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1、-微生物复习提纲-第 7 页应用微生物技术复习提纲1、 微生物学的发展史，重要人物所做的突出贡献史前时期：中国古代农民用谷物酿酒（8000年前至1676）初阶阶段：荷兰人列文虎克，准确地描述了微生物的形态。奠基时期：巴斯德：微生物学的奠基人。他把微生物学的研究从形态描述推进到生理学研究水平，并开创了寻找病原微生物的兴盛时期，使微生物学开始以独立的学科形成。贡献：(1)曲颈瓶实验彻底否定了“自然发生”学说；（2）证实了发酵是由微生物引起的。（3）将病原菌减毒，使其转变为疫苗。（狂犬疫苗）科赫：（1）发明了固体培养基制备方法，并建立通过了固体培养分离纯化微生物的技术；（2）用自创的方法分离了许多病
2、原菌，如炭疽芽孢杆菌、结核分枝杆菌等；（3）提出了“科赫法则”；（4）创立了许多显微镜技术，如细菌鞭毛染色法、悬滴培养法等。发展阶段：布赫纳：用酵母菌无细胞压榨汁将葡萄糖进行酒精发酵获得成功，发现了微生物酶的重要作用，从此将微生物学推进到了生化研究的阶段。此后，微生物生理、生化等研究得到了迅速的发展弗莱明：发现点青霉能抑制葡萄球菌的生长，揭示了微生物间的拮抗关系，并发现了青霉素。2、 细菌的形态、细胞结构功能和繁殖方式、生长曲线细菌的形态与结构功能：细菌是具有细胞壁的一类单细胞原核微生物，形体微小，结构简单。无成形细胞核，无核膜和核仁，除蛋白体外无其他细胞器，在适宜的条件下有相对稳定的形态与结
3、构，分布广，种类多，与人关系密切。细菌的形态：,通常以微米(Micrometer,um;1um=1/1000mm)作为测量它们大小的单位 按其外形主要有三类 1.球菌：呈圆球形或近似圆球形，有的呈矛头状或肾状。单个球菌的直径约在左右。又称化脓性球菌（ 1双球菌，2链球菌 3.四联球菌和八叠球菌4.葡萄球菌）肺炎双球菌，溶血性链球菌， 藤黄八叠菌，金黄色葡萄球菌2杆菌：各种杆菌的大小，长短，弯度，粗细差异较大。大多数杆菌中等大小，长（2-5微米，宽微米）。多数呈直杆状，大的杆菌如炭疽杆菌(35um1.01.3um),小的如野兔热杆菌 (0.30.7um0.2um)。介于球菌和杆菌之间的，称为球杆
4、菌。两端多呈钝圆形，少数两端平齐（炭疽杆菌），两端尖细（梭杆菌） 末端膨大呈棒状（白喉杆菌）排列一般分散存在，无一定排列形式， 偶有成对或链状，（枯草芽孢杆菌），呈链状，个别呈特殊的排列呈八字状或栅栏状，（白喉杆菌）。 1.弧菌(Vibrio)菌体只有一个弯 曲呈弧状或逗点状。如霍乱弧菌偏端生鞭毛3螺旋菌：菌体弯曲，可分为： 2.螺菌(Spirillum)菌体有数个弯 曲。如鼠咬热螺菌。 细菌形态可受各种理化因素的影响，一般说来，在生长条件适宜时培养818小时的细菌形态较为细菌形态较为典型型;幼龄细菌形体较长;细菌衰老时或在陈旧培养物中，或环境中有不适合于细菌生长的物质(如药物、抗生素、抗体、
5、过高的盐分等)时，细菌常常出现不规则的形态，表现为多形性(Pleomorphism),或呈梨形、气球状、丝状等，称为衰退型(Involutionform),不易识别。观察细菌形态和大小特征时，应注意来自机体或环境中各种因素所导致的细菌形态变化细菌的结构：细菌的结构对细菌的生存，致病性和免疫性等均有一定作用。分为基本结构和特殊结构，各种细菌共有的结构称为基本结构，包括细胞壁，细胞膜，细胞质和核质，将某些细菌在一定条件下所持有的结构称为特殊结构，包括鞭毛，芽孢，菌毛和荚膜。基本结构：1细胞壁，细胞壁为细菌表面比较复杂的结构，是一层厚度平均为15-30纳米，质量均匀的网状结构，可承受细胞内强大的渗透
