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1、-枯草芽孢杆菌实际应用与发展前景的研究摘要 随着国家对农业的支持，微生物化肥有农业中的应用也越来越受到重视。而枯草芽孢杆菌在农业方面和其它方面都有广泛的应用，因此，研究枯草芽孢杆菌的实际应用是非常必要的。本文从工业酶生产、生物防治领域、微生物添加剂领域和医药卫生领域等方面对枯草芽孢杆菌的实际应用进行研究。关键词 枯草芽孢杆菌 实际应用 发展前景Bacillus subtilis application and development prospect of Abstract along with the country the support to agriculture, microbial
2、 fertilizer has application in agriculture has been paid more and more attention. And Bacillus subtilis in agriculture and other aspects of a wide range of applications, therefore, research of Bacillus subtilis and practical application is very necessary.This article from the industrial enzyme produ
3、ction, biological control field, microbial additives and medical and health fields on Bacillus subtilis applied research. Key words Bacillus subtilis; application; development prospects1.1 枯草芽孢杆菌简介枯草芽孢杆菌，是芽孢杆菌属的一种。单个细胞 0.70.823微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.60.91.01.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌
4、落表面粗糙不透明，污白色或微黄色。枯草芽孢杆菌菌体生长过程中产生的枯草菌素、多粘菌素、制霉菌素、短杆菌肽等活性物质，这些物质对致病菌或内源性感染的条件致病菌有明显的抑制作用。枯草芽孢杆菌迅速消耗环境中的游离氧，造成肠道低氧，促进有益厌氧菌生长，并产生乳酸等有机酸类，降低肠道pH值，间接抑制其它致病菌生长。枯草芽孢杆菌菌体自身合成-淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶等酶类，在消化道中与动物体内的消化酶类一同发挥作用，能合成维生素B1、B2、B6、烟酸等多种B族维生素，提高动物体内干扰素和巨噬细胞的活性，在饲料中应用广泛。它还可以用来改善水质，应用在污水处理和环境保护中。和其它微生物混合使用，还可以
5、用于生物肥料和土地改良等。枯草芽孢杆菌的应用枯草芽孢杆菌在工业酶生产中的应用5工业酶的生产是工业微生物发酵的重要组成部分。据来自BBC的统计数字，2004年全球酶的交易额达到20.0亿美元(15.3亿欧元)，其中食品酶占29，饲料酶占15，一般的工业酶占56。枯草芽孢杆菌是当今工业酶生产应用最广泛的菌种之一，据不完全统计，枯草芽孢杆菌所产的酶占整个酶市场的50。由于其产酶量高、种类多、安全性好和环保等优点，在现代工业生产中被广泛用作生产菌种，其发酵生产的酶已在食品、饲料、洗涤、纺织、皮革、造纸和医药等领域均发挥着十分重要的作用。枯草芽孢杆菌生境多样，可利用的营养物质种类十分丰富，这决定了其自身
6、含有丰富的产酶系统，具备生产多种酶的应用潜力。研究资料表明，枯草芽孢杆菌能够产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶、葡聚糖酶、植酸酶、果胶酶和木聚糖酶等十几种酶。在过去的10年，利用基因工程技术，枯草芽孢杆菌几乎可以在短期内大量生产任何种源的新酶，从而省略了大量的原始菌种改造、驯化、毒理学实验等工作；利用蛋白质工程技术，能够在生产新酶之前对该酶的性质进行改良和调整，从而改善酶的活性或者赋予酶新的所需性质。这些新技术的应用使新酶种的开发周期大大缩短，难度和成本降低，产品更加稳定有效。枯草芽孢杆菌生产的蛋白酶、淀粉酶是工业酶中应用最为广泛的酶，仅二者就占到了整个工业酶市场的50。其中，淀粉酶的生产和应用处于
