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1、DNA的粗提取与鉴定,实验思路,DNA的提取和鉴定,DNA从哪 儿提取？,怎样将DNA与 细胞中的其他 物质分离？,怎样鉴定 我们提取 的DNA？,内容解析,基础知识,DNA的物理化学性质,如何利用DNA的物理化学性质提取和鉴定DNA？,思考：,1.洗涤剂能溶解细胞膜，但不会破坏DNA,将DNA从细胞中提取出来,2、当氯化钠的物质的量浓度为 2 molL时，DNA的溶解度最大，浓度为 014 molL时，DNA的溶解度最低。,可以使DNA在盐溶液中溶解或析出,3、DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些物质则可以溶于酒精。,可以将DNA与蛋白质进一步分离,4、DNA与二苯胺在沸水浴条件下呈蓝色,
2、鉴定DNA,提取DNA的实验步骤,破碎细胞，获取含DNA的滤液,选取实验材料,去除滤液中的杂质,析出DNA,鉴定DNA,二、DNA的粗提取与鉴定的实验设计,（一）实验材料的选取,材料：鱼卵、猪肝、菜花、香蕉、鸡血、哺乳动物的红细胞、猕猴桃、洋葱、豌豆、菠菜、在液体培养基中培养的大肠杆菌。（从中选取23种实验材料）,原则：凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但选用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大,无细胞壁，将其加入蒸馏水中 ，使其破裂释放DNA,有细胞壁，需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜，进行充分的搅拌和研磨，才能使其破裂释放DNA,（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液,动物细胞
3、：,植物细胞：,讨论：加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？,答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解,实例：提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液,答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等,讨论：如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？,（三）去除滤液中的杂质,为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理,讨论：此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？,答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂
4、质,讨论：为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质,答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质,讨论：方案二与方案三的原理有什么不同？,答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。,（四） DNA的析出与鉴定,DNA的析出用的是与滤液体积相等的冷却的酒精溶液（体积分数为95 ） ，静置23min，溶液中会出现白色丝状物，这就是粗提取DNA。用玻璃棒
5、沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水,1、DNA的析出,2、 DNA的鉴定,鉴定DNA时在试管中先加入物质的量的浓度为2mol/L 的NaCl溶液5ml于两只试管中，其中一只加入DNA丝状物，各加入二苯胺4ml 试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min,待试管冷却后，比较两只试管中溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否有蓝色,（一）案例一：以鸡血为实验材料进行DNA的粗提取,三、实验案例,鸡血细胞极易吸水胀破，而用动物肝脏细胞作实验材料常常需要匀浆和离心，对设备要求较高，操作繁琐，历时较长,1、鸡血细胞做实验材料的原因,鸡血细胞核的DNA含量丰富，材料易得,2、实验原理,
6、 DNA在NaCl溶液中的溶解度，是随着NaCl的浓度的变化而改变的。当NaCl的物质的量浓度为0.14 molL时,DNA的溶解度最低。利用这一原理，可以使溶解在NaCl溶液中的DNA析出。, DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质可以溶于酒精溶液。利用这一原理，可以进一步提取出含杂质较少的DNA。, DNA遇二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。,3、实验材料和用具：,鸡血细胞液（510ml）；体积分数为95%的冷酒精溶液（实验前置于冰箱内冷却24h）；蒸馏水；质量浓度为0g/ml的柠檬酸纳溶液；务质量的浓度分别为2mol/L和0015mol/L的氯化纳溶
7、液；二苯胺试剂。铁架台；铁环；镊子；三角架；酒精灯；石棉网；载玻片；玻璃棒；滤纸；滴管；量筒（100ml，一个）；烧杯；（100ml，一个，50ml、500ml各二个）；试管（20ml，二个）；漏斗；试管夹；纱布。,4、课前准备鸡血细胞液,取质量浓度为01g/ml的柠檬酸纳溶液（抗凝剂）100ml，置于500ml烧杯中。注入新鲜的鸡血（约180ml），同时用玻璃棒搅拌，使血液与柠檬酸纳溶液充分混合，以免凝血。将烧杯中的血液置于冰箱内，静置一天，使血细胞自行沉淀。（也可以将血液倒入离心管内，用1000r/min（转每分）的离心机离心2min，血细胞沉淀于离心管底部。实验时。用吸管除去离心管上部的
