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1、 动物模型 基因敲除小鼠 摘 要：简述帕金森病(PD)动物模型探讨的发展简史，对各种PD动物模型的优、缺点进行了评价。介绍Nurrl基因敲除模型、PD的修正疗法及中医药可能的神经爱护作用。总结Nurrl基因敲除模型具有症状相类性、病理一样性、慢性进行性、可早期神经爱护介入及药物作用的可能靶点等特点，可作为中医药抗帕金森病探讨志向的动物模型。 关键词：中医药；帕金森病；动物模型；Nurrl基因敲除小鼠 帕金森病(Parkinsons disease，PD)是一种严峻危害中老年健康的中枢神经系统退行性疾病。我国初步估计该病患病率为57/10万人以上，随着社会老龄化进展和寿命的延长，其患病率逐步上升
2、。因此，对PD的探讨越来越受到关注。PD属于中医学“颤证”、“拘证”等病证的范畴，运用中医中药治疗PD，相关理论早在内经时代已有记载，长期以来在我国国民保健体系中起着举足轻重的作用，也是我国临床医学的一个特色。近年来，中医药在PD防治的临床和试验探讨方面，取得了令人鼓舞的成果和阅历，已有部分学者留意到中医药潜在的抗帕金森效应及应用价值。PD动物模型的制作是探讨的基础和关键，无论探讨其发病机制，还是探究新的治疗方法都离不开PD动物模型。然而，PD在动物中没有自发的倾向，进行PD试验探讨须要建立适当的动物模型。随着基因工程技术的不断发展，尤其1997年发觉了遗传因素在PD发病中的重要作用，表达致病
3、基因的转基因动物，或通过基因敲除技术建立各种疾病相关基因的敲除鼠模型，在探究PD的发病机制、疾病诊断、预防及治疗等方面起着越来越重要的作用。而通过破坏基因外显子3建立的Nurrl基因敲除(Nurrl +/-)小鼠模型，具有症状相类性、病理一样性、慢性进行性及可早期神经爱护介入等特点，可作为中医药抗PD志向的动物模型，现试作阐述。 1PD动物模型探讨简史 意大利科技史学家卡斯蒂廖尼在他的世界名著医学史中这样写道：“帕金森(Jalne8 Parkinson 17551824)因其1817年论震颤麻痹一书，而在医学发展史上占有坚固的地位”在Parkinson去世40年后，闻名神经病学家Chareot
4、 JM，对震颤麻痹补充了一项重要体征-St强直，不仅进一步完善了震颤麻痹的诊断，而且为了纪念James Parkimon遂用其名字命名为Parkinson disease，被正式纳入教科书。其间，世界各地虽对该病多有报道，但对其病因、发病机制等知之甚少。直到20世纪50年头Carlson等对啮齿类动物注射利血平后，使动物产生类似PD样症状，特点表现为运动急剧削减、运动功能减退、运动不能和全身僵硬，这是最早建立的PD动物模型。该模型可以很好地用于纹状体多巴胺替代物如LDOPA和多巴胺激烈剂的治疗效果探讨，但该模型引起的发病过程是急性的、可逆的，不完全符合PD的慢性的、进展性的发病过程。6-羟基多
5、巴胺(6-Hydroxydopamlne，6-OHDA)是第一个被发觉具有特异性儿茶酚胺能神经通路神经毒性的化学试剂。1968年，Ungerstedt等胜利地建立6-OHDA动物模型。这是目前唯一一种可以对模型动物行为改变进行量化检测的模型，且可用于PD的发病机制及药物疗效判定、细胞移植治疗、基因治疗、神经爱护治疗方面的探讨。但该模型仍属急性损伤模型，不能模拟PD慢性进行性病程特点，病理方面也与人类PD有肯定差异(如无细胞内Lewy小体)。1-甲基-4-苯基-1、2、3、6四氢吡啶(MPTP)来源于人工合成毒品中间产物，1983年报道该物质在人类可产生震颤、僵直、面部表情呆滞等类似PD的表现。
6、Bums等首次建立了利用MPTP制成的非人灵长类动物PD模型。该模型在症状及病理、生化变更方面均酷似人类PD而且稳定牢靠，对抗PD药物的反应(包括副作用)也同人类相像。这是目前所建立的最能反映人类PD特征的动物模型，因而被广泛用于PD发病机制、诊断及治疗方面的探讨工作中，但费用高和管理不便是其缺点。20世纪PD的重要进展是明确了遗传因素在发病中的重要地位，目前发觉家族性PD的发病与-synuclein(1997)、parldn(1998)、DJ-1(2003)、PINKl(2004)、LRRK2(2004)、Glucocerekrosidase(2004)、泛素碳末端水解酶(UCHL1)、sy
