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1、-药物毒性试验指标1.急性毒性试验一、半数致死量（LD50）的测定 (一)目的:观察受试物一次给予动物后，所产生的毒性反应和死亡情况。 (二)动物分组和剂量 1.动物:一般用小白鼠8周龄，体重18-22g(同次试验体重相差不超过2g)大白鼠68周龄，体重120-150g，同次试验体重相差不超过10g。 2.受试物:溶于水的做成溶液，不溶于水的做成混悬液. (三)试验方法 1.剂量:一般选用3一5个剂量，各剂量间剂距根据受试物情况和预试结果而定。 2.给药途径和容积: 给药途径:应与临床试验的途径相一致。口服药物应灌胃给药，一、二类新药应采用两种途径给药，其中一种应为推荐临床研究的给药途径。水溶
2、性好的药物还应测定静脉给药的急性毒性。 给药容积:小白鼠禁食(1216小时)，不禁水，按体重计算:灌胃(ig)不超过0. 4ml/ 10g体重。大白鼠禁食(1216小时)，不禁水、灌胃(ig)，不超过3ml/只。 3.测定LD50:将动物按体重随机分组，每组至少10只(雌雄各半)。给受试物后立即观察动物反应情况，每天观察一次连续观察七天。详细逐天记录动物毒性反应情况及死亡分布，并用适当的统计学方法(申报时应说明方法名称)计算出LD50值及95%可信限。 4.观察毒性反应:给受试物后应严密观察反应情况，并记录动物的外观、行为活动、精神状态、食欲(饲料消耗量)、大、小便及其颜色、被毛、肤色、呼吸、
3、鼻、眼、口腔有无异常分泌物，体重变化以及死亡等情况。死亡动物应及时进行尸检，发现病变器官应做病理组织学检查。 若发现中毒反应或死亡率一与动物的性别有明显相关时，则应选择性别敏感的动物进行复试。 (四)试验报告和结果评价 应详细具体，包括试验日期、动物的规格、性别、数量、受试物来源及含量、试验方法。LD50值及其95%可信限，以及各剂量组的死亡率，或最大耐受量的值及其相当于临床剂量的倍数.详细报告实验过程中动物出现的中毒表现及致死症状，综合评价受试物毒性大小。二、最大耐受量（MTD）的测定 方法:受试物可用临床试验的给药途径，以动物能耐受的最大浓度，最大容积的剂量一次或一日内23次给予动物(小白
4、鼠至少20只，雌雄各半)。连续观察七天，记录动物反应情况，以不产生死亡的最大剂量为最大耐受量。计算出总给予药量g/Kg(合生药量g/Kg表示)，推算出相当于临床用药量的倍数。 测定最大耐受量，同样也应严密观察动物毒性反应情况，要求与观察单次给药的毒性反应相同。2.长期毒性试验一、大鼠的长期毒性试验 (一)目的:观察连续重复给予受试物对大鼠所产生的毒性反应，首先出现的症状和严重程度，毒副反应的靶器官及其恢复和发展情况。确定无毒反应剂量，为拟定人用安全剂量提供参考。 (二)动物和材料 1.动物健康大白鼠(参见总则要求)，每组至少20只。如试验周期为三个月以上，应根据需要增加数量至每组3040只。体
5、重差异应不超过平均体重的20%。试验期在三个月内用6 8周龄大鼠。超过三个月。宜用5 6周龄大鼠，雌雄各半、随机分组，每笼不超过5只，雌雄分笼饲养，试验前至少观察一周，记录食量和体重等。 (三)试验方法 1.剂量和分组 (1) 一般设三个剂量组和一个对照组。高剂量组原则上要求使动物产生明显的或严重的毒性反应，或个别动物死亡。中剂量组应相当于药效学试验的高剂量.低剂量组略高于动物的有效剂量而不出现毒性反应。(2) 如果急性毒性试验结果毒性很低，测不出LD50。也未见明显毒性反应，可设高、低两个剂量组，高剂量组一般为拟用于临床剂量50倍以上(有困难时，可适当减少剂量)并应高于药效学试验之高剂量。(
