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1、 试管培养基 摘要：目的建立测定地黄试管苗组织培育基中N，P，K元素含量的方法。方法稀释不同倍数MS培育液模拟不同培育时间的地黄试管苗组织培育基，分别用水杨酸硝化法、钼蓝法、离子选择电极法测定N，P，K元素的含量。结果试验结果表明，作者选用的测定方法简便、快速、易于操作。结果的精密度和精确度均能满意测定要求。结论建立的方法可实际应用于地黄组织培育基中N，P，K元素含量的测定。 关键词：地黄；氮；磷；钾；含量 中图分类号：O613文献标识码：A文章编号：1672-979X(2007)02-0031-03 Assay method of mineral elements in tissue cul
2、ture medium of test-tube plantlet of Rehmannia glutinosa LIU Feng ，WEN Xue-Sen (School of Pharmaceutical Sciences, Shandong University, Jinan 250012, China) Abstract：Objective To establish a feasible assay methods of N, P and K element in tissue culture medium of test-tube plantlet of Rehmannia glut
3、inosa. Method Contents of N, P and K in tissue culture medium of test-tube plantlet of rehmannia glutinosa were determined by the methods of salicylic acid nitrofication process，molybdenum blue method and ion selective electrode method, respectively. The culture medium had been diluted in different
4、multiple. ResultThe methods were convenient, quick and manipulable. The accuracy and precision of the methods was suitable for the requirement of determination. Conclusion These methods could be used in practical production. Key words：Rehmannia glutinosa；N；P；K；assay 地黄栽培历史悠久，是大宗的常用栽培药材，年均需求量达1 500万
5、kg，出口量为 100万 kg，目前已形成了温县、武陟、孟县、博爱、沁阳等县区（原怀庆辖区）为中心的黄河中下游沿岸地黄主产区1。 病毒病是影响地黄栽培产量和品质的关键因素之一。20世纪90年头末，温学森等胜利地实现了地黄组织培育苗脱毒，目前已得到85-5、金状元和北京-1号3个优良品种的脱毒苗，并胜利投入生产。经过3年的田间试验，证明脱毒地黄亩产可达5 000 kg，比带毒地黄增产23倍。但脱毒苗在大田栽培过程中，第1年就有30%50%再度感染病毒，23年就要更新一次种苗2。因此，如何最大可能地降低脱毒苗组织培育的成本，成为亟待解决的关键问题。为探讨地黄脱毒苗对培育基中各种元素的汲取规律及其对
6、地黄生长的影响，以进一步优化培育基组成，降低培育成本，我们对地黄组织培育基中N，P，K元素的含量测定方法进行了探讨。 目前，地黄组织培育多用MS培育基，离子体系特别困难，而且随着试管苗的生长，其根系可能会不断分泌有机酸、糖类、氨基酸、酚性化合物等根系分泌物进入培育基中，加重了矿质元素含量测定的难度。到目前为止，尚未见组织培育体系中矿质元素含量测定方法的报道。我们以稀释不同倍数的MS培育液模拟不同培育时间的地黄组织培育MS培育基，通过实践，建立了适合地黄试管苗组织培育体系中矿质元素含量测定的方法，为探讨地黄脱毒苗对培育基中各元素的汲取规律，进一步优化培育基组成，降低培育成本奠定了基础。 1仪器与
7、试剂 1.1仪器 TU-1800型紫外-可见分光光度计（北京普析通用）；AY120型电子分析天平（日本岛津）；PXSJ-216型离子分析仪（上海精密科学仪器有限公司）；Pk-1型钾离子选择性电极；T-818-B-6型温度传感器；JB-1A型电磁搅拌器；218双盐桥式饱和甘汞电极（外盐桥充以1 mol/L NH4NO3溶液）。 1.2试剂 （1）硝态氮标准溶液优级纯KNO3 0.721 6 g，配置含N量分别为20，40，60，80，100，120 mg/L的系列NO3-N标准溶液；（2）钼酸铵溶液钼酸铵(NH4)6Mo7O244H2O 13 g，酒石酸锑钾（KSbC4H4O7）0.35 g，分
8、别溶解于100 mL蒸馏水中。不断搅拌下将钼酸铵溶液缓慢加入300 mL硫酸溶液（硫酸-水11，v/v）中，再加入酒石酸锑钾溶液，混合匀称；（3）抗坏血酸溶液抗坏血酸（C6H8O6）10 g，纯化水溶解，棕量瓶定容至100 mL；（4）磷标准溶液KH2PO40.109 7 g，加2.5 mL硫酸溶液（浓度同上），蒸馏水定容至500 mL，摇匀，精密量取10 mL，定容至100 mL，得浓度为5 mg/L磷标准溶液；（5）1 mol/L三乙醇胺-盐酸缓冲液（作为总离子强度缓冲溶液，TISAB），5水杨酸-硫酸溶液（贮于棕色瓶内，现配现用）；（6）MS培育液；（7）无钾MS培育液。 2方法与结果
