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1、第八章 杂交与芯片技术,学习目标,掌握：1核酸分子杂交的基本概念。 2探针的种类与标记方法。 3常见核酸分子杂交技术的原理。 4DNA芯片的设计与制备。 熟悉：1核酸分子杂交信号的检测方法。 了解：1核酸杂交与DNA芯片技术的应用。,第一节 杂交的基本概念,杂交,杂交（hybridization）是指不同来源的单链核酸，根据碱基互补配对原则，在适当的条件下形成杂化双链的过程。 利用核酸杂交检测目的核酸的方法称为核酸分子杂交技术. 核酸杂交是定性或定量检测靶DNA或RNA的方法,探针,探针是指带有标记的单链核酸。 探针能与靶核酸序列互补，可在适当条件下，通过碱基互补配对的方式与靶核酸序列杂交，再
2、根据标记信号判断靶核酸序列的位置和含量。,一、核酸分子杂交,核酸杂交是基于核酸变性和复性的特性建立的。 不同种类的单链DNA分子或RNA分子，只要两条单链之间存在一定程度的碱基互补配对，就有可能形成杂化双链（heteroduplex）。,核酸分子杂交,我们把不同来源的单链核酸形成双链的过程称为核酸分子杂交。 可以是DNA和DNA单链之间杂交，也可以是RNA和RNA单链间的杂交，甚至可以是DNA单链和RNA单链之间杂交。,核酸分子杂交,二、探针的类型,探针可分为基因组DNA探针、cDNA探针、RNA探针、寡核苷酸探针四大类。,1寡核苷酸探针,优点是：制备方便，可根据需要自行设计，避免了天然核酸探
3、针存在的高度重复序列；由于寡核苷酸探针长度只有1530bp，其中即使有一个碱基不配对也会显著影响其熔解温度。因此它特别适用于基因点突变杂交分析；,寡核苷酸探针,比活度高，适用于大多数杂交。如DNA序列测定、Southern杂交、Northern杂交、原位杂交等。 缺点是探针短，特异性差，杂交体稳定性差，杂交及漂洗的温度、盐浓度等条件要求高，操作难度大，背景噪音也大。,2基因组DNA探针,基因组DNA经机械剪切或限制性内切酶消化制备成一定大小的DNA片段，再将这些片段插入到适当的载体中，转化宿主细胞，构建成基因组DNA文库。 从文库中筛选出含有目的基因的阳性克隆，经扩增、提取DNA、酶切及电泳分
4、离，即可得到足量的基因片段，经适当的标记后，即为基因组DNA探针。,基因组DNA探针,也可采用PCR方法扩增基因组DNA片段，制备基因组DNA探针。 选择此类探针时要特别注意基因组中存在的高度重复序列，尽可能使用基因的编码序列（外显子）作为探针，避免使用内含子及其它非编码顺序。,基因组DNA探针,因为高度重复序列的存在，可能引起非特异性杂交而出现假阳性。 优点：制备方法简单，不易降解，标记方法成熟。,3cDNA探针,由mRNA逆转录而来，在逆转录酶的作用下，以mRNA 为模板，合成cDNA第一链，进而合成第二链。将合成的cDNA插入到适当的载体中，构建cDNA文库。 然后筛选适当的阳性克隆，再
5、进一步扩增、酶切及纯化该cDNA片段，标记即可。,cDNA探针,也可采用PCR方法扩增。 该方法的优点：双链探针，长度较长，可与靶序列形成的杂交体稳定性、特异性比寡核苷酸探针高，杂交信号强。 缺点是由于是双链，必须先变性再杂交，在杂交过程中还存在自我复性现象。,4RNA探针,分离的RNA或者利用噬菌体依赖于DNA的RNA聚合酶以双链DNA为模板在体外转录而成。 优点：RNA/RNA比RNA/DNA杂交体系稳定性高。单链，不存在变性和自我复性。RNA中不存在高度重复序列，非特异性杂交少。杂交后可用RNase将未杂交的游离探针消化掉，从而使本底降低。 缺点：RNA容易降解，标记方法也相对复杂。,三
