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1、针刺对痛经大鼠中枢及外周含量的影响 中枢端和外周端 关键词 针刺疗法 原发性痛经 缝隙连接蛋白43 内啡肽 RNA干扰技术 大鼠 RNA干扰（RNAi）技术作为一种新的反义基因工具,较以往的重组反义DNA,反义寡聚脱氧核糖核苷酸的效率更高,细胞内少许siRNA分子就能发挥显著基因下调作用1。前期探讨工作表明2-3，缝隙连接蛋白43（Cx43）与经络亲密相关，那么缄默穴位局部Cx43的表达，对经络信号的传导有无影响，是本课题探讨的重点。痛经是青春期妇女的常见病之一,发病率为42%90%。针刺是治疗原发性痛经的有效方法，但对其镇痛机制尚缺乏有力的试验依据。为接着深化探讨Cx43与穴位经络针刺效应的
2、关系，及针刺的镇痛机制，本试验利用RNAi技术缄默穴位局部Cx43的表达，以催产素所致大鼠子宫猛烈收缩为模型，视察针刺对痛经大鼠下丘脑、垂体、卵巢及外周血-EP水平的影响。 1 材料与方法 11 试验动物:选用健康、雌性、未孕SD大鼠50只，体重180210g，由同济医学院试验动物中心供应。保持动物在室温、昼夜节律条件下，自由饮水、进食。 12 试验药物及试剂:己烯雌酚（合肥久联制药公司）。缩宫素注射液（上海禾丰制药公司）。无内毒素养粒抽提试剂盒由天根生化科技有限公司。-EP放射免疫分析试剂盒由中国人民解放军其次军医高校供应。Trizol RNA抽提试剂（美国Gibcobr），M-MLV逆转录
3、酶及反应缓冲液、dNTPs、Oligo dT、RNasin酶抑制剂（美国Promega），PCR Marker（美国Ferment）。Cx43 mRNA及-actin引物由上海生工生物技术公司合成，兔抗鼠Cx43抗体，加拿大Chemicon产品。-actin单克隆抗体，武汉晶美公司。 13 试验方法:质粒构建、提取与纯化:干扰质粒pSilencer-Connexin43-shRNA，阴性比照质粒pSilencer-Control-shRNA由本试验构建，含有U6启动子、G418抗性、kana抗性及多克隆位点等。依据siRNA设计的有关原则4-5，针对大鼠Cx43mRNA序列，确定siRNA作用
4、靶序列（AACAGTCTGCCTTTCGCTGTA），344-364，及一个无关序列（GACTTCATAAGGCGCATGC）。用鉴定正确的质粒转化感受态细菌DH5，挑取单克隆菌落进行小量扩增，提取质粒酶切鉴定正确后，再行大量扩增（质粒抽提试剂盒），灭菌PBS（PH80）溶解后冻存于-20备用。动物分组及干预方法:将动物按体重分层，然后按完全随机分为正常组（N）、痛经模型组（M）、针刺组（A）、针刺+干扰组（A+I）、针刺+干扰比照组（A+IC），共5组，每组10只。其中A+I、A+IC均在造模的第5、7、9、11天于针刺穴位处,分别局部高压注射干扰质粒和阴性比照质粒，20mg/每穴，其余处理
5、与A组相同。造模方法:M、A、A+I、A+IC，均用己烯雌酚(1%的羟甲基纤维素钠配成悬混液)灌胃，每日3mg/kg，连续12d，再于末次给药1h后，腹腔注射缩宫素14U/kg。正常组用生理盐水灌胃，容积02ml/10g，连续12d。干预方法:A、A+I、A+IC以自制布袋固定，于造模第5天针刺三阴交、地机、关元(根椐华兴邦等研制的大鼠穴位图谱及比较解剖学原理取穴)，每次留针30min，每隔5min捻转30s，每日1次，连续7天。 14 视察项目与检测方法:扭体反应发生率视察:各组在末次给药1h后，腹腔注射缩宫素14U/kg，诱发扭体反应为子宫收缩(痛经)的指标，视察并记录30min内每只大鼠
6、扭体次数，及扭体潜藏期。穴位处Cx43mRNA及蛋白的检测:取穴位处的皮肤肌肉组织采纳Trizol一步法抽提总RNA，在核酸分析仪上检测RNA的浓度和纯度。根据逆转录试剂盒供应的试验步骤进行逆转录反应。取3lcDNA依次加入10buffer、2M dNTP、10M Primer 2l，Taq酶1U，补水至总体积25l，分别进入PCR循环。循环条件：94预变性5min，94变性50s，55退火30s,72延长1min。共35个循环，循环终末728min终止反应。取PCR产物8l，用15%琼脂糖凝胶进行DNA电泳，电泳条带结果采纳自动凝胶图像分析仪分析，计算目的产物与-actin的光汲取度积分比值
7、。以积分值作为Cx43表达的半定量指标。取穴位处皮肤肌肉组织用组织裂解液裂解并匀浆，然后在415000r/min,离心30min，取上清液用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度后，取各组样品50g蛋白质，以12%的SDS-PAGE胶分别蛋白。然后采纳湿转法（300mA，05h）将蛋白质转移至PVDF膜上。再用含7%脱脂奶粉的TBST（含01% Tween20）室温下封闭2h后加入一抗（1500），4过夜，洗膜后加辣根过氧化物酶标记的二抗（13000）,室温轻摇2h，充分洗涤后用ECL显影，洗片后用激光扫描仪测各条带光密度。下丘脑、垂体、卵巢及外周血-EP含量测定:末次赐予缩宫素1h后，常规水合氯醛（300
