等真核生物 中变化很大, C值反常现象（C-value paradox C值谬误）： 形态学的复杂程度与C值的不一致,阴影部分为一个门内C-值的范围, 持家基因（housekeeping gene）：有些基因是在所有细胞类型中都表达的，即这些基因的功能为所有细胞所必需（或称组成型基因 constitutive gene）, 奢侈基因（luxury gene）：仅在某种特定类型的细胞中表 达的基因,* 大部分细胞生活周期里以染色质的形式存在（弥散状） M期染色体形式,* 染色质有两种型 a、常染色质：密度较低，能被表达 b、异染色质：

4、密度较高，不被表达（着丝粒、端粒）,组蛋白的特点（P24）： 进化上的极端保守性 无组织特异性 肽链上AA分布的不对称性 组蛋白的修饰作用 富含Lys的组蛋白H5,染色体上非组蛋白类型： HMG蛋白 DNA结合蛋白 A24非组蛋白,组蛋白与DNA的结合,核小体,核小体盘绕及染色质示意图,从DNA到染色体的过程,Compaction ratio = 8000,真核生物染色体DNA组装不同层次的结构,DNA （2nm）,核小体链（ 11nm，每个核小体200bp）,纤丝（ 30nm，每圈6个核小体）,突环（ 150nm，每个突环大约75000bp）,玫瑰花结（ 300nm ，6个突环）,螺旋圈（

5、700nm，每圈30个玫瑰花）,染色体（ 1400nm， 每个染色体含10个玫瑰花200bp）,真核基因组结构特点：,基因组庞大 存在大量重复序列 非编码区超过90% 单顺反子 断裂基因 顺式作用元件 DNA多态性 端粒结构,重复序列1、高度重复序列,卫星DNA（Satellite DNA）： 将DNA切成数百个碱基对的片段进行超速离心时，由于富含AT的简单高度重复序列区段浮力密度较小，因而很容易和总体DNA分开，即常在主要DNA带的上面有一个次要的带相伴随,a、分布于着丝点, 端粒区（原位杂交）, 结构基因两侧,（根据重复频率和大小又可分为卫星、小卫星和微卫星DNA）,b、往往没有功能，不转

6、录（着丝粒 纺锤体）,人类和其他动物中：短的串联重复 5-50 copies / genome 而且有共同的核心序列，但同一群体中重复次数变动很 大，个体间长度变化很大，可利用其得到DNA指纹图谱 （DNA finger printing）, 数目可变的串联重复或小卫星 ( Variable number tandem repeats . VNTR ),2、中度重复序列,10-104 copies,非洲爪蟾的18S、5.8S、28S rRNA ，不转录区间隔,3、 不重复序列：一个或几个拷贝,4、反向重复序列（inverted repeatitive sequence or inverted

7、repeats IR，又称回文序列）：指两段同样的核苷酸序列同时存在于一个分子中，但具有相反的方向,* 较短的回文序列可能是作为一种信号 如：限制性内切核酸酶的识别位点 一些调控蛋白的识别位点（转录终止）,C,反向重复序列间的间隔较短或无间隔,反向重复序列间的间隔较长,割裂基因（splitting gene） 不连续基因（discontinuous gene ） 断裂基因（interrupted gene）,概念：编码某一RNA的基因中有些序列并不出现在成熟 的RNA序列中，成熟RNA的序列在基因中被其它的 序列隔开,断裂基因的发现, 通过成熟mRNA（或cDNA）与编码基因的DNA杂交试 验

8、而发现,断裂基因,前体mRNA,Introns 去除 Exons 连接,核酸的化学组成,核酸,核苷酸,核苷,磷酸,碱基,戊糖,嘧啶Pyrimidines,嘌呤Purines,一、 含氮碱基、核苷、核苷酸, 碱基 Nitrogenous bases, 核苷（nucleotide）,嘧啶的1位N原子、嘌呤的9位N原子,核糖是戊糖 RNA核糖核苷 DNA脱氧核糖核苷,1,9, 核苷酸（nucleotide acid）,核苷的磷酸酯 脱氧核糖核苷酸 核糖核苷酸,Deoxynucleotides,其中和、和之间是高能磷酸键,dNTP,Ribonucleotides,核糖核苷三磷酸缩写为NTP,核苷酸的结

