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1、第十一章 基于靶点结构的 药物分子设计,药物设计学,【学习要求】,1. 掌握基于靶点结构的药物设计、全新药物设计、计算机虚拟筛选、基于片段药物设计的基本概念。 2. 熟悉蛋白质三维结构预测法、分子对接方法及分类、基于片段药物设计的基本思路、基于片段药物设计的优点；片段筛选的主要检测技术；片段优化的常用方法。 3. 了解全新药物设计的常用方法、磁共振检测技术的分类和原理；SAR-by-NMR的原理和应用；Tether和二次Tether技术的原理；结晶筛选的研究流程。,基于靶点结构的药物设计 是指一般应用由X射线衍射、磁共振或分子模拟（同源建模法等）提供的蛋白质结构信息，来辅助设计具有生物活性的化
2、合物的过程。 基于配体结构的药物设计 是从研究一系列药物分子对同一受体的活性出发，比较它们的结构变化与生物活性之间的关系，找到对该受体能发生结合并产生活性的最普遍的结构因素，并根据此结构特征设计新的药物分子。,以靶点结构为主的药物设计可分为三大类,全新药物设计：根据靶点活性位点构建配体 分子对接：以靶点结构来搜寻配体 基于片段的药物设计：根据靶点活性位置来构建配体片段,基于生物大分子靶点结构的药物设计方法,第一节 靶蛋白结构的预测,蛋白质结构与功能研究已成为后基因组时代最具挑战性的研究课题。 当前测定蛋白质结构的主要方法仍然是X-射线晶体学方法和多维核磁共振技术。 蛋白质结构的测定速度却远远落
3、后于基因组测序和氨基酸序列的测定速度，无法满足蛋白组学及其相关的学科需要。,（1）目标序列与模板序列的比对； （2）根据同源蛋白的多重序列比对结果，确定同源蛋白的结构保守区以及相应的框架结构； （3）目标蛋白质结构保守区的主链建模； （4）目标蛋白质结构变异区的主链建模； （5）侧链的安装和优化； （6）对模建结构进行优化和评估。,同源模建的主要步骤,序列比对,序列比对是同源模建的关键，大多数的序列比对方法都是以目标蛋白质和模板蛋白质序列之间的相似性为基础的，其准确性可以通过进行多序列比对得到提高。目前常用的序列比对程序有FASTA和BLAST等。许多药物设计软件公司也开发了同源模建法预测蛋白
4、的软件模块，如Tripos公司的Composer、Accelyrs公司的Homology等。,折叠识别（fold recognition）,当目标蛋白质找不到已知结构的蛋白质作模板时，可以采用蛋白质折叠识别方法进行三维结构预测。 折叠识别法就是总结出已知的蛋白质结构模式作为目标蛋白质进行匹配的模式，然后经过现有的数据库的观察，总结出可以区分正误结构的平均势函数作为判别标准，来选择最佳的匹配方式。,从头预测（de novo prediction）,蛋白质结构从头预测是一个尚未成熟的研究领域，但发展潜力十分巨大。因为该方法不需要知道任何一个目标序列的同源蛋白质，仅从蛋白质的一级结构预测其高级结构，
5、一旦从头预测的方法获得重大突破，将有助于人们理解蛋白质折叠的过程，影响蛋白质结构稳定性的因素等基本问题。,活性位点的分析方法,通过探针来探测简单的分子或碎片如何能够与生物大分子的活性位点很好地结合。用于分析的探针可以是一些简单的分子或碎片，例如水或苯环作为探针，通过分析它们与活性位点的相互作用情况，可以找到这些分子或碎片在活性部位中的可能结合位置。,活性位点分析法通常不能直接产生完整的配体分子，但它得到的有关靶点结合的信息对后面的全新药物设计和分子对接等都有很好的指导意义。 代表性的活性位点分析方法的软件有GRID、MCSS和HINT等相关程序。,GRID,GRID程序由Goodford研究小