7、整个酶制剂的首位，其最早是在20世纪初，由德国的Boiden和Effront先后从枯草芽孢杆菌培养液中分离出的；蛋白酶主要用于制革、丝绸工业及制造加酶洗涤剂等方面。目前，枯草芽孢杆菌酶市场营业额的90以上掌握在加多家工业酶企业手中，仅Nonozymes和Danisco两家公司就占到了60以上。我国酶制剂工业近年来取得了长足的发展，但仍无法跟上世界同行业发展的步伐，科研乏力已成为制约中国酶工业发展的瓶颈因素。枯草芽孢杆菌酶的主要应用领域是食品工业，全世界食品工业用酶约占总量的60，而我国则高达85以上。这些酶在动物蛋白水解行业中的骨素加工、植物蛋白水解中的大豆蛋白和大豆肽生产、乳制品和婴儿食品生
8、产等工业过程中都已得到广泛的应用，如在面包生产中-淀粉酶、蛋白酶能有效提高面团工艺性能和面包质量(体积、内部结构、风味等)，并延长面包保鲜期；在啤酒生产中，采用淀粉酶的新型辅料液化工艺以及复合酶制剂的应用对提高我国啤酒的产量和质量有重要意义；在玉米深加工领域，采用耐高温淀粉酶和糖化酶的“淀粉喷射液化”技术以及“双酶法”糖化技术全面带动了我国淀粉糖、味精和柠檬酸等生产工艺的改革；蛋白酶还可用于鱼虾等海产品下脚料的加工，用于生产调味剂添加于食品中，不但提高了食品营养价值，增进经济效益，而且还变废为宝，降低了环境污染。近年来，蛋白酶、果胶酶和纤维素酶等在果酒、果汁、调味品、烘焙、肉制品和中药有效成分
9、提取以及多肽保健品生产中的应用也都取得了较大的进展。1.2.2 枯草芽孢杆菌在生物防治领域中的应用枯草芽孢杆菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用。美国迄今已有4株枯草芽孢杆菌生防菌株获得环保局商品化或有限商品化生产应用许可，如美国AgraQuest公司用枯草芽孢杆菌QST713菌株开发出活菌制剂杀菌剂SerenadeTM。并于2000年通过美国环保局(EPA)的登记，用于防治多种作物的白粉病、霜露病、疫病、灰霉病等病害。枯草芽孢杆菌MBI600在英国的MicroBio Group Ltd.、日本的Idemistu Kosan Co.，Ltd.等均已获得注册登记，并进行产业化生产，用于
10、防治叶部病害(灰霉病、白粉病)和根部病害(枯萎病、根腐病、黑斑病等)。枯草芽孢杆菌FZB24在德国、美国等国家进行了注册，并在德国Bayer公司投入生产，用于防治番茄晚疫病、灰霉病和小麦白粉病，还可作为增产促进剂。澳大利亚开发的B.subtilis A-B对麦类和胡萝卜立枯病等具有很好的防治和增产作用。此外，LRCavaglieri等从玉米根围分离获得的生防菌株B.subtilis RC8、RC9和RC11对玉米轮状镰刀菌(Fusarium verticillioides)具有强烈的抑制作用。我国利用枯草芽孢杆菌防治植物病害的应用研究也达到了世界先进水平，现已成功开发并投入生产的商品制剂有亚宝
11、、百抗、麦丰宁、纹曲宁等产品。其中，江苏省农业科学院植保所选育的枯草芽孢杆菌B-916对水稻白叶枯病菌有良好防效。南京农业大学开发的生防菌B3(麦丰宁)对小麦纹枯病田间防效达5080。云南农业大学和中国农业大学共同研制的微生物农药“百抗”已在农业部登记注册，并在多个省推广使用，其有效成分是枯草芽孢杆菌B-908，大田应用中对水稻纹枯病防效达70以上。另外，由陈延熙等研制的增产菌已在全国10多个省、市的50余种作广使用，主要用于防治水稻稻瘟病、小麦纹枯病和油菜菌核病等，田间增产率达1050，“增产菌”成为我国第一个生物制剂方面的专利，达到国际领先水平。1.2.3 枯草芽孢杆菌在微生物添加剂领域中
12、的应用枯草芽孢杆菌是我国允许使用的饲料微生物菌种，因其无毒、无害，经常被制成微生物添加剂，用于改善动物肠道功能、促进动物生长和预防疾病。枯草芽孢杆菌在制剂中以内生孢子形式存在，孢子进入动物肠道后，在肠道上部能迅速复活并分泌高活性的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解植物性饲料中复杂的碳水化合物，产生具有拮抗肠道致病菌的多肽类物质等，起到抑菌和预防作用。另外，枯草芽孢杆菌是好氧菌，可通过消耗肠道内的氧气造成厌氧环境，促进肠道内优势菌厌氧菌的繁殖，维持肠道生态平衡。如，研究发现猪采食含107CFUg枯草芽孢杆菌制剂的饲粮3周后，粪中双歧杆菌数量显著上升，而链球菌和梭菌的数量则显著下降，且这种趋势仔猪