8、澄清液，就可以得到鸡血细胞液。）,过程,柠檬酸钠作用,防止血液凝固,作用机理,柠檬酸钠能与血浆中的Ca2+发生反应，生成柠檬酸钙络合物，血浆中游离的Ca2+大大减少，血液就不会凝固,讨论：提取鸡血中的DNA时，为什么除去血液中的上清液？,答：血液分为两部分，一部分是血浆，一部分是血细胞，离心后除去的上清液是血浆,5、方法步骤,将制备好的鸡血细胞液5 mL10mL，注入到50 mL烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20 mL，同时用玻璃棒充分搅拌5 min，使血细胞加速破裂。然后，用放有纱布的漏斗将血细胞液过滤至500mL。取其滤液。,提取鸡血细胞的细胞核物质,鸡血细胞破碎以后释放出的DNA，容易被玻璃
9、容器吸附，所以在提取过程中为了减少DNA的损失，最好使用塑料的烧杯和试管盛放鸡血细胞液,注意事项：,讨论：,答：让细胞内浓度大于周围溶液的浓度，细胞会吸水以至胀破,（1）为什么要加入蒸馏水？加入蒸馏水后细胞会有什么变化？,（2）用玻璃棒搅拌有什么意义？,答：用玻璃棒搅拌可以加速血细胞和细胞核的破裂。注意应沿一个方向快速搅拌，但也不能太快太猛，防止打碎DNA,（3）滤去的是什么物质？得到的是什么？,答：过滤将滤去的是细胞膜和核膜等物质；得到的是与蛋白质等物质结合在一起的DNA,溶解细胞核内的DNA,将氯化钠的物质的量浓度为 2 mol/L的溶40mL加入到滤液中，并用玻璃棒沿一个方向搅拌1min
10、，使其混合均匀，这时DNA在溶液中呈溶解状态,沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现，注意观察丝状物呈什么颜色。继续加入蒸馏水，溶液中出现的粘稠物会越来越多。当粘稠物不再增加时停止加入蒸馏水（这时溶液中氯化钠的物质的量浓度相当于0.14 molL）,析出含DNA的粘稠物,讨论：加入蒸馏水的目的？,降低NaCl溶液浓度到使DNA溶解度最低点，使DNA从NaCl溶液中析出,将溶液中的DNA与其他杂质分离，这一步骤是实验成败的关键。实验中应该缓慢贴壁加入蒸馏水，并轻轻地沿一个方向不停地均匀搅拌，以利于DNA分子的附着和缠绕,注意事项：,滤取含DNA的粘稠物,用放
11、有多层纱布的漏斗，过滤步骤3中的溶液至 500mL的烧杯中，含 DNA的粘稠物被留在纱布上,将DNA的粘稠物再溶解,取 1个 50 mL烧杯，向烧杯内注入氯化钠的物质的量浓度为 2 molL的溶液 20mL。用钝头镊子将纱布上的粘稠物夹至氯化钠溶液中，用玻璃择不停地搅拌，使粘稠物尽可能多地溶解于溶液中,过滤含有DNA的氯化钠溶液,取1个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤步骤5中的溶液。取其滤液，DNA溶于滤液中,提取含杂质较少的DNA,在上述滤过的溶液中，加入冷却的、酒精的体积分数为 95的溶液 50mL（使用冷却的酒精，对DNA的凝集效果较佳），并用玻璃棒搅拌，溶液中会出现含杂质较少
12、的丝状物。用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分。这种丝状物的主要成分就是DNA,答：因为DNA不溶于冷酒精，而其他物质可以溶解在酒精中，使含杂质较少的DNA丝状物可以析出,悬浮于溶液中,讨论：,（2）观察丝状物呈什么颜色？,答：白色,（1）为什么要加50mL的冷酒精？,取两支20 mL的试管，各加入氯化钠的物质的量浓度为0015 molL的溶液5 mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4mlL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热 5 min，待试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化, DNA的鉴定,讨论：,答：有丝状物
13、的试管变成蓝色，另一试管还是原来颜色,（2）这一鉴定结果说明什么问题？,（1）比较两个试管中溶液的颜色有什么不同？,答：提取出的丝状物是DNA,（3） DNA的直径约为2010-10 m，实验中出现的丝状物的粗细是否表示1个DNA分子直径的大小？,答： DNA分子直径只有2 nm。丝状物是多个DNA子聚在一起形成的,答：整个实验共,第1次： 步骤1.细胞吸水胀破 第2次： 步骤3.使 DNA黏稠物析出,此实验过程中有几次使用蒸馏水？几次过滤？几次析出？几次搅拌？分别在哪一步？,【实验总结】,两次蒸馏水： 三次过滤： 两次析出： 六次搅拌：,两次蒸馏水：,过滤时使用的纱布层数与需用滤液或黏稠物有
14、关，第二次要用其滤出的黏稠物有关，所以要使用多层纱布，第一次和第三次均要用其滤液，使用的纱布为12层,三次过滤：,第1次：步骤1. DNA存在于滤液里 第2次：步骤4. DNA被留在纱布上 第3次：步骤6. DNA存在于滤液里,两次析出：,第1次： 步骤3.用0.14 molL 的NaCI溶液 （含杂质多）,第2次： 步骤7.用冷却的95的酒精,六次搅拌：,其中除第8步外，其余均要朝一个方向搅拌，在第三、五步搅动还要轻缓，玻璃棒不要直插烧杯底部，这样才能保证得到完整的DNA,第1、2、3、5、7步,1.在DNA的粗提取实验过程中，两次向烧杯中加蒸馏水的作用是( ),A.稀释血液、冲洗样品 B.
15、使血细胞破裂、降低NaCl浓度使DNA析出 C.使血细胞破裂、增大DNA溶解量 D.使血细胞破裂、提取含杂质较少的DNA,A.随着NaCl溶液浓度的增大，DNA在NaCl溶液中的溶解度也增大 B.随着NaCl溶液浓度的减小，DNA在NaCl溶液中的溶解度也减小 C.DNA在NaCl溶液中的溶解度与NaCl溶液的浓度无关 D.当NaCl溶液的浓度为0.14M时，DNA的溶解度最低,2.关于DNA在NaCl溶液中的溶解度，下面的叙述哪一个是正确的（ ）,3.2006.江苏 做DNA粗提取和鉴定实验时,实验材料用鸡血而不用猪血的原因是（）A.鸡血的价格比猪血的价格低B.猪的红细胞没有细胞核,不易提取到DNAC鸡血不凝固.猪血会凝固D.用鸡血提取DNA比用猪血提取操作简便,1.提取鸡血中的DNA时，为什么要除去血液中的上清液?,答：DNA的提取，关键是对杂质的去除，由于上清液是血液中的血浆部分，不含DNA，所以要除去上清液(含有蛋白质)。,2.实验中NaCl的物质的量浓度为2 molL和0.14 molL对DNA有何影响?,答：DNA在.1/的NaCl溶液中溶解度最小，因此前者作用是溶解DNA，后者是作用使DNA析出 。,