6、压而不被破坏。细胞壁紧贴细胞膜外，坚韧而有弹性。（主要成分是肽聚糖又称黏肽，由肽聚糖单体聚合而成的网状大分子，单体由（N-乙酰葡萄糖胺（G）和N-乙酰胞壁酸（M）两种氨基糖经-1，4糖苷键连接形成的多糖骨架，在N-乙酰胞壁酸分子上连接四肽侧链，肽链之间再由肽桥或者肽链联系起来，组成一个机械性很强的网状结构。各种细菌细胞壁的肽聚糖的支架均相同，四肽侧链的组成及其连接方式随菌种而异）细胞壁的功能：细菌细胞壁坚韧而富有弹性，保护细菌能承受胞内巨大渗透压，而不被破坏，与细胞膜共同参与细胞内外物质的交换，细胞壁可允许水分及直径小于1纳米的可溶性小分子自由通过，革兰氏阳性菌：肽聚糖（基本结构），包括聚糖骨
7、架，四肽侧链，五肽交联桥 磷壁酸（特殊成份），包括膜磷壁酸，壁磷壁酸 表面蛋白（特殊成分），包括SPA,M蛋白 三维立体结构，磷壁酸，抗原性强，是革兰氏阳性的重要表面抗原，调节离子通过黏肽层中起到作用，革兰氏阴性菌:肽聚糖（基本结构），包括聚糖骨架，四肽侧链 外膜（特殊成分），二维平面结构。 外膜层位于细胞壁外侧，由脂蛋白，脂质双层，脂多糖三部分组成。细胞膜：又称细胞质膜，位于细胞壁内侧，紧包在细胞质外的具有弹性的半渗透性生物膜，主要由磷脂和蛋白质组成。在电子显微镜下观察，显双层结构。磷脂分子由一个带正电荷且能溶于水的极性头（磷酸端）和一个不带电荷，不溶于水的非极性尾（烃端）构成。极性头朝向膜
8、的内外两个表面，呈亲水性，非极性端则埋藏在膜的内层，形成磷脂双分子层，其中含有各种功能的蛋白质。功能：具有选择性通透作用，与细胞壁共同完成菌体内外物质的交换；膜上有多种呼吸酶，参与细胞的呼吸过程，膜上有多种合成酶，参与生物合成过程细胞质：又称原生质，为无色透明黏稠的胶状物，基本成分是水，糖，蛋白质，脂类，核酸，少量无机盐，是细胞的内环境，内含丰富的酶系统，是细胞合成和分解代谢的主要场所。细胞质中还有多种重要的结构质粒：是染色体外的遗传物质，游离于细胞质中，闭环双链DNA分子，分子量小于染色体（脱氧氢核酸），携带某些特殊的遗传信息，编码。如细菌的耐药性，产抗生素，性菌毛等一些次要性状，能进行独立
9、复制，非细菌生存所必需，失去质粒的细菌能正常存活。核糖体：又称核蛋白体细菌的繁殖方式：生长曲线：曲线形成的条件是少数细菌接种到固定容积的液体培养基中培养接种一段时间后，菌数迅速增长（如图BC段），此时种群数量变化与_J_型曲线相似，原因是营养充足，培养条件适宜。（3）若此细菌最初的数目是n，每20min繁殖一代，调整期后2h，发酵罐中的菌数为_64n_；（4）AD段与种群数量变化的_S_型曲线相似，请解释曲线C点E点的成因： 随着营养物质的消耗，有害代谢产物的积累，pH的变化等，细菌的分裂速度下降，死亡细胞的数目增加，整个培养基中新增加的细胞数目和死亡的细胞数目达到动态平衡（5）CD段表示此细
10、菌群体的生长进入_稳定_期，该期是积累_次级代谢_产物的关键时期。（6）种内斗争最激烈的阶段是_CD_。3放线菌的形态、繁殖方式4酵母菌的形态和繁殖方式5病毒的结构和繁殖方式6显微镜的使用及维护方法7革兰氏染色的基本原理方法和注意事项原理G菌:细胞壁厚，肽聚糖网状分子形成一种透性屏障，当乙醇脱色时，肽聚糖脱水而孔隙缩小，故保留结晶紫-碘复合物在细胞膜上。呈紫色。G菌:肽聚糖层薄，交联松散，乙醇脱色不能使其结构收缩，其脂含量高,乙醇将脂溶解，缝隙加大，结晶紫-碘复合物溶出细胞壁，番红染液复染后呈红注意事项：1. 要用活跃生长期的幼培养物作革兰氏染色；涂片不宜过厚，以免脱色不完全造成假阳性。2.