6、组开发，其基本原理是将靶点蛋白的活性部位划分为有规则的网格，应用分子力场的方法计算探针分子（水分子或甲基等）在不同的格点上与受体活性部位的相互作用能，以此解析探针分子与靶点活性部位的相互作用情况，发现最佳作用位点。 应用GRID程序研究流感病毒的重要靶点神经氨酸酶时，以氨为探针分子搜寻神经氨酸酶结合位点时发现用胍基取代抑制剂Neu5Ac2en的4-羟基，得到的化合物扎那米韦（zanamivir）活性大为提高，现已作为抗A型感冒病毒药物上市。,MCSS,MCSS是Karplus课题组发展的一种活性位点分析方法，其基本思路与GRID方法相似，但处理方式更为细致、深入。例如GRID方法中仅考虑探针和
7、蛋白质的非键相互作用，而MCSS法进一步包括了探子分子片段的构象能；GRID计算采用系统搜索法将探针分子片段依次放在每个格点上，而MCSS法将探针分子以多拷贝形式放置在活性口袋中，利用蒙特卡罗模拟结合分子力学进行优化来寻找最佳作用位点。,Adlington等应用MCSS对前列腺特异性免疫抗原（PSA）的活性位点进行了详细分析，以此对已有的PSA抑制剂进行结构优化，从而得到了迄今为止活性最高的PSA抑制剂，其IC50为（22610）nmol/L。,HINT,HINT（hydrophobic interaction）是Kellogg等研究的计算分子脂水分配系数及评价的程序，目前已商业化并已有SYB
8、YL和Insight下的版本。在SYBYL最新版本中，HINT已作为一个正式模块推出，并能够进一步计算和显示疏水场及两分子间的疏水相互作用，并为CoMFA计算提供疏水场值。,第二节 分子对接与虚拟筛选,分子对接（molecular docking）是通过研究小分子配体与靶点生物大分子相互作用，预测其结合模式和亲和力，进而实现基于结构的药物设计的一种重要方法。根据配体与靶点作用的“锁钥原理”，分子对接可以有效地确定与靶受体活性部位空间和电性特征互补匹配的小分子化合物。,一、分子对接,分子对接方法的分类,根据对接过程中是否考虑研究体系的构象变化，可将分子对接方法分为以下三类：刚性对接、半柔性对接和
9、柔性对接。 刚性对接是指研究体系的构象在对接过程中不发生变化； 半柔性对接是指在对接过程中研究体系中的配体构象允许在一定范围内变化； 柔性对接是指研究体系在对接过程中构象可以自由变化。,根据对接时配体分子的形式还可以将分子对接方法分为两种基本类型，即整体分子对接法和片段对接法。 整体分子对接法是运用特定搜索算法考察配体分子在靶点结合部位，根据评分函数找出最优结合方式。 片段对接法是将配体分子视为若干片段结构的集合，先将其中一个或几个基本片段放入结合空腔，然后在活性部位构建分子的其余部分，最终得到理论上最优的结合方式。,1. DOCK （1）应用程序产生一个填充靶点分子表面的口袋或凹槽的球集,
10、整理成假定结合位点。 （2）在假定结合位点上，应用一组球集表示配体，按照匹配原则确定配体与靶点的作用位点。 （3）评价打分，DOCK支持多种评分函数，可以评价靶点活性部位与配体几何形状互补性、范德华作用和静电作用等。,有代表性的分子对接软件,2. FlexX 第一步是选择配体的一个连接基团，称为核心基团； 第二步是将核心基团放置于活性部位，此时不考虑配体的其他部分； 最后一步称为构造，通过在已放置好的核心基团上逐步增加其他基团，构造出完整的配体分子。,3. Affinity 第一步是应用蒙特卡罗或模拟退火法计算确定配体分子在靶点活性口袋的可能结合位置； 第二步是通过分子力学或分子动力学方法进行
11、细致对接。,DOCK分子对接步骤,对配体和靶点结构分别加氢原子、力场参数和电荷 计算蛋白溶剂表面,结合部位模拟 计算结合部分能量网格,打分评价 寻找最佳匹配位置,分子对接应用举例,通过对HIV-1蛋白酶与天门冬氨酸蛋白酶的结构进行比较，并借助X-衍射波谱的结果，人们获得了高精确度（1. 8nm）的HIV-1蛋白酶的三维结构，并建立起该酶的结构模型。随后，Desjarlais等人根据其晶体结构中的酶活性部位，利用DOCK程序将剑桥晶体数据库中的10 000个分子与之进行分子对接，按照打分数值的高低排列。,然后对打分值最高的200个化合物进行严格筛选，评价这些分子能否与酶的Asp25发生相互作用。