6、3)对照组的设置:如受试物为提取物(如浸膏)，对照物可考虑用常水;如含溶媒，对照物为溶媒;如含赋形剂，则对照物用赋形剂。如溶媒或赋形剂可能产生毒性时，则应另加一空白对服组(常水)。2.给药途径与方法 (1)给药途径与推荐临床的途径一致。口服药物应经口给药。临床用药途径为静脉注射时，可用其它适宜的注射途径代替。 (2)口服药大鼠一般用灌胃法，也可将受试物混在饲料、水中给予，但每只动物分笼饲养，采取适当措施，保证每只动物按规定剂量在一定时限内服入。(3)受试物最好是每周7天连续给予，如试验周期在90天以上，可考虑每周给药6天，每天定时给药。(4)给药容量一般为1 2ml/l100g体重，每周可根据
7、体重情况调整给药量，但总量不宜超过5ml /鼠/次。各剂量组用等容量不等浓度给药。3.试验周期(1)长毒试验的给药时间应为临床试验用药期的二 三倍，最长半年。(2)若临床用药周期在1周以内者，长毒试验应为2周;2周以内者，应为四周;四周以上者，长期毒性试验的给药期一般为临床试验用药期的两倍以上。(四)检查项目 1.一般观察:进食量、体重、外观体征和行为活动、粪便性状等，发现有中毒反应的动物应取出单笼饲养，重点观察。发现死亡或濒死动物应及时尸检。 2.检测项目; (1)血液学指标:红细胞或网织红细胞计数、血红蛋白、白细胞计数、白细胞分类、血小板计数、凝血时间。 (2)血液生化学指标:天门冬氨酸氨
8、基转换酶(AST)、丙氨酸氨基转换酶(ALT),碱性磷酸酶(ALP)、尿素氮(BUN),总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、血澹(GLU )、总胆红素(T-BIL)、肌醉(Grea)、总胆固醇(T-CHO)。 (3)系统尸解和病理组织学检查: 系统尸解:应全面细致，发现异常器官应重点进行病理组织学检查。 脏器称重和胜器系数;剖解后取出心、肝、肾、脾、肺、肾上腺、甲状腺、攀丸、卵巢、子宫、脑、前列腺。 病理组织学检查:高剂量组对照组动物及尸检发现异常器官检查要详细。其他剂量组可取材保存。在高剂量组发现有异常病变时才进行检查。检查内容 除一类其他各类新药:心、肝、肾、脾、肺、肾上腺、甲状腺、胃、胸腺
9、、肇丸(和附肇)Y前列腺、卵巢和子宫和可能的靶器官。 3. 可逆性观察 最后一次给药后24小时，每组活杀部分动物(2/3 1/2)，检测各项指标，余下动物停药，继续观察2 4周。如24小时后的病理学检查发现有异常变化，应将余下动物活杀剖检，重点观察毒性反应器官，以了解毒性反应的可逆程度和可能出现的迟缓性毒性。 4. 指标观察时间 一般状况和症状的观察，每天观察一次。每周记录饲料消耗和体重一次。试验周期在三个月以内的，一般在最后一次给药后24小时和恢复期结束时各进行一次各项指标的全面检测.必要时，在试验中间检测指标一次。试验周期在三个月以上的，可在试验中期活杀少量动物(高剂量组和对照组)全面检测
10、各项指标。对濒死或死亡动物应及时检查。二、犬的长期毒性试验 目的:观察连续重复给予受试物对犬所产生的毒性反应，首先出现的症状和严重程度，提供毒副反应的靶器官及其恢复和发展情况，确定无毒反应剂量，为拟定人用安全剂量提供参考。3.皮肤用药毒性试验目的:观察动物完整皮肤及破损皮肤短时期接触受试物所产生的毒性反应。4.粘膜用药的毒性试验目的:观察动物跟睛接触受试物后所产生的刺激反应情况和恢复情况。5.特殊毒性试验根据新药审批办法及有关中药部分的修订和补充规定冷各类型中药新药在特殊毒性实验方面应做项目如下: 1.一类新药必须进行特殊毒理研究。 2.保胎药与影响胎儿子代发育的药物，除按一般毒理学要求进行实
11、验外，还应增做生殖毒性试验。 3.其它类新药如在实验中发现有影响生殖或致癌的可疑性时，应补做相应的特殊毒性试验。 一、致突变试验 中药一类新药，除按药理、毒理学要求进行试验外，还需做基因突变试验，染色体畸变试验及动物微核试验。由于中药制剂有其特殊性，如含有生药粉的制剂，不溶物较多;或因成分复杂，溶解度较差，以及pH等间题的研究，难以进行体外试验者，可只做体内试验。(一)基因突变实验 基因突变试验的目的是反映受试物在基因水平上的致突变作用。主要方法有三种:其中微生物回复突变试验适合于化学纯度高的药物，较为常用;中药粗制品不宜做微生物回复突变试验，哺乳动物培养细胞突变试验适用于受试物本身具有抗微生