9、构和命名,腺嘌呤核苷酸（ AMP） Adenosine monophosphate,脱氧腺嘌呤核苷酸（dAMP） Deoxyadenosine monophosphate,H,OH,二、DNA分子的一级结构 (DNA sequence),1、 多聚核苷酸链 主链是核糖和磷酸 侧链为碱基,由3,5磷酸二酯键连接,2、 链的方向：同一个磷酸基的3酯键到5酯键的方向 (53),5-UCAGGCUA-3 = UCAGGCUA 默认书写顺序53,DNA、RNA的一级结构,DNA一级结构,3、 DNA一级结构的特点,a、脱氧核糖是其显著特点 DNA稳定的根本原因,DNA在高pH值时磷酸酯键非常稳定 只是碱

10、基存在构象的变化,酮式,烯醇式,酮式,烯醇式,b、RNA 在高pH时则稳定性很差,由于2OH导致的水解,c、主链是亲水的，侧链（碱基）是疏水的 主链脱氧核糖的羟基能与水形成氢键，而磷酸基团在生理条件下离解为负离子。 这些特点保证了多核苷酸链可形成稳定的构象。,4、 一级结构的概念 指DNA分子中的核苷酸排列顺序 不同生物借此贮存遗传信息 决定DNA的二级结构和高级结构,DNA的二级结构,* 提出 1953. Watson & Crick,右手 B- DNA Double helix Model,Phosphodiester Backbone,C-G,T-A,碱基互补, 直径2nm,* 双螺旋模

11、型（P34）, 螺距为3.4nm（任一条链 绕轴一周所升降的距离）, 每圈有10个核苷酸 （碱基）, 有大沟和小沟 配对碱基并不充满双 螺旋空间，且碱基对 占据的空间不对称, 两个碱基之间的垂直 距离是0.34nm，螺旋 转角是36度,Major Groove,Minor Groove,10 bp/turn, 大、小沟的差异, 大沟中碱基差异容易识别，往往是 蛋白质因子结合特异DNA序列的位点, 小沟相对体现的信息较少,二、 影响双螺旋结构稳定性的因素,l 氢键 (Hydrogen bond 46 kc / mol),弱键, 可加热解链,氢键堆积, 有序排列(线性, 方向),l 磷酸酯键 (p

12、hosphoester bond 8090 kc / mol),强键, 需酶促解链,* 维持稳定性的因素,DNA双螺旋结构的呼吸作用： DNA双螺旋结构中，配对碱基之间的氢键处于连续不断的断裂和再生的动态平衡中。,l 碱基堆积力 (非特异性结合力), 范德华力（Van de waals force） (1.7A/ 嘌呤环与嘧啶环 作用半径),(0.34 nm/碱基对间距), 疏水作用力 (Hydrophobic interaction),不溶于水的非极性分子在水中相互联合, 成串结合的趋势力，其中并无键的生成，即熵 值(Entrophy)S上升-热力学上的稳定态。,成为碱基间的部分堆积力,(磷

13、酸骨架, 氨基, 酮基周围水分子间的有序排列 ),非极性分子间（嘌呤和嘧啶碱基）的相互成串结合 熵值 上升(S going up),l 磷酸基团间的静电斥力，将DNA 双链分开,碱基内能增加(温度)，碱基排列有序状态的破坏，从而减弱 氢键结合力和碱基堆积力，破坏双螺旋,* 不稳定因素,l 0.2 mol / L Na+ 生理盐条件,消除DNA单链上磷酸基团间的静电斥力,三、双螺旋结构的多态性 （P36）,DNA结构的多态性：几种不同的DNA双螺旋结构以及同 一种双螺旋结构内参数存在差异的现象,原因：多核苷酸链的骨架含有许多可转动的单键 磷酸二酯键的两个P-O键、糖苷键、戊糖环各个键, B-DN

14、A来自相对湿度为92所得到的DNA钠盐纤维 A-DNA: RNA-DNA（转录） RNA-RNA RNA的核糖2-OH的存在，使之不能适应B构象，否则将与相邻的磷酸、核糖和碱基上的若干原子靠的太近而造成不安定状态。,Z-DNA调控基因转录的两个模式： 邻近调控 远距离调控,三种DNA双螺旋构象比较,A-DNA,Z-DNA,B-DNA,A B Z,外型 粗短 适中 细长,螺旋方向 右手 右手 左手,螺旋直径 2.55nm 2.37nm 1.84nm,碱基直升 0.23nm 0.34nm 0.38nm,碱基夹角 32.70 34.60 60.00,每圈碱基数 11 10 12,轴心与碱基对关系,2