12、最后发现溴哌醇具有较好的结合作用，经生物学实验测试表明，其Ki值为100mol/L，且选择性很高。,溴哌醇,高通量筛选的缺陷,传统的高通量筛选遇到许多问题，一方面是药理测试假阳性结果，另一方面是化合物样品来源短缺。尽管已报道的化合物数量非常庞大，但实际制药公司和有关研究机构现有的样品库却数量有限，这种情况在我国表现更为突出。,二、计算机虚拟筛选技术,利用现代计算机虚拟筛选技术可以有效克服上述困难，它利用计算机强大的运算能力，根据某个靶标的相关信息，利用三维药效团搜索或分子对接的方法，对商业化的化合物样品库进行虚拟筛选以寻找可能的活性化合物，发现潜在的活性分子后，可以向公司或有关机构定购，然后进
13、行药理测试。 与传统的高通量筛选技术相比，虚拟筛选不存在样品的限制，其成本也远低于高通量筛选 。,小分子三维数据库,剑桥结构数据库（Cambridge structural database，CSD）是由剑桥大学的剑桥晶体数据中心（Cambridge crystallographic data centre）提供的有关有机小分子晶体结构信息的三维结构数据库系统。 在CSD中，所有这些晶体结构都是通过X-射线或中子散射实验技术获得。目前，CSD包含超过25 700个有机化合物、金属有机化合物以及金属配合物的晶体结构信息，其中约有89%的分子有明确的三维结构数据。,剑桥结构数据库,国家癌症研究所数
14、据库,到2000年为止，国家癌症研究所数据库（national cancer institute database，NCI数据库）共收集了约500 000个化合物。尽管很多学术机构、政府部门及一些非营利组织提交测试的化合物没有任何限制条件，但是企业研究所通常要求对它们提供的化合物结构和测试结果遵守保密协议。NCI数据库中近一半的保密化合物公众无法获得。 NCI数据库最大的特点是拥有与之相配套的对公众开放的实物库。一般情况下，在NCI数据库中始终有约60%的化合物实物储备。,ACD-3D数据库,ACD-3D数据库是MDL数据库的一种，是用户检索化学品供应商和价格信息的一种有效途径。目前，ACD-
15、3D包含从世界范围内的651种化学品目录中收录的将近40万个化合物的信息，其中约33万个具有三维结构，是目前世界上最大的可获取的商业化学品结构数据库。数据库每半年更新一次。数据库中的信息包含化学品的纯度、类型、等级、剂量和可比价格等。,2003年MDL公司为了迎合高通量筛选而开发了数据库available chemicals directory 3D-screening（ACD-SC）。该库的数据主要来自于42个商业化学品供应商的产品目录。这一数据库提供了化学品供应商所能够提供的超过200万个化合物的三维结构及相关信息。ACD-SC可以说是ACD-3D的扩展，而且所有的化合物都可以找到相关购买
16、信息。,MDL drug data report 3D（MDDR-3D）,MDDR数据库是MDL数据库产品中的一种。它的数据来源包括1988年以来11个国际专利部门的资料以及1500种期刊和300种会议论文中出现的约100 000种与生物研究相关的化合物及其衍生物。该数据库每月更新一次，每年化合物增长规模在10 000种左右。数据库中收录信息的特点是包括生物活性和药理性质方面的数据。,虚拟筛选的策略,基于分子对接的虚拟筛选流程图,小分子数据库准备,蛋白质结构准备,二维分子数据库,蛋白质结构,原子键类归属 三维结构转化 结构优化,原子化电荷归属 结构转化,构象产生 数据归属,结合位点确定 网格构
17、造,分子对接,打分,评价选分子 类药性判断,侯选分子,虚拟筛选,后续分析,高通量筛选和虚拟筛选方法的比较,Doman等以2型糖尿病的靶点蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（PTP1B）抑制剂的发现为例，比较了高通量筛选和虚拟筛选方法。经过虚拟筛选后再进行生物学测试，其“命中率”比随机的高通量筛选提高了1700倍。,举例：雌激素受体调节剂,英国Protherics分子设计公司发展了虚拟筛选方法Dock Crunch，以雌激素受体三维结构为靶标，筛选了含有100多万个化合物的MDL/ACD-SC数据库。根据虚拟筛选结果，购买了37个化合物。药理测试显示，结合常数Ki小于100nmol/L的化合物有14个，有两