9、2.1硝态氮含量测定 目前硝态氮含量的测定多用酚二磺酸分光光度法，其前提是无水，须要事先对样品进行水浴蒸干，不适合大量样品的测定。我们采纳水杨酸硝化法3，4 测定硝态氮含量，在浓H2SO4存在下NO3与水杨酸反应，生成的硝基水杨酸在碱性条件下（pH12.0）410 nm处有最大汲取，在肯定范围内与NO3含量呈线性关系。此外，NH4，Cl等离子不干扰NO3含量的测定。 2.1.1硝态氮标准曲线取10 mL刻度试管7只，以0.1 mL蒸馏水作空白，6只各加入上述系列硝态氮标准液0.1 mL，然后分别加入5水杨酸-硫酸溶液 0.4 mL，混匀，室温下静置2030 min（显色）；再加入2 mol/L
10、 NaOH溶液9.5 mL，混匀，冷却至室温后，于410 nm波长下比色，记录吸光度值，绘制标准曲线，见图1。回来方程为：A0.007 4 C0.005 5，r0.999 8。 图1 硝态氮标准曲线 2.1.2样品测定适当稀释MS培育液，精密量取0.1 mL于10 mL刻度试管中，加入0.4 mL 5水杨酸-硫酸溶液，混匀，室温下放置2030 min，再加入2 mol/L NaOH溶液 9.5 mL，混匀后冷却至室温，于410 nm处测定吸光度值，代入上述回来方程，即得培育液中硝态氮的浓度，结果见表1。 表1 硝态氮测定结果 2.2P 元素含量测定 磷含量测定用钼蓝法5，6。在酸性介质，还原剂
11、存在下，正磷酸根离子与钼酸铵生成的磷钼蓝在700 nm处有较强汲取，在肯定浓度范围内，与总磷含量呈线性关系。 2.2.1磷标准曲线精密量取磷标准溶液0，0.5，1，3，5，7 mL于25 mL容量瓶中，加水约20 mL，加10抗坏血酸溶液0.5 mL，摇匀；30 s后加入钼酸盐溶液1 mL，加水至25 mL，摇匀；放置反应15 min，于700 nm波特长测定吸光度，并以吸光度值为纵坐标，以标准磷浓度为横坐标，绘制标准曲线，见图2。回来方程为：A0.524 4 C0.001 2， r0.999 99。 图2 磷标准曲线 2.2.2样品测定适当稀释MS培育液，精密量取2 mL入25 mL容量瓶中
12、，加水至约20 mL，加入0.5 mL10抗坏血酸溶液混匀，30 s后加入1 mL钼酸盐溶液充分混匀，定容至25 mL。放置反应15 min，于700 nm波特长测定吸光度值，代入上述回来方程，即得培育液中磷的浓度，结果见表2。 表2 磷测定结果 2.3K 元素含量测定 目前，钾离子含量测定的方法许多，主要有四苯硼钠重量法、四苯硼钠比浊法、火焰光度法和离子选择电极法。四苯硼钠重量法精确但操作繁琐、费时，不适合大量样品的测定；四苯硼钠比浊法操作简洁，不需特别仪器，但精确性差，已基本淘汰；火焰光度法快速精确，但仪器设备比较昂贵。我们采纳离子选择电极法7-9测定钾离子含量，简便快速，样品不需特别处理
13、，可干脆测定。 2.3.1试验方法采纳标准加入法。精确量取经适当稀释的MS培育液25 mL于50 mL高型玻璃烧杯中，加TISAB 1.3 mL后插入钾电极和甘汞电极，电位稳定后加入浓度为100 mmol/L的KCl标准溶液0.25 mL，在电磁搅拌器上搅拌1 min，静置 2 min，在离子分析仪上读取培育液浓度（以无钾MS培育液作空白校正）。 2.3.2试验条件的选择 2.3.2.1TISAB用量取 1102 mol/L和 4103 mol/L KCl标准液各 25 mL，分别加入不同量的TISAB，在离子分析仪上测定电位值，见表3。结果表明，TISAB用量为 1.3 mL 时电位值稳定。
14、最终确定TISAB用量为1.3 mL。 表3 TISAB用量的影响 2.3.2.2共存离子的干扰Rb+和Cs+对K+的干扰严峻，不过培育液中不含这些离子。Na+亦可干扰K+的测定，当Na+含量为K+的 100 倍时可干脆测定K+，而培育液中Na+含量极低（103mmol/L），因此不会造成干扰。 2.3.2.3电极斜率校正采纳多次添加法校正。取2种不同浓度的标准溶液A、B。 A为经适当稀释后K+浓度为1 mmol/L的MS培育液，取25 mL，并加入TISAB 1.3 mL。 B为浓度为100 mmol/L的KCl标准溶液。B液每次添加量为0.25 mL，共添加6次。经校正得电极斜率为42.8
15、15。 表4 钾测定结果 3探讨 本试验采纳水杨酸硝化法、钼蓝法、离子选择电极法分别测定了MS培育液中硝态氮、磷、钾的含量，方法简便、快速、易操作，对样品不需预处理，适合测定大批量样品，测定结果的精密度和精确度均能满意定量要求，可实际应用于地黄组织培育基中氮、磷、钾含量的测定。 参考文献 1温学森，杨世林，魏建和. 地黄栽培历史及其品种考证J. 中草药，2002，33（10）：946-949. 2Matsumoto M , Shoyama Y, Nishioka I, et al. Identification of viruses infected in Rehmannia glutinos
16、a L var purpurea Makino and effect of virus infection on root yield and iridoid glycoside contents J. Plant Cell Reports, 1989, 7: 636-638. 3白岚，杜继煜. 蔬菜中硝态氮含量的测定J. 农业与技术，2002，22（6）：107-110. 4冯秉琦，赵军. 分析水溶液中硝态氮的新方法J. 土壤农化通报，1998，13（2）：54-55. 5金中华. 磷钼蓝法测定地表水中总磷的探讨J. 贵州环保科技，2002，18（3）：29-31. 6国家环保局水和废水监测分析方法编委会. 水和废水监测分析方法M. 北京：中国环境科学出版社, 1989：280-285. 7王兴恩，卢燕，丁卫，等. 用离子选择电极法测定钾和钠J. 水泥工程，1996，5：30-31. 8李运涛. 离子选择电极连续测定自然水中钾钠含量J. 陕西师范高校学报自然科学版，1997，25（2）：115-116. 9黄德培. 离子选择电极的原理及应用M. 北京：新时代出版社，1982：232-239. 注：“本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。”