11、革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染成阴性菌。3. 染色过程中勿使染色液干涸，用水冲洗后，应吸去玻片上的水渍，以免染色液被稀释影响染色效果。8药典中有关微生物限度检验的相关内容，如细菌总数、霉菌酵母菌数、大肠菌群数等指标检验时所用培养基种类和培养时间温度,结果报告方式附录微 生 物 限 度 检 查 法微生物限度检査法系检査非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检査项目包括细菌数、霉菌数、酵母菌数及控制菌检查。 微生物限度检查应在环境洁净度1 0 0 0 0级下的局部洁净度1 0 0级的单向流空气区域内进行
12、。检验全过程必须严格遵守无菌操作，防止再污染，防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出。单向流空气区域、工作台面及环境应定期按医药工业洁净室（区）悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方法的现行国家标准进行洁净度验证。供试品检查时，如果使用了表面活性剂、中和剂或灭活剂，应证明其有效性及对微生物无毒性，除另有规定外， 本检査法中细菌及控制菌培养温度为30 -35C; 霉菌，酵母菌培养温度为23-28C。检验结果以l g l m l 1 0 g 1 0 m l或1 0 c m 2为单位报告，特殊品种可以最小包装单位报告。所用培养基的种类和培养时间，温度，结果报告方式验 证 方 法 验 证 试 验 至 少
13、 应 进 行 3 次独立的平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。另有规定外， 细菌培养3 天， 霉菌、酵母菌培养5天，逐日观察菌落生长情况，点计菌落数.必要时，可适当延长培养时间至7 天进行菌落计数并报告。菌落蔓延生长成片的平板不宜计数。点计菌落数后，计算各稀释级供试液的平均菌落数，按菌数报告规则报告菌数。若同稀释级两个平板的菌落平均数不小于1 5 , 则两个平板的菌落数不能相差1 倍或以上。一般营养琼脂培养基用于细菌计数；玫瑰红钠琼脂培养基用于霉菌及酵母菌计数；酵母浸出粉胨葡萄糖琼脂培养基用于酵母菌计数。在特殊情况下， 若营养琼脂培养基上长有霉菌和酵母菌、玫瑰红钠琼脂培养基上长有细菌
14、，则应分别点计霉菌和酵母菌、细菌菌落数。然后将营养琼脂培养基上的霉菌和酵母菌数或玫瑰红钠琼脂培养基上的细菌数，与玫瑰红钠琼脂培养基中的霉菌和酵母菌数或营养琼脂培养基中的细菌数进行比较，以菌落数高的培养基中的菌数为计数结果菌数报告规则细菌、酵母菌宜选取平均菌落数小于300cfu、霉菌宜选取平均菌落数小于lOOcfu的稀释级，作为菌数报告（取两位有效数字）的依据。以最高的平均菌落数乘以稀释倍数的值报告l g l m l或10cm供试品中所含的菌数。如各稀释级的平板均无菌落生长，或仅最低稀释级的平板有菌落生长，但平均菌落数小于1时，以 1乘以最低稀释倍数的值报告菌数。9药典中关于大肠菌群的检验方法验
15、证大肠菌群检査法时，采用大肠埃希菌作为验证菌株验证方法：取规定量供试液及1 0 -1 0 0 c f u 试验菌加入增菌培养基中，依相应控制菌检査法进行检查。当采用薄膜过滤法时，取规定量供试液，过滤，冲洗，试验菌应加在最后一次冲洗液中，过滤后，注人增菌培养基或取出滤膜接人增菌培养基中。(2)大肠菌群（Coliform) 取含适量（不少于1 0 m l )的乳糖胆盐发酵培养基管3支，分别加入1 ： 1 0 的供试液l m l ( 含供试品0 . l g 或0 . l m l ) a ： 1 0 0 的供试液l m l ( 含供试品0. O l g 或0 . 0 1 m l ) 、l ： 1 0