18、个化合物活性在nmol/L级别。,这些研究结果表明，与随机筛选相比，虚拟筛选可以成百上千倍地提高筛选效率。因此，用虚拟筛选方法进行创新药物研究无论是在提高新药研究与开发的效率，还是在获得新结构活性化合物的速度方面，均具有十分重要的意义。,三、反向分子对接,2001年反向分子对接（inverse docking）概 念的提出，无疑为药物靶点发现掀起了一场新的革命。 继INVDOCK软件后，TarFis-Dock、PharmMapper等免费在线服务器为人们所熟知并逐渐得到认可。其方便快捷的预测功能为药物靶点的发现提供了至关重要的作用，是药物研究与开发中不可或缺的重要工具。,反向分子对接是将一个生
19、物学活性已知的化合物与给定蛋白质数据库中的所有结合位点的三维结构进行对接，对于能够实现对接的蛋白质，再进一步通过实验方法来验证其作为该活性已知化合物作用靶点的可能性。 该技术能够高效、大规模进行靶点的确定和验证，预测与毒性相关的靶点。,根据配体-靶点之间的匹配程度，反向分子对接可分为药效团模型法（pharmacophore）、配体相似法（ligand similarity）和结合位点相似法（site similarity）等。,反向分子对接流程示意图,第三节 全新药物设计,全新药物设计也称为从头设计，它是根据靶点活性部位的形状和性质要求，通过计算机自动构建出结构与化学性质互补的新配体分子。 利
20、用全新药物设计的方法通常能够在分子设计中引入一些新的化学结构，从而帮助研究者突破原有的思想束缚，提出全新的先导结构；但一般所设计的化合物通常需要研究者通过化学合成得到，因此设计人员一般也应具有很好的有机化学和药物合成背景。,全新药物设计的分类,根据基本构建模块的产生方法不同，全新药物设计方法又进一步可细分为模板定位法、原子生长法、分子碎片法等，其中分子碎片法目前应用最为广泛。,模板定位法,模版定位法是指在靶点活性部位用模板构建出一个形状互补的图形骨架，然后再根据其他性质如静电、疏水和氢键性质，把图形骨架转化为一个个具体分子。,模板定位法设计配体示意图,原子生长法,原子生长法是指在靶点活性部位根
21、据静电、疏水和氢键相互作用，逐个添加原子，最终生长出与靶点活性部位性质、形状互补的分子。 原子生长法已发展成两种类型，第一种是从种子原子开始生长原子，该种子原子为靶点活性部位易形成氢键的原子，一般以氧、氮等作用起始原子起点；第二种类型是从起始结构开始生长原子，该起始结构可以是已知的底物或底物的一部分，它预先对接在靶点活性部位上。,分子碎片法,分子碎片法是指在靶点分子的活性部位，根据静电、疏水和氢键相互作用，以碎片为模板，逐步生长出性质与形状互补的分子。这里指的碎片，是由单一官能团，如羟基、羰基或苯环所构成。分子碎片法又分为碎片连接法与碎片生长法两种。,分子碎片法进行药物设计的几种连接方式：,应
22、用举例：FKBP-12配体的发现,Agouroo Pharrnaoeutioals公司利用LUDI进行了FKBP-12配体的设计工作，以FKBP-FKSO6复合物的晶体结构作为起点，把FKS06从复合物中删除，采用LUDI程序来寻找和FRBP的活性位点能形成匹配的分子片段。从LUDI计算所给出的多种可能的分子片段中发现a能够很好地填充部分活性口袋，并和受体形成好的几何匹配和能量匹配。进一步的研究表明，配体分子的亚甲基上引入酮基（化合物b）后能与Ile56的氨基形成氢键。,在此基础上，再一次利用LUDI对配体分子进行生长。发现通过一个桥原子在化合物b的侧链上连接芳香环有利于提高活性。经反复比较，