6、、探针的标记,理想的探针标记物应具备以下特性：高度的灵敏性；不影响 碱基配对的特异性；不影响探针分子的主要理化性质；对酶促反应活性无影响；检测方法具有高度灵敏性和高度特异性。,探针的标记,核酸探针常用的标记物主要有两大类。 一是放射性标记物：如放射性同位素3H、32P、35S、125I等。以32P应用最普遍。 优点：灵敏度高，可检测到10-18g的物质；有很高的特异性，假阳性结果较少。 缺点：易造成放射性污染；有同位素半衰期限制。,探针的标记,二是非放射性标记物：如地高辛素、辣根过氧化酶、碱性磷酸酶等。 优点：是无环境污染、可较长时间贮存。 缺点：是灵敏度不高。,探针标记,探针标记可以全程标记
7、，亦可对探针的3端或5端进行标记。 探针的体外标记法分为化学法和酶法 化学法：利用标记物分子上的活性基因与探针分子上的基因（如磷酸基因）发生的化学反应，将标记物直接结合到探针分子上。,探针标记,酶法标记：预先将放射性同位素或非放射性标记物连接于NTP或dNTP上，然后利用酶促反应将标记的核苷酸分子掺人到探针分子中去，或将核苷酸分子上的标记基因交换到探针分子上。,1缺口平移法 缺口平移法（nick translation，NT）,是目前实验室最常用的一种脱氧核糖核酸探针标记法。 利用大肠杆菌DNA聚合酶I 的多种酶促活性将标记的dNTPs掺入新合成DNA链中使探针被标记。,缺口平移法 缺口平移法
8、（nick translation，NT）,带缺口的双链DNA均可作为切口平移法的模板。 首先利用DNase I在DNA双链上造成单链切口。 然后利用DNA聚合酶I的53核酸外切酶活性在切口处将旧链从5末端逐步切除， 最后，在DNA聚合酶I的53聚合酶催化下，以dNTP为底物，在切口的3末端-OH上合成新的DNA链，同时将标记的核苷酸掺入到新的DNA链中。,缺口平移法,2随机引物标记法（random priming，RP）,随机引物能与各种单链DNA模板结合，作为合成新链的引物，在DNA聚合酶的催化下，按53方向合成一新的DNA链，其核苷酸序列与模板DNA完全互补。另一单链DNA模板同样合成一
9、条新的完全互补的DNA链。合成时，带放射性同位素标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中。,随机引物标记法,随机引物法的优点：能进行双链DNA、单链DNA或RNA探针的标记；操作简单方便，避免因DNaseI处理浓度掌握不当所带来的一系列问题；标记活性高；可直接在低熔点琼脂糖溶液中进行标记。 缺点：探针产量比缺口平移法低。,随机引物标记法,3末端标记法,将核酸片段的5末端和3末端进行部分标记。故分为3末端标记和5末端标记。 3末端标记：在探针3-末端用末端转移酶掺入一个单标记的-32PdNTP,3末端标记法,包括限制酶切和聚合酶合成两个过程。 有两种标记方式：大肠杆菌DNA聚合酶I的 Klenow
10、片段末端标记法和T4 DNA聚合酶标记法。,3末端标记法,5末端标记法,先用碱性磷酸酶（AP）去掉dsDNA 5-磷酸，在T4多核苷酸激酶的催化下，使 ATP分子上的-磷酸基团转移到DNA或RNA分子的5OH基团上。 采用-32P-ATP为底物，即可将DNA样品5端标记。但核酸样品5端必需是去磷酸的。,5末端标记法,4PCR标记法,在PCR反应体系中，利用标记的核苷酸作为反应底物，以待标记的DNA片段为模板，PCR扩增。 PCR扩增结束后标记的核苷酸掺入到新合成的DNA分子中，制备成特异的探针分子。 使用前必须进行探针变性处理。该方法获得的探针分子产量高。,四、杂交信号的检测,1放射性核素标记
11、探针检测,放射性核素标记的探针杂交后常用放射自显影进行检测，该方法基于放射性核素释放的能量将照片纸感化的原理。 32P标记杂交最常用的检测方法是放射自显影。该方法的基本原理是同位素在不断衰变过程中释放出-粒子，粒子撞击X光片感光层，形成潜在影像，经过显影即可成像。,2非放射性核素标记探针检测,非放射性核素标记的探针杂交后可选用比色或化学发光法检测。 基本原理通过偶联反应和显色反应两步来实现。,非放射性核素标记探针检测,首先，可以通过抗原-抗体免疫反应系统与显色体系偶联。如：地高辛标记探针杂交信号可通过酶联免疫法与抗地高辛抗体和碱性磷酸酶的复合物结合。 然后，再进行酶促显色反应。,非放射性核素标