7、nphiin-1、NR4A2、Nurrl以及tau等基因突变有关。已建立的基因模型，包括：-synucldn转基因小鼠、果蝇，-synucldn、parkin、Nurrl基因敲除小鼠模型等。基因模型为探讨的发病机制供应了一个良好的手段，且转基因小鼠为验证基因突变和环境因素之间的相互作用供应了一个良好的模型。但不是全部的基因模型都能够表现出黑质神经元变性等的典型特征，制备过程困难、技术要求高、费用昂贵是其缺点。 总之，PD模型均有各自的特点、作用机制、局限性和适用性，Shimohama等把众多PD动物模型按药物成分作用方式分为3类：可逆性药物模型：利血平、安定类药；永久性DA耗竭模型：6-OHD
8、A、MPTP、甲基苯丙胺；含细胞内涵体并缓慢DA耗竭模型：鱼藤酮、-synucldn基因鼠、果蝇。目前建立的PD动物模型都是使动物在短时间内出现PD的症状或病理改变，很难仿照PD这一神经系统的慢性进行性疾病的自然进程。因此，获得一种更为志向的PD动物模型，将更有利于对PD病的发病机制及试验治疗进行深化的探讨。 2 Nurrl基因敲除模型 Nurrl，核受体相关因子1(nuclear receptor related factor1，也称为NOT，TINUR，RNRI，HZF3，和NB4A2)，是一种转录因子，属于核甾体/甲状腺激素受体超家族成员。Nurrl在中脑优势表达，作为基因转录调控蛋白与
9、黑质多巴胺能神经元细胞的发育、发展和生存有亲密的关系。学界普遍认为它是帕金森病相关基因，而备受瞩目。现有探讨表明Nurrl对中脑多巴胺能神经元的发育、生存及其功能维持起重要作用，Nurrl的激活可增加多巴胺表型标记基因如酪氨酸羟化酶(TH)、多巴胺转运蛋白(DAT)等靶基因表达。Jankovic等认为Nurrl与其他对中脑多巴胺能神经元存活起关键作用的因子相互作用，并且可以TH、DAT、囊泡单胺转运体2(VMAT2)和左旋芳香族氨基酸脱羧酶(AADC)的表达，以上这些因子均对多巴胺的合成和储存起重要作用。与PD相关的Nurrl基因的一些突变已有报道，最近Grimes等报道，已检测出多种基因可导
10、致PD，在2003年家族性PD的107名患者当中的10人检测出Nurrl基因外 显子exon 1的两种突变。全部这些探讨表明Nurrl不仅在中脑多巴胺能神经元的发育和功能维持中起到至关重要的作用，也参加了PD的发病过程。 为了探讨Nurrl基因的生物学功能，Nurrl基因敲除小鼠模型已由Conncely等通过破坏基因外显子3建立，这种小鼠表现大量DA能前体神经元凋亡，最终导致黑质体多巴胺能神经元发育不全。同源的Nurrl敲除下降的动物(Nurrl +/-)被用于探讨Nurrl表达水平和黑质多巴胺能神经元功能的关系。成年(Nurrl+/-)的小鼠活动变更与正中缘和正中皮质的多巴胺能水平相关，但不
11、随着纹状体多巴胺能水平变更而明显变更。并且这些鼠表现对MPTP诱导的黑质损伤的神经毒性耐受性增加。中老年(大于15月)表现显著的旋转实力下降和运动实力下降，且与纹状体多巴胺能与NurrlmRNA水平下降相关，并成年龄依靠性。因此，当(Nurrl +/-)组小鼠到15个月或更大的时候，起先呈现出PD的症状，提示黑质多巴胺能功能缺陷呈慢性进行性缺陷，表现为在旋转爬杆试验中运动执行功能的明显损害，在行为的、生物化学的、病理组织学的很多特征与在PD所见到的慢性进行性的黑质多巴胺能神经元退化相像。Nurrl在黑质中的表达将随着年龄而下降，这一点与运动削减，纹状体多巴胺水平以及相应区域TH免疫染色的降低相