23、LUDI的计算结果显示在芳香环的间位连上一个酚羟基能够和靶点Asp37形成静电相互作用，有利于提高活性。研究人员合成了化合物c。生物活性测试结果表明，该化合物具有较好的活性，Ki16mol/L；而芳香环间位没有酚羟基取代的化合物d的Ki值仅为116mol/L。,第四节 基于片段的药物分子设计,一、基于片段的分子设计原理与方法,基于片段的药物设计（fragment-based drug design，FBDD）是一种将随机筛选和基于结构的药物设计有机结合的药物发现新方法。 基于片段的药物设计方法首先筛选得到低分子量和低亲和力的片段，然后基于药靶结构信息将片段进行优化或连接，得到与药靶亲和力高并且
24、类药性强的新分子。,基于片段的药物设计是为了克服传统高通量筛选的缺陷而逐步发展起来的药物发现新方法。 缺点：高通量筛选盲目性大，命中率很低，对于部分药物靶点很难筛选得到理想的化合物，而且命中化合物的类药性比较差。高通量得到的活性化合物的各个片段往往不能与靶蛋白的活性口袋很好地结合，而且对其中的单个片段的优化往往会影响整个分子，甚至是与靶点结合位置的改变。,高通量筛选和基于片段药物设计比较,一般来说，基于片段分子的设计研究可以分成三个阶段：片段筛选、片段与药靶复合物的结构确证和基于片段构建新分子。 1. 片段库的建立 一个高质量的片段库是进行基于片段药物设计的前提条件。构建片段库需要考虑三个因素
25、：库容量、化学结构多样性和类药性。,2. 结构信息的确定 确定片段与药靶结合的结构信息对指导片段转化为先导化合物过程起到至关重要的作用。 3. 基于片段构建新分子 基于片段分子设计的最终目标就是要发现高活性的先导化合物甚至是候选药物，这就需要利用药靶活性位点与片段相互作用的结构信息，在片段基础上进一步设计新的分子，以提高生物活性。,二、活性片段的检测技术,（一）磁共振技术,利用NMR进行药物筛选的基本原理在于配体与生物大分子结合后，许多NMR参数（如化学位移等）会发生改变，通过检测并分析这些数据，可以来判定配体是否与靶点结合、结合的强弱以及结合的模式。 NMR筛选片段的方法一般可分为两种：检测
26、配体的筛选（ligand detection based screening，LDBS）和检测靶点的筛选（target detection based screening，TDBS）。,1. 检测配体的筛选,LDBS法的原理是化合物在强磁场辐射下，核跃迁为激发态，然后缓慢回复到基态并释放出相应的能量，不同的核恢复到基态的时间不同，这个时间叫弛豫时间（relaxation time）。 弛豫时间的长短与分子大小成反比，小分子的化合物弛豫时间长，大分子的靶蛋白弛豫时间短，当药物与靶蛋白结合后就变成大分子，弛豫时间就会变短。,用LDBS法进行化合物活性筛选时，首先用普通条件测定小分子化合物的NMR谱
27、，然后向小分子化合物中加入靶蛋白，向磁共振仪引入一个适当的延时使靶蛋白分子不能被检测到，在这种条件下再检测一次。,如化合物未与靶蛋白结合，它的NMR谱仍可以被检测到；如化合物与靶蛋白结合，就会成为蛋白的一部分，其核的弛豫时间就会缩短而无法检测到它的NMR谱。根据加入靶蛋白前后NMR谱的差异可计算出化合物与靶蛋白的结合率。 这种筛选方法不仅可筛选纯化合物，而且还可筛选混合物，不管是天然提取的还是组合化学合成的多组分样品都可不经分离直接进行测定。,报告配体筛选方法（reporter ligand screening）可在一定程度上克服LDBS方法的缺陷。该方法的原理是在筛选样品中加入一个已知能与药
28、靶某一区域具有弱结合的分子，称为报告配体或探针。 筛选样品中的片段分子可竞争性地与报告配体结合药靶，亲和力高于报告配体的片段分子被检测出来。 这种方法筛选得到片段与报告配体结合到药靶相同的区域，避免检测到与药靶的非功能区域结合的片段，有效降低了假阳性，具有特异性高的特点。,2. 检测靶点的筛选,TDBS法的原理是当小分子与靶蛋白结合后，会改变蛋白质结合位点的局部化学环境，通过15N标记蛋白的二维N15和H1异核单量子相关谱（2D heteronuclear single quantum correlation spectra，HSQC），可以找出各酰胺信号15N或1H的化学位移变化。 采用TD