12、记探针检测,显色反应有三类： 酶促显色法。最常用的酶是碱性磷酸酶（AKP）和辣根过氧化物酶(HRP)， 荧光法。荧光素标记的探针杂交后可通过荧光显微镜观察或者免疫组织化学法检测； 化学发光法。在化学反应中释放的能量以光的形式发射出来，某些底物在被碱性磷酸酶水解时会发光从而形成检测信号。,酶促显色法原理,第二节 常见的核酸分子杂交技术,核酸分子杂交分类,核酸分子杂交反应环境分为： 液相杂交在溶液内进行。 固相杂交在固相支持物上进行。 如硝酸纤维素、尼龙膜。,核酸分子杂交分类,固相杂交根据诊断目的或杂交方式又分为：Southern杂交、Northern杂交、斑点杂交、原位杂交、等位基因特异性寡核苷
13、酸杂交、菌落杂交、反向点杂交等。,核酸分子杂交分类,印迹杂交是指将凝胶中分离的生物大分子转移或者直接放在固定化介质上，然后与液相中核酸分子探针进行杂交，并加以监测分析的过程。,一、原位杂交（In situ hybridization，ISH）,是用已标记的核酸探针与组织切片或细胞中的待测核酸进行特异性杂交，然后应用组织化学或免疫组织化学法在显微镜下进行细胞内定位、定性和定量分析的方法。 探针的最常用的标记是荧光素（如异硫氰酸荧光素）。标记的探针杂交后可使用荧光扫描共聚焦显微镜直接观察。,原位杂交,基本原理是根据被检测靶DNA的序列设计其互补的探针，经过变性后的单链靶DNA可以与已标记的探针分子
14、在低温下复性，形成靶DNA与探针的杂交体。,原位杂交,原位杂交在反应过程中保持细胞形态，甚至是单个染色体的形态完整。 通常被用于正常或异常染色体的基因定位、组织或细胞内基因表达位点的确定、转录水平的分析以及病毒或病原体感染的检测等。,原位杂交,二、斑点杂交（dot blot）,斑点杂交是将变性后的DNA或RNA待测样品直接点样于硝酸纤维素薄膜或其他固相载体上，然后加入过量的标记核酸探针进行杂交。 斑点杂交技术可用于基因组中特定基因及其表达产物的定性和定量分析。,斑点杂交,斑点杂交的优点是在同一张膜上可以同时进行多个样品的检测，样品用量少，方法简便、快速、灵敏。 缺点是不能鉴定靶核酸分子的大小、
15、特异性低。,三、Southern杂交（Southern blot）,是将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上，通过与标记的探针进行杂交，对目的DNA进行检测分析的过程。,Southern杂交,四、Northern杂交（Northern blot）,是一种将RNA分子从电泳凝胶中转移到一定的固相支持物上，通过与标记的探针进行杂交，然后对RNA加以检测分析的方法。 Northern杂交的基本过程与Southern杂交相似，只是转移的核酸分子是RNA。,Northern杂交,因为RNA分子较小，转移前无需限制性内切酶消化。 电泳分离之前需要甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，有利于与硝酸
16、纤维素薄膜结合。,Northern杂交,目前主要应用于检测某一组织或细胞中已知的特异mRNA的表达水平，也可以比较不同组织细胞中同一基因的表达情况。 Northern杂交检测mRNA的表达水平灵敏度较PCR差，但其特异性高，假阳性率低，,Southern杂交与Northern杂交比较,五、等位基因特异性寡核苷酸探针杂交（allele specific oligonucleotide，ASO）,根据已知基因突变位点的核苷酸序列，人工合成两种寡核苷酸探针：一种是相应于突变基因序列设计的寡核苷酸探针（M），一种是相应于正常基因碱基序列设计的寡核苷酸探针（N）。 用两种探针分别与受检者DNA样品进行分