15、.46nm 3.32nm 4.56nm,碱基倾角 190 10 90,糖苷键构象 反式 反式 C、T反式，G顺式,大沟 很窄很深 很宽较深 平坦,小沟 很宽、浅 窄、深 较窄很深,A,B,Z,A,B,Z,大沟宽,小沟窄,小沟窄,大沟变深,小沟宽深,大沟不存在,小沟窄而深,超螺旋（三级结构）和拓扑异构,螺旋和超螺旋电话线,螺旋,超螺旋,一、超螺旋（superhelix or supercoil）,最早在SV40和多瘤病毒中发现,超螺旋是所有线性或环形DNA共有的重要特征,DNA的三级结构指双螺旋DNA分子通过扭曲和折叠所形成的特定构象，包括不同二级结构单元间的相互作用、单链和二级结构单元间的相互

16、作用以及DNA的拓扑特征。,DNA超螺旋结构的形成,1、 超螺旋结构的方向性,正超螺旋（positive supercoiled ）,导致左手超螺旋,负超螺旋（Negative Supercoiled ）,导致右手超螺旋,超螺旋的形成总是要向着抵消初级螺旋改变的方向发展 所有生物的DNA几乎有5%为负超螺旋,？, DNA在水溶液中, 构型偏B型状态, DNA以10 bp/helix为最稳定构型, 小于10bp/helix 向正超螺旋发展(紧缠态), 大于10bp/helix 向负超螺旋发展(松缠态) 天然的DNA都是负超螺旋 但一些生命活动过程中存在正超螺旋（DNA 复制）,B-DNA的变化情

17、况：,二、超螺旋状态的描述 1、可用数学公式描述 L = T + W,L 连接数（Linking number ） 双链DNA的交叉数， 不发生链断裂时，L为定值,T 盘绕数（Twisting number ） 双链DNA的缠绕数，初级螺旋圈数,W 超螺旋数（Writhing number） 直观上为双螺旋在空间的转动数,W= 负值（negative superhelix） W = 正值 ( positive superhelix）,DNA超螺旋的形成,超螺旋的拓扑学公式： L=T+W,超螺旋数(W)改变的结果之一是产生超螺旋 或是在B-DNA中保留一单链区域，但须能量的供给 B-DNA是力学

18、上稳定的结构( 10 bp/ helix),2、体外可产生正超螺旋 溴化乙锭（Ethidium bromide EB） SV40的CCC分子,a、EB的插入只改变盘绕数T使其降低 但L值不变,WLT L值不变 T值降低 W正值 产生正超螺旋,DNA超螺旋结构形成的意义, 使DNA形成高度致密状态从而得以装入核中； 推动DNA结构的转化以满足功能上的需要。如负超螺旋分子所受张力会引起互补链分开导致局部变性，利于复制和转录。,由上看出，超螺旋概念的要点： 初级螺旋处于松缠或紧缠状态 与松弛形式相比具有额外的自由能,三、拓扑异构酶,拓扑异构体：只在连接数上有差别的同种DNA分子称为 这种DNA的拓扑

19、异构体,拓扑异构酶（topoisomerase ）：催化DNA由一种拓扑异 构体转变成另一种拓扑异构体的酶类,原核生物两类拓扑异构酶,除连环数（L）不同外其他性质均相同的DNA分子称为拓扑异构体（topoisomerase）。 DNA拓扑异构酶通过改变DNA的L值而影响其拓扑结构。 拓扑异构酶I 通过使DNA的一条链发生断裂和再连接，能使超螺旋DNA转变成松弛型环状DNA，每催化一次可消除一个负超螺旋，即L增加，反应无需供给能量。 拓扑异构酶II则刚好相反，可使松弛型环状DNA转变成负超螺旋DNA，每催化一次，L 减少，可引入负超螺旋。拓扑异构酶II亦称旋转酶，它可以使DNA的两条链同时断裂和

20、再连接，当它引入超螺旋时需要ATP提供能量。 细胞内两类拓扑异构酶的含量受严格的控制，使细胞内DNA保持在一定的超螺旋水平。,改变超螺旋的方式,结合到一条链上形成复合物,切断一条链形成酶和DNA的复合体,一条链穿越,重新连接,L=2,L=3,1、拓扑异构酶 (topoisomerase I),结果：连接数增加一个 (L+1),2、拓扑异构酶 Top II 旋转酶(gyrase) Top亚类之一 引入负超螺旋,作用于双链 涉及双链的 断裂和连接 即L ,3、拓扑异构酶的生物学功能,b、防止细胞DNA的过度超螺旋 多种拓扑异构酶的作用严格控制体内负超螺旋 维持在5%水平 种拓扑异构酶的单向突变对细