29、BS法的先决条件是必须知道靶蛋白的结构，要求靶蛋白需进行15N标记，这样才能保证靶蛋白NMR谱能准确识别每个酰胺结合位点的特征峰。,TDBS法不仅可用于校正高通量筛选的假阳性结果，确保测试化合物结合在准确的部位；还可指导新化合物的设计，即把相邻的几个结合于靶蛋白活性位点亚区域的低亲和性配体片段，通过优化组装连接，就可设计得到所期望的高亲和性配体。另外TDBS法还可用于功能未知的新靶蛋白的筛选。,TDBS法的优点是准确度高、特异性强，可获得靶蛋白结合位点的结构信息。但是，TDBS法在技术上还有很大的局限性，目前它仅适用于分子量小于40 000的靶蛋白，靶蛋白要进行N15标记，而且要能制备200m
30、g以上的量，因此其应用受到一定限制。,3. 磁共振构效关系研究法,SAR-by-NMR法由Fesik小组提出，是目前应用最广的NMR筛选方法。 首先，通过二维15N-HSQC谱中15N或1H的化学位移的变化来检测是否有小分子与靶蛋白结合。然后通过对作用于每个亚区域的片段进行优化和重新组装便得到所期望的高亲和性配体。,Shuker等采用SAR-by-NMR法发现了亲和力达nmol级的FK506蛋白抑制剂。,SAR-by-NMR发现FK506蛋白抑制剂,（二）质谱技术,质谱检测技术分为非共价结合方法和共价结合方法。电喷雾电离质谱是非共价结合检测的代表方法，Tether技术是共价结合检测的代表方法。
31、,1. 电喷雾电离质谱方法,（1）电喷雾电离质谱方法的原理 非共价结合方法指活性片段和靶蛋白之间靠氢键、范德华力、疏水作用等弱结合力形成片段-靶蛋白复合物，一般借助电喷雾电离质谱（electrospray ionization mass spectrometry，ESI-MS）进行分析和检测。,（2）电喷雾电离质谱方法的应用 细菌23S rRNA的U1061A功能域是一个抗菌靶点，Criffey等采用SAR-by-MS成功发现了高亲和力的配体。,SAR-by-MS方法发现细菌U1061A功能域配体,2. Tether方法,（1）Tether技术的原理 Tether技术的原理是靶蛋白的半胱氨酸残
32、基巯基与连有二硫键侧链的片段形成新的二硫键。Tether技术由Sunesis公司发明，它是借助质谱识别片段来指导药物设计。Tether技术不仅能检测片段和靶蛋白是否结合，而且能够检测是否结合在特定的位点。,一般来说，应用Tether方法筛选的含有二硫键片段由三个部分组成：片段母体、连接基团和离去基团（一般为2-巯基乙胺）。,Tether方法的原理,此外，通过二次Tether技术检测识别连接毗邻位点的活性片段，然后将连接两个片段的二硫键以合适的连接子替换，就能得到高活性的化合物。,二次Tether方法的原理,（2）Tether技术的优点与缺点,优点： 片段与药靶之间形成了稳定并且可逆的二硫键，通
33、过热力学平衡原理，用质谱快速检测得到与药靶具有较好契合的片段，降低了假阳性率。 片段与药靶形成二硫键后有利于开展分子模拟研究或者测定复合物的晶体结构，从而精确定位片段在药靶活性位点的位置，指导片段的优化或者连接。,缺点： 需要用定点突变的技术在药靶活性位点引入半胱氨酸残基，增加了实验难度。,（3）Tether技术的应用实例-淀粉样前体蛋白裂解酶-1抑制剂的发现,-淀粉样前体蛋白裂解酶-1（-amyloid precursor protein cleavage enzyme，BACE-1）是治疗老年痴呆症的重要靶点。,（4）二次Tether方法的原理及应用 二次Tether方法（tetherin