16、0 0 的供试液l m K 含供试品0 . OOlg或0 . 0 0 1 m l ) , 另取1 支乳糖胆盐 发酵培养基管加人稀释液l m l 作为阴性对照管。培养1 8 -2 4 时 。乳糖胆盐发酵管若无菌生长或有菌生长但不产酸产气，判该管未检出大肠菌群；若产酸产气，应将发酵管中的培养物分别划线接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基或麦康凯琼脂培养基的平板上，培养1 8 -2 4 时。若平板上无菌落生长， 或生长的菌落与表4 所列的菌落形态特征不符或为非革兰阴性无芽抱杆菌，判该管未检出大肠菌群； 若平板上生长的菌落与表4 所列的菌落形态特征相符或疑似，且为革兰阴性无芽孢杆菌，应进行确证试验。确证试验从上
17、述分离平板上挑选4 -5个疑似菌落 分别接种于乳糖发酵管中，培养24 -48 时。若产酸产气,判该乳糖胆盐发酵管检出大肠菌群，否则判未检出大肠菌群。根据大肠菌群的检出管数， 按表5 报告l g 或l m l 供试品中的大肠菌群数。注：+代表检出大肠菌群；一代表未检出大肠菌群。10无菌操作方法11微生物、生长因子、鉴别培养基、转化转导、碳源氮源、免疫应答等词汇的概念微生物：是指自然界中个体微小，结构简单，肉眼不可见或看不清楚，必须借助显微镜才能观察到的一类微小生物。生长因子：是细菌在其生长过程中必需的，需要量少但自身不能合成的一类有机物质。鉴别培养基：利用细菌生化反应能力不同，在基础培养基内加入
18、特殊的底物和指示剂，以达到鉴别细菌的目的。转化：指将质粒或其他外源DNA导入处于感受态的宿主细胞，并使其获得新的表型的过程转导：由噬菌体和细胞病毒介导的遗传信息转移过程也称转导。碳源：在微生物生长过程中能为微生物提供碳素来源的物质。氮源：在微生物生长过程中能为微生物提供氮素来源的物质免疫应答：抗原性物质进入机体后激发免疫细胞活化，分化和效应过程称之为免疫应答。12微生物消毒灭菌的方法有哪些干热灭菌：小的玻璃或者金属器皿等用具不适于用其他方法灭菌又耐高温的物品可用干热灭菌法。电热鼓风干燥箱。160-170.恒温1-2h。温度不宜过高，防止包装纸烧焦或自然。湿热灭菌：高压蒸汽灭菌法.培养基，玻璃器
19、皿，无菌水，金属用具和无菌室的实验服。 121.15-20分钟，高压蒸汽灭菌器。巴氏消毒法。它适用于不能进行高温灭菌的液体，低温持续63.30分钟和高温快速法85.5分钟，135-150摄氏度2-6秒间歇灭菌法，适用于不耐热的培养基，又称分段灭菌法，100下30-60分钟.室温或者20-30培养过夜，第二天再用同样的方法处理，重复3次，加热后应迅速降温，防止未杀杂菌大量滋生。辐射消毒，紫外线照射消毒。对人体有损伤作用，避免在紫外灯下工作。过滤除菌，适用于对空气不宜加热的液体除菌，滤菌器，采用抽滤式和注射式。化学方法：杀菌剂，抑菌剂表面消毒。13微生物营养吸收的方式单纯扩散：1.物质在扩散过程中
20、没有发生任何反应。2根据菌体内外溶质的浓度差，不能逆浓度运输，不消耗能量。3.运输速率与膜内外物质的浓度成正比4.运送物质主要是氧，水分，甘油等营养物质。促进扩散：1.参与运输的物质本身的分子结构，不发生变化。2.不消耗能量，不能进行逆浓度运输，3运输速率与膜内外物质的浓度差呈正比。4需要特异性载体蛋白协助物质转运。主动运输：1.物质本身分子结构不发生改变。2物质运输过程中需要消耗能量。3需要特异性载体蛋白参与转运，4可进行逆浓度运输。，运输物质有氨基酸等基团转位：1物质在运输过程中会发生分子结构上的变化.2.物质运输过程中需要消耗能量.3需要特异性载体蛋白参与转运，4.可进行逆浓度运输，水是
21、唯一可以自由通过原核的物质，运输物质主要有糖类.14生产环境和工作人员手部菌落总数检验的方法和计算手：每只手表面细菌菌落总数（cfu/m）=平板上平均菌落总数*稀释倍数/2*30（面积）空气中细菌总数（cfu/m）=50000*平板上平均细菌菌落数/平板面积*暴露时间。15微生物检验过程中，哪些操作不当会影响检验结果？1. 操作仪器，培养基，无菌水试管等，灭菌过程不完全遭受污染。2. 对工作环境，检验人员的手部表面没有达到消毒卫生指标。3. 在操作工程中，要靠近点燃的酒精灯操作，不能用手触碰到各个检验用具的开口处，移液管不能触碰到有刻度的地方，防止污染。4. 整个操作实验应在规定时间内完成，不宜过长.