12、物作用的药品;果蝇伴性隐性致死试验是整体动物的基因突变试验，准确性较高，在上述二法有某些阳性或可疑阳性时较为适用。 果蝇伴性隐性致死试验 1.果蝇:Oregon一R雄蝇等和Muller一5雌蝇。 2.给药途径:口服或其他接近临床用药的途径。 3.剂量:至少二个剂量。最高剂量为最大耐受剂量或产生某些毒性指征的剂量，通常以1 /2LD50为基准，低剂量为1 /4LD50，无毒物最大给药量可用最大耐受量。对照驭用溶剂及阳性对照。 4.试验: (1)毒性试验:求出半数致死量。 (2)繁殖力试验观察受孕与不育情况。如有不育，可调低剂量。 (3)样本的大小:受试染色体总数实验和阴性对照组6000以上，阳性
13、对照组300以上，观察给药的雄果蝇和处女蝇交配，每2一3天更新处女蝇，记录雌性子代的致死作用。 5.报告 将数据列成表，包括受试染色体数，给药的和无生育力的雄性数，F2代培养群的数目，每一生殖细胞期检测的带有致死基因的染色体数。 6.判定: (1)一支培养管中，F:代合计有2(i只以上雌、雄蝇而末发现有野生型红眼雄蝇者为阳性:反之，有2只以上雄蝇者为阴性。 (2)在一支培养管中，F:代雌、雄蝇合计少于a只，或只有一只红眼雄蝇者为可疑，需观察F3代。 (3)仅存雌、雄蝇亲本而无仔蝇者为不育。7，统计处理及评价:致死突变率% = 致死管数 / 受试染色体数100% (1)致死突变率大于自发突变率的
14、2倍并有剂量反应关系时记为阳性。 (2)或将给药组与对照组的致死突变率进行比较，如对照组与给药组的突变总数小于1,按astenbaum -Bowman方法统计，总数大于iaa按z统计。(二)染色体畸变试验 染色体畸变试验的目的是反映受试物在染色体水平上的致突变作用，其中培养细胞染色体畸变试验是体外实验，对受试物的纯度及理化性质要求较高，而精原细胞染色体畸变试验及啮齿动物显性致死实验均为体内实验，前者需用小鼠数较少，实验周性较短，后者虽然工作量较大，但同时可获得受孕率，死胎数，含死胎孕鼠百分率等较多信息. 啮齿类动物显性致死试验: 1甲动物;性成熟小鼠。每组至少15只雄鼠，孕鼠20只以上。 2.
15、剂量:一般采用3个剂量。受试物的最高剂量应导致毒性症状或减少繁殖力，低毒物最大剂量可用最大耐受量对照用溶剂及阳性对照。 3.给药途径与方法尽可能和临床拟用途径相同。一般采用一天一次，连续五天给药或其它适宜的给药方式。 4.交配方法: 3.骨髓采样时间:通过预试，在12-72h不同时间内，取5个作用点，找出合适采样时间，如无差别一般采用24h采样。 4.剂量及剂量级:至少采用3个剂量，最高剂量以1/2LD50或最大耐受量为基准，否则应说明选定剂量的理由。对照组:用溶媒及阳性对照。 5.标本制作:取骨髓、涂片、Giernsa或叮吮橙荧光染色镜检:每只动物至少计数100个多染红细胞，Giemsa染色，观察其微核出现的频度及多染红细胞和正常红细胞的比率。吖啶橙荧光染色，则直接观察微核出现的频度。 6.判定:(1)受试物所诱发的微核率的增加与剂量相关;(2)某一测试点微核增加呈现可重复的并有统计学意义的增加;符合上述一条即可判为阳性。 注:1.对Giemsa染色中获得可疑阳性或弱阳性结果的药物，必须用芡光染色以进一步肯定或否定阳性结果。 2，不易通过骨翻屏障的药物，可补充用哺乳动物胎肝细胞微核试验进一步研究。3.如遇阳性或可疑阳性时，可选择DDS试验或SOS显色试验进行试验。参考中药新药研究指南、中药新药药理毒理研究技术要求和中药、天然药物长期毒性研究技术指导原则-第 6 页-