8、mg/kg,腹腔注射）麻醉后，腹主动脉采血1ml,快速注入含有抑肽酶、10%EDTANa2（含07NaCl）的塑料指形管中混匀,马上低温离心(3000r/min)15min,取血浆,置-70低温冰箱待测。各组均分别取出下丘脑、垂体、卵巢,置于100生理盐水中煮沸5min后,快速冷却后,置于微型匀浆器中,加入适量1NHCl放置100min后，1ml酸化,加入1N NaOH 1ml,摇匀后离心20min,3000r/min,再静置10min后取出上清液,置于-20保存,待用放免法测定-EP含量。 2 结果 21 动物扭体潜藏期及扭体次数的视察:腹腔注射催产素1h后，即可视察到雌性大鼠出现扭体反应，
9、A和A+IC均能削减催产素诱发的痛经大鼠扭体反应数，延长扭体潜藏期，见表1。结果表明，M组扭体次数较多,未经造模的N组无扭体,经统计学处理两组间差异有特别显著性意义(P005)。 22 穴位处Cx43 mRNA及蛋白表达：A+I组穴位处Cx43mRNA及蛋白表达水平均低于N组，且差异有显著性意义（P005）,见图1和表2。其中RT-PCR显示Plasmid-Cx43-shRNA干扰Cx43效率为4219%,Western Blot干扰效率为5689%，说明局部高压注射Cx43特异性shRNA真核表达载体有效地缄默了Cx43的表达。 23 针刺对各组下丘脑、垂体、卵巢及血浆-EP含量的影响:见表
10、3。结果显示，与N组比较，M组大鼠的下丘脑、垂体、卵巢及血浆中-EP含量降低（P005）。-EP含量以垂体最高。 3 探讨 大鼠皮肤中存在Cx26、Cx31、Cx37、Cx43等缝隙连接蛋白，其中以Cx43、Cx26表达最多6。本课题前期探讨工作也表明2-3，经络线上的Cx43的表达高于接近比照线，缝隙连接蛋白及缝隙连接与经络高度相关，由缝隙连接介导的细胞间通讯可能在经络活动中起重要作用。因此，理论上下调Cx43水平可能变更Cx43信号传导通路而影响针刺效应。本试验RT-PCR及Western Blot结果显示P-Cx43-shRNA有效地缄默了穴位处Cx43 mRNA及蛋白的表达。本试验结果
11、表明,N组和M组痛经大鼠的扭体次数有明显差异，说明造模是胜利的；A组与M组痛经大鼠的扭体潜藏期和扭体数相比，差异有显著性，说明针刺能明显延长缩宫素所致痛经大鼠的扭体潜藏期，削减30min内扭体次数；针刺能缓解痛经大鼠子宫肌的猛烈收缩,抑制子宫肌痉挛,而达到镇痛的作用。A+I组与A组的大鼠扭体潜藏期和扭体数相比有明显差异，而A+IC组与A组无明显差异，提示Cx43参加了针刺效应的产生，这对于下一步经络实质的探讨奠定了基础。 近年来，很多学者发觉-EP与女性生殖内分泌有明显的关系，它具有内源性镇痛作用，也有外周调整作用。子宫是-EP的靶器官，-EP参加子宫功能活动的调整，痛经大鼠血浆-EP水平降低
12、可能是难受发生的缘由之一7。通过提高-EP水平而达到缓解难受,可能是针刺镇痛机制之一。其作用途径有以下两种可能:一是中枢性镇痛作用,大脑中-EP主要来自下丘脑弓状核正中隆起部和脑垂体,垂体分泌的-EP,可进入四周血循环8。本试验结果显示:A组和A+IC组的下丘脑、垂体中-EP含量显著高于M组和A+I组。说明针刺有提高下丘脑、垂体中-EP的趋势。其机制可能是针刺刺激时，脑细胞中的内源性阿片肽释放增加，致使下丘脑、垂体内啡肽类合成速度加快,啡肽类释放增多,含量上升,从而达到中枢镇痛作用。二是外周性镇痛作用,卵巢也是-EP的一个主要来源处,并释放-EP进入血浆8。从试验视察,痛经大鼠A组和A+IC组
13、外周血、卵巢-EP含量明显高于M组、A+I组,且A组与M组和A+I组比较差异有显著性,这可能是针刺通过提高外周-EP水平,使子宫内膜间质、腺上皮、肌间神经纤维-EP含量增多,以致子宫功能活动趋于正常,从而使痛经得以缓解。 依据祖国医学“辨证取穴”、“循经取穴”的原则，试验中选取“关元”、“三阴交”、“地机”穴。关元为足三阴与任脉交会穴；三阴交为足三阴之交会穴，为调经之要穴，可调理冲任气血；地机亦可调经通络止痛，协作三阴交可使冲任气机通畅。针刺能疏通经脉、调和气血、行瘀止痛，且有明显抑制子宫痉挛、缓解子宫肌收缩、解痉镇痛作用。通过针刺一些特别的穴位，可以使适度的内啡肽释放入血，激活小的有髓神经纤
14、维传递冲动到脊髓、中脑、垂体和下丘脑。不同的内啡肽通过释放5-羟色胺、去甲肾上腺素和可能的g-氨基丁酸阻挡新来的难受信息9。针刺通过调整下丘脑-垂体-卵巢轴提中学枢与外周-EP含量可能是其更深层次的镇痛效应之一，而阻断了穴位处Cx43的表达，针刺效应减弱，表明白Cx43在经络信号的传导中起重要作用。 4 参考文献 1Brantl S.Antisense-RNA regulation and RNA interferenceJ.Biochimica Biophysica Acta, 2002, 1575:15-25. 2郑翠红,黄光英,张明敏，等.缝隙连接蛋白Cx43在大鼠经脉线上表达的试验探讨
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