13、较母猪更明显；猪饲料中添加枯草芽孢杆菌不仅可以提高饲料转化率和氮利用率，而且可以减少氨的产生。此外，枯草芽孢杆菌具有耐高温、耐酸碱和耐挤压等特性，在饲料加工中保存良好，有利于推广应用。1996年，枯草芽孢杆菌作为我国农业部正式批准的6种生物兽药之一已投入工厂化生产。1.2.4 枯草芽孢杆菌在医药卫生领域的应用5研究证明，枯草芽孢杆菌的活菌制剂可以作为口服液用于治疗肠炎、支气管炎和腹泻等多种疾病，也用来预防和治疗烧伤面的感染。最近，科学家发现从枯草芽孢杆菌提取到的淀粉酶、纤维素酶能够补充体内消化酶的不足，恢复正常消化机能；蛋白酶能够分解发炎部位纤维蛋白的凝结物，消除伤口周围的坏疽、腐肉和碎屑。日
14、本人日常生活中食用的纳豆就是利用枯草芽孢杆菌生产的，研究表明，纳豆中含有的溶栓酶(纳豆激酶)对心血管疾病有很好的预防和治疗作用；而同样由枯草芽孢杆菌合成的聚谷氨酸可用作药物缓释材料和医用高分子纤维材料等。1.2.5 枯草芽孢杆菌在水产养殖领域中的应用5枯草芽孢杆菌在水产养殖中的应用起步较晚，由于它能分泌蛋白酶等多种酶类和抗生素，使池底积累的大量残余饵料、排泄废物、动植物残体以及有害气体(氨、硫化氢等)，使之先分解为小分子(多肽、高级脂肪酸等)，后分解为更小分子的有机物(氨基酸、低级脂肪酸、单糖、环烃等)，最终分解为二氧化碳、硝酸盐和硫酸盐等，有效降低了水中的COD、BOD，使水体中的氨基氮(N
15、H3-N)、亚硝基氮(NO2-N)和硫化物浓度降低，从而有效地改善水质，同时还能为以单细胞藻类为主的浮游植物提供营养物质，促进繁殖。这些浮游植物的光合作用，又为池内底栖水产动物的呼吸、有机物的分解提供氧气，从而使养殖水体形成一个良性的生态循环；另外，它们分泌的多种酶类和抗生素可以抑制其他细菌的生长，进而减少甚至消灭水产养殖动物的病原体。河北奇骥生物技术有限公司生产的复合芽孢菌剂可适应低温水环境产酶丰富分解力强，在水产养殖中对降解有机废物改善水环境可发挥重要作用。1.2.6 枯草芽孢杆菌是微生物学与分子生物学研究的良好试验材料枯草芽孢杆菌作为基因工程受体菌，可表达出近200种原核和真核生物来源的
16、蛋白基因，并且无论是在生产上还是对基因组及物理图谱的研究上都处于中心位置，对它的研究涉及各个方面。目前国际上在遗传工程中使用的芽孢宿主菌几乎全部来自Spizien及其学生建立的枯草芽孢杆菌169菌株转化系统，它同另一种常用大肠杆菌表达系统相比有着独特的优势，即可以将转入目的基因表达出的产物分泌到细胞体外，这就降低了进一步收集、分离和纯化基因表达产物的成本和工作量。枯草芽孢杆菌能够在生长过程中产生有用代谢产物，且大部分直接分泌到培养基中，这在简化生产工艺的同时，也存在菌株自身分泌的降解性蛋白酶会影响表达产物的稳定性甚至会破坏表达产物的缺点。近年来有人构建的双蛋白酶和三蛋白酶缺陷的枯草芽孢杆菌DB
17、104和DB403菌株将有助于提高目的基因表达蛋白的稳定性。这些都为枯草芽孢杆菌的广泛应用奠定了基础。1.2.7 枯草芽孢杆菌在环境保护方面的应用78尹文林等不同养殖水体用20亿g枯草芽孢杆菌B115株0.5 mgL后，对养殖水体的溶氧和pH无明显的影响；氨氮最大降解值出现在使用后的第34天，平均降低(45.405.06)；亚硝酸盐氮的最大降解值出现在使用后第3天，平均降低率为(16.033.82)；硫化物的最大降解值出现在使用后第3.4天，平均降低率为(23.017.27)。与对照组相比有明显差异(P 0.1)，对总大肠茵群也有明显的抑制作用。胡咏梅等以5种模拟的污染水样对枯草芽孢杆菌FY9
18、9-01菌株的净水作用进行了研究。结果表明，该菌株能迅速降解有机物，在不同处理条件下水样的COD值都有明显的下降，48 h COD的去除率达67%以上，96 h厌氧条件下反硝化强度为50.2%，好氧条件下为28.6%，144h总残渣、过滤性残渣的降解率分别为61.3%和24.1%，96h降解硫化物达100%。此外，枯草芽孢杆菌在降解多环芳烃和乐果方面也有较好的应用前景。尽管当前化学杀菌剂在农药产业仍占主导地位。但枯草芽孢杆菌杀菌剂具有对人畜相对安全、环境兼容性好、不易产生抗药性等优点，因而更符合现代社会对农业生产及有害生物综合防治(IPM)的要求。枯草芽孢杆菌抗菌物质的分离纯化及抗菌作用的分子机制、拮抗基因的克隆及其表达调控等研究已经积累了丰富的资料，具有重要的理论意义和指导生产价值。现代生物技术的广泛应用、基因组学和蛋白组学的发展以及先进的仪器设备的应用必将为枯草芽孢杆菌植物病害生防研究开发带来新的发展机遇。-第 5 页-