12、关联。因此，(Nurrl +/-)小鼠是一种有用的动物模型来探讨PD的发病机制和探究疾病的修正治疗(神经爱护)策略。 3 (Nurrl +/-)小鼠模型在中医药抗帕金森病探讨中的应用 虽然家族性PD只占本病总数的5-10，但对它们的探讨却有望成为打开PD发病机制神奇大门的一把钥匙，而对详细发病机制的阐明则有利于PD的根本治疗，即神经爱护治疗。目前左旋多巴治疗仍旧是帕金森病的金标准，但全部的治疗措施仍停留在对症治疗阶段，并且长期应用会产生疗效减退及难以订正的症状波动、异动症等。而对PD病因及发病机制的深化探讨，为其神经爱护性治疗供应了有价值的干预线索。帕金森病的神经爱护治疗，是指一个过程，即某种
13、治疗能有益地影响PD的病理生理学基础，主要有线粒体复合物-1缺陷，自由基损害和氧化应激，蛋白体功能障碍，凋亡，炎症(小胶质细胞活化)，同“多巴胺拟似剂等对症治疗”相比，它可能推迟发病或延缓病情的发展。迄今，在中医药治疗PD机制方面进行的大量探讨和探讨，为治疗供应了新的思路，而神经爱护是其主要方面，包括：爱护黑质细胞；提高DA、二羟基苯乙酸(DOPAC)、NE.5-HT等神经递质含量；抑制氧化应激反应；降低兴奋性氨基酸兴奋性毒性作用；其他机制如雌激素作用等。 Nurrl基因敲除小鼠是中医药抗帕金森病，尤其是探讨中医药神经爱护作用的志向的动物模型。其特点及在中医药探讨中的可能应用有：症状相类性：动
14、物模型的症状应与同人类患者的特性相像，PD渐进发展，在经过一个长期的过程后出现典型的临床症状。Jiang等探讨表明，Nurrl基因敲除模型，与同年龄的野生型小鼠比较，中老年(平均15月龄)(Nurrl +/-)小鼠在旋转爬杆试验和运动活力方面均为有意义的下降，提示一种运动的损害其类似于PD的缺陷，且这种不正常的运动行为与纹状体多巴胺水平下降，黑质多巴胺能神经元数量削减和黑质Nurrl及DAT表达削减相关联。因此，Nurrl基因敲除小鼠可用于中医方证对应探讨。可早期神经爱护介入：要在临床症状出现前，对新药和治疗对策能赐予评价，因黑质致密部的DA能神经元削减到正常值的70左右才产生临床症状。 中医
15、学历来重视预防，早在内经中就提出了治未病的思想，强调“防患于未然”。素问四气调冲大论说：“是故圣人不治已病治未病，不治已乱治未乱，此之谓也。夫病已成而后药之，乱已成而后治之，譬犹渴而穿井，斗而铸锥，不亦晚乎!”治未病对于健康者可增加体质，预防疾病发生；对于病者则预防疾病的发展与传变。对于PD的早期诊断和早期防治，始终是学界探讨的热点和难点，故对Nurrl基因敲除模型进行早期中医药干预，进行神经爱护治疗是中医防治PD的主要切入点。慢性进行性：PD作为一个慢性进行性的神经变性疾病，现有的啮齿类PD动物模型(如MPTP和6-OHDA)，多巴胺功能的障碍表现出静止的而不是进行性的特点，有很多局限性。临
16、床前探讨应当着重于建立牢靠的慢性模型，在黑质细胞死亡超过可以导致PD症状出现的门槛后应用假定的神经爱护药物，能视察药物的长期作用。目前，有关中医药治疗PD试验探讨报道不少，但对中医药的长期疗效进行视察的探讨较少，而此恰恰是中医药的优势所在，而慢性进行性是Nurrl基因敲除模型的特点之一。病理性一样性：随着年龄的增长DA神经元选择性退行性削减和Lcwy体样细胞内含物，而Lcwy体出现是PD具有诊断意义的病理表现。目前，大多数中医药的试验报道均是从自由基和神经递质对药物作用进行评价，探讨方向和思路相对局限，较少神经生理、神经生化、分子水平、细胞水平的探讨。Nurrl基因敲除模型可用于探讨中医药对PD病理组织学改变的影响。药物作用的可能靶点：中药及其方剂浩如烟海，同时新化合物不断被发觉。因此，从大量的抗PD有效的中医报道和探讨结果中，初步建立一整套中医诊治规范，筛选出一批具有准确疗效的方剂和中药，通过合适的动物模型，进行进一步临床前药物的确认及其作用机制，就显得特别重要和迫切。基因敲除技术用来可揭示药物作用的机制，帮助找寻药物作用的新靶点，为疾病的治疗供应全新的机制。目前，这一技术已被胜利地应用于创新药物的开发和筛选。通过药物作用的新靶点来设计开发新药是目前国外创新药物开发的一条重要线索。而Nurrl基因敲除模可能在中医药抗PD新药的探讨中发挥作用。