34、g with extenders）的原理是用一个已知的活性片段对靶蛋白进行共价修饰，然后将片段潜在的另一个巯基游离出来，用Tether方法去结合新的片段。,在起始阶段对靶蛋白共价结合的活性片段可以是由Tether方法筛选得到，也可以是通过其他手段发现的，一般具有中度的亲和力。 然后，将片段脱保护，游离出巯基，再次用前述的Tether方法筛选含有二硫键的片段库，通过形成新的二硫键来识别得到结合在药靶毗邻位点的第二个活性片段。 最后，将连接两个片段的二硫键以合适的连接子替换，就能得到了高活性的化合物。,利用二次Tether方法发现高活性的半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）抑制剂。,3. X-
35、射线单晶衍射技术,X-射线单晶衍射技术（X-ray crystallography）是研究分子结构最有效和最精确的方法。 早期的X-射线单晶衍射技术比较落后，测定蛋白质晶体结构耗时久、精确度低，不利于大量分子的筛选。 随着X-衍射实验技术、仪器自动化程度和计算机技术的高速发展，采用X-射线单晶衍射技术测定蛋白质或蛋白质-配体复合物的晶体结构正趋向成熟，目前已经有60 000余个蛋白质晶体结构被测定。,通过共结晶（co-crystallization）和结晶浸润（soaking）技术，靶蛋白可以快速识别并结合活性片段形成复合物，后者的三维结构可通过高通量X-射线衍射技术快速测定，这种方法称为结晶
36、筛选（crystallographic screening）。 这种方法不仅可以检测片段是否有结合，而且还能精确地检测出结合在靶蛋白的具体位置。,结晶筛选是一种比较理想的基于片段药物设计方法，它能够直接测定片段-靶蛋白复合物的三维结构信息，这不仅大大降低了非特异性结合和假阳性发生的概率，而且对后继的片段优化和连接提供了直接的指导信息。 结晶筛选的缺陷在于对技术和仪器要求很高，不仅需建立高通量蛋白质晶体结构测试平台，而且需要自动化程度较高的实验机器人。,（1）结晶筛选技术的原理 用于结晶筛选的片段库一般含有1000个左右分子。一般含有1000个分子的片段库，通常可以发现1050个活性片段，然后从
37、中选择45个片段进行优化。片段选择主要根据片段与靶蛋白的作用模式，并结合合成可行性。片段优化一般通过构建组合库，采用组合化学的方法进行平行合成。,结晶筛选过程一般分为四个阶段,结晶筛选的研究流程,（2）结晶筛选技术的应用脾脏酪氨酸激酶抑制剂的发现,结晶筛选技术发现新型脾脏酪氨酸激酶抑制剂,三、从活性片段到先导化合物的研究方法,上文介绍了各种活性片段检测技术，但是从新药发现角度而言，发现活性片段仅仅是研究的第一步，将活性片段转化变为先导化合物甚至是候选药物才是基于片段药物设计研究的最终目的。,从片段到先导化合物的设计方法主要分为以下三种：片段生长（fragment growth）法、片段连接（f
38、ragment linking）或片段融合（fragment fusion）法、片段自组装（fragment self-assembly）法。,（一）片段生长法,片段生长又称为片段演化（fragment evolution）或片段加工（fragment elaboration），其基本原理如下图所示。,片段生长原理,1. 过氧化物酶体增殖物激活受体激动剂,过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptor，PPAR）是治疗2型糖尿病的重要靶点，它有三种亚型：PPAR、PPAR和PPAR。Plexxikon公司的科研小组利用结晶筛选方
39、法筛选小分子片段库（分子量在150350之间），初步筛选得到170个活性片段。,2. 周期素依赖性蛋白激酶2抑制剂,周期素依赖性蛋白激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）是细胞周期的重要调控元件，也是癌症治疗的重要靶标。,3. 凝血因子a抑制剂,凝血因子a（factor a）是治疗凝血障碍的重要靶点。,（二）片段连接与融合,片段连接的原理如下图所示，片段a和b分别作用于靶蛋白的不同活性口袋，且两个活性口袋毗邻，将两个片段用合适的连接基团连接起来得到亲和力增强的新分子。,片段连接和融合原理,1. Bcl-XL抑制剂 肿瘤的发生与Bcl-2和Bcl-XL的过表达相关