17、子杂交。,等位基因特异性寡核苷酸探针杂交,可能会出现以下4种情况： 受检者DNA能与M杂交，而不能与N杂交，说明受检者是这种基因突变的纯合子；受检者DNA既能与M杂交，又能与N杂交，说明受检者是这种基因突变的杂合子；受检者DNA不能与M杂交，但能与N杂交，说明受检者无该种基因突变；受检者DNA与M、N均不杂交，提示患者缺陷基因可能是一种新型的基因突变。,第三节,DNA芯片技术,DNA芯片概念,DNA芯片又称基因芯片（gene chip）、DNA阵列。 DNA芯片是指将许多特定的DNA探针有规律的紧密排列固定于单位面积的固相支持物上，形成高密度的DNA微阵列。,DNA芯片概念,DNA芯片与待测的
18、荧光标记样品进行特异性地杂交，再通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一探针上的荧光信号作出比较分析，从而迅速得出对目的基因的定性和定量分析结果。,DNA芯片分类,根据片基分为：无机片基芯片（如半导体硅片和玻璃片）和有机合成物片基芯片（如硝酸纤维素薄膜和尼龙膜）。 根据应用分为：表达谱芯片、诊断芯片、检测芯片等。 根据结构分为：寡核苷酸芯片、cDNA芯片和基因组芯片等。,二、DNA芯片的设计与制备,设计原则：保证DNA探针的特异性和准确性。 设计内容：包括DNA探针的特异性设计与芯片DNA的点阵定位。,DNA芯片的设计与制备,DNA探针的特异性可通过基因文库或DNA的测
19、序结果获得。 双链DNA芯片的DNA探针常用PCR扩增产物。 PCR产物序列的准确性可通过设计特异引物、保证引物Tm值一致、扩增片段大小的一致性等实现。,DNA芯片的设计与制备,芯片DNA的点阵定位：通常设计双重或三重重复点阵，还需设计阴性和阳性对照用于校正。 重复点阵可保证结果地可靠性；阴性对照为不含DNA的空点，作为芯片的背景控制；阳性对照为定量加入的相应标记DNA，获取的信号用作外标准，用于衡量或校正同一芯片上各不同区域的杂交差异。,DNA芯片的设计与制备,根据芯片的应用探针序列设计需要具有针对性。 表达型芯片探针的设计，需设计出针对基因中的特定区域的多套寡核苷酸探针或cDNA探针，序列
20、主要来源于已知基因的cDNA序列。,DNA芯片的设计与制备,单核苷酸多态性检测芯片的探针设计，一般采用长移位设计法，按靶序列从头到尾取1625bp的与靶序列完全互补的寡核苷酸形成探针组合。 再设计一组相对应的与靶序列不完全互补的寡核苷酸探针，分别与样品和对照进行杂交，比较杂交信号。,DNA芯片的设计与制备,特定突变位点探针的设计：测定的突变点应该出现在设计探针的中心，以便得到突变位置及发生变化的检测。,DNA芯片的设计与制备,芯片探针载体的选择也是影响芯片技术的关键。常用的固相载体材料主要有玻片、硅片、硝酸纤维素薄膜、尼龙膜、聚丙烯膜等。 材料在使用前必须进行活化，以增加载体与探针的结合能力。
21、活化的主要方式是在载体表面涂布多聚赖氨酸或包被氨基硅烷耦联试剂。,常用DNA芯片制备方法,主要有直接点样法和原位合成法。 直接点样法：是指将预先合成好的寡核苷酸、cDNA或基因组DNA通过高速点样机直接点在芯片上，理化方法使之固定。,常用DNA芯片制备方法, 原位合成法：指利用4种核苷酸直接在芯片载体上合成所需要的DNA探针。 适用于制备寡核苷酸芯片和制备大规模DNA探针芯片。 原位合成的方法主要包括：光导原位合成法、原位喷印合成法和分子印章合成法。,原位合成芯片,三、DNA芯片应用的基本操作,（一）样品制备,（二）杂交反应,（三）信号检测及结果分析,（一）样品制备,DNA芯片检测样品的制备包括核酸的纯化、扩增与标记。 DNA样品提取物常含有杂质，需要进行纯化。纯化后的DNA样品作为PCR扩增的模板进行PCR扩增，然后对PCR扩增得到的大量产物进行标记。,三、DNA芯片应用的基本操作,（一）样品制备,（二）杂交反应,（三）信号检测及结果分析,四、DNA芯片技术的应用,应用领域： 生命科学的研究。如基因表达分析、基因型、基因突变和基因多态性分析、基因组比较等。 临床疾病的诊断。如遗传性疾病、感染性疾病和肿瘤等诊断。 药物的研发。如药物筛选等。,