21、胞来说是致命的 因而一般两种拓扑异构酶的突变水平相当,a、恢复由一些细胞过程产生的超螺旋 如：复制叉前面正超螺旋的消除 转录酶前正超螺旋的消除，后面负超螺旋的产生,拓扑异构酶的反应本质：先切断DNA的磷酸二酯键，改变DNA的连接数（L）后再连接之，兼具DNA内切酶和DNA连接酶的功能，但不能连接事先已经存在的断裂DNA。 拓扑异构酶的断裂反应和连接反应是相偶联的。,DNA的变性、复性与Cot曲线,一、DNA分子的变性,1、变性（denaturation 或融解 melting）： DNA双螺旋区的氢键断裂，使双螺旋的两条链完全分开变成单链，这一链分离的过程叫做变性。,条件：加热，高pH，有机溶

22、剂（ 尿素、 酰胺 )，低盐浓度等, 熔液黏度降低 沉降速度加大 浮力密度上升 此外吸收值升高（A260nm），即增色效应 指在DNA变性的过程中，它在260nm的吸收值先是缓慢 上升，达到某一温度时及骤然上升,天然DNA和变性DNA的吸收值相差可达34,1.185,熔解曲线与Tm值,2、 常用的变性方法, 热变性, 碱变性,应用广泛，特别是用于变性动力学研究,缺点：高温引起磷酸二酯键的断裂，得到长短不一的单链,pH11.3时，全部氢键被淘汰,无热变性的缺点，为制备单链DNA的首选方法, 保存单链DNA的条件 保持pH大于11.3 盐浓度低于0.01mol/L,D.S DNA,S.S DNA,

23、Denaturation , Renaturation,复性过程依赖于单链分子间的随机碰撞,二、DNA分子的复性 （anneal or renaturation）,概念：变性DNA在适当条件下，两条彼此分开的链又可以 重新地合成双螺旋结构的过程（退火）,复性DNA分子不一定是原有的一对互补链,1、 影响DNA复性过程的因素 ：, S.S. DNA 的初始浓度 C0,DNA分子中，碱基排列情况（重复序列、单一序列）,3-ATCTATGCTGTCAT-5,5-TAGATACGACAGTA-3,5-TAGATACGACAGTA-3,3-ATCTATGCTGTCAT-5,3-ATATATATATAT-

24、5,5-TATATATATATA-3,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,5-TATATATATATA-3,3-ATATATATATAT-5,3-ATATATATATAT-5,5-TATATATATATA-3,二、C0t曲线复性动力学曲线, 遵循二级反应动力学,dCt / dt = -KC02,反应初始 t = 0, 单链DNA的随机碰撞 过程（ randomly collision ）,单链 DNA浓度 = C0,反应达 t 时,单链DNA浓度 = Ct,K复性速度常数,dCt / dt = -KC02 积分,Ct / C0 = 1 / (1+KC0t ),当

25、 Ct / C0 = 1/2 时,Ct / C0 = 1/2 = 1 / (1+ KC0t(1/2),K = 1 / Cot(1/2),Ct/C0是C0t的函数 按此公式作图得C0t曲线,C0t(1/2)值对DNA具有特征性，其中与基因组大小（DNA碱基对数）成正相关,Ct/C0,0,1,0,1,C0t(1/2) C0t(1/2),Fraction reassociated,1CtCo,复性动力学曲线（单链所占比例、双链所占比例）,在控制反应条件相同的前提下, 两种DNA分子的C0t(1/2)值取决于DNA分子序列的排列复杂性（最长的没有重复序列的核苷酸对的数值） ( 复性动力学的复杂性, Kinetic complexity, X ) XKC0t(1/2) K= 5 105,AAAAAAAA X = 1 C0t(1/2) = 210-6,ATCGATCGATCG X = 4 X = 5 105 C0t(1/2) = 1,复杂性,因此C0t曲线提供了一种测定DNA分子量的方法 同时也能解释单一来源的DNA所具有的不同复杂性部分 反应条件相同，单一序列DNA的C0t(1/2)越大，DNA序列越复杂（链越长）,