40、。因此，研制Bcl-XL的高效抑制剂对癌症的治疗有重要的意义。,2. 基质金属蛋白酶抑制剂 基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是抗肿瘤药物的作用靶点。,3. 尿激酶（urokinase）抑制剂的抗肿瘤作用靶点,（三）片段自组装,片段自组装可以看作是一种自动的片段连接方法，如下图所示，在片段筛选过程中，分别结合在活性位点中相毗邻的结合口袋的两个活性片段a和b含有可相互反应的基团，这两个片段可自发地反应连接成为高活性的化合物。,片段自组装原理,片段的自组装一般通过两种新术实现：点击反应（click reaction）和动态组合化学（dynamic comb
41、inatorial chemistry，DCC）。,点击化学的基本思想是利用一些近乎“完美”的化学反应来实现特定构建模块的快速合成或组装。动态组合化学将组合化学与分子识别和自我装配有机结合起来，动态组合化学库中的片段之间能发生可逆的反应，它们处于一个动态平衡中。,1. 乙酰胆碱酯酶抑制剂 乙酰胆碱酯酶（AChE）是治疗老年痴呆的重要靶点之一。研究人员采用HPLC-MS技术筛选结合AChE的活性片段。,2. 神经氨酸酶抑制剂 神经氨酸酶（neuraminidase）是分布于流感病毒被膜上的一种糖蛋白，协助成熟流感病毒脱离宿主细胞感染新的细胞，在流感病毒的生活周期中扮演了重要的角色。,第五节 案例
42、分析：基于靶点结构的药物设计在HIV蛋白酶先导化合物发现的应用,一、研发背景,当前以HIV-1蛋白酶为靶点寻找蛋白酶抑制剂可归纳为3个研究方向： （1）根据HIV-1蛋白酶具有C2对称轴，设计能够阻止两个单体聚合或将已聚合的二聚体解聚的化合物。 （2）大部分抑制剂是根据HIV的gag和gag-pol基因产物中至少存在7个裂解键而设计的，用不易裂解的化学键替代肽底物中的酰胺键，以合成肽底物的类似物。,（3）通过大规模普筛及借助于晶体结构数据和计算机分子图形学的计算机辅助药物设计（CADD）寻找生物活性较强的小分子非肽类抑制剂，再进一步结构优化。这个研究方向已成为研制新型的抗艾滋病药物的一个新热点
43、。,二、先导化合物的发现,研究表明，每个HIV-1蛋白酶亚基由99个氨基酸残基组成，该酶抑制剂必须具有渗透细胞膜的能力。通过对HIV-1蛋白酶与天门冬氨酸蛋白酶的结构进行比较，并借助X-衍射波谱的结果，人们获得了高精确度（1. 8nm）的HIV-1蛋白酶的三维结构，并建立起该酶的结构模型。,随后，Kuntz等人于1990年根据其晶体结构中的酶活性部位，利用DOCK程序将剑桥晶体数据库中的10 000个分子与之进行分子对接虚拟筛选，并按照打分数值的高低排列。然后对打分值最高的200个化合物进行严格筛选，选择哪些带有羟基或氨基且易于合成的化合物，并评价这些分子能否与酶的Asp25发生相互作用。最后
44、发现其中一个化合物bromoperidol（11-60）具有较好的结合作用。,通过肽底物的酶活性检定法进行药理筛选，结果表明haloperidol（11-61）有抑制HIV-1蛋白酶的活性（Ki100mol/L，IC500. 25mmol/L，IC902. 0mmol/L）。另外，此化合物对HIV-1蛋白酶同属天冬氨酸蛋白酶的人血管紧张肽原酶（human renin）无抑制作用，对胃蛋白酶（pepsin）的抑制作用较弱，其选择性较高。,随后他们对此化合物进行结构修饰与改造，得到硫缩酮衍生物thioketal（11-62），此化合物对HIV-1蛋白酶的抑制活性为15mol/L，其活性得到进一步的提高。随后他们对化合物thioketal（11-62）与HIV-l蛋白酶复合物的晶体结构进行分析，发现其结合模式与分子对接得到的结果略有不同。,【思考题】,1. 什么叫基于靶点结构的药物分子设计？其研究内容有哪些？ 2. 同源模建法的基本步骤是什么？ 3. 什么叫计算机虚拟筛选？,Thank You!,