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1、-实时荧光定量PCR具体实验步骤-第 15 页实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1 样品RNA的抽提取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30孵育2到3分钟。4下12000rpm离心精品文档，你值得期待15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15
2、到30孵育10分钟后，于4下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4下7000rpm离心5分钟。 RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40l用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80待用。2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用T
3、E稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。 浓度测定A260下读值为1表示40 g RNA/ml。样品RNA浓度(g/ml)计算公式为：A260 稀释倍数 40 g/ml。具体计算如下：RNA溶于40 l DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495l的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 100 40 g/ml = 840 g/ml 或 0.84 g/l 取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 l，剩余RNA总量为：35 l 0.84 g/l = 29.4 g纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值
4、即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。2）变性琼脂糖凝胶电泳测定制胶1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60，10 ml的10 MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。10MOPS电泳缓冲液浓度EDTA灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 l溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。准备RNA样品取3gRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10g/ml。加热至70孵育15分钟使样品变性。电泳上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。56V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少
5、23cm。紫外透射光下观察并拍照28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。3样品cDNA合成反应体系序号反应物剂量1逆转录buffer2l2上游引物l3下游
6、引物l4dNTPl5逆转录酶MMLVl6DEPC水5l7RNA模版2l8总体积10l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70l，37水浴60分钟。取出后立即95干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80待用。4梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（-actin）实时定量PCR -actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3l按10倍稀释（加水27l并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。反应体系如下：标准品反应体系序号反应物剂量1 SYBR Green 1 染
7、料10l2阳性模板上游引物Fl3阳性模板下游引物Rl4dNTPl5Taq酶1l6阳性模板DNA5l7ddH2Ol8总体积50l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。管家基因反应体系：序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料10l2内参照上游引物Fl3内参照下游引物Rl4dNTPl5Taq酶1l6待测样品cDNA5l7ddH2Ol8总体积50l轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：932分钟，然后93 1分钟，55 2分钟，共40个循环。5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的c
8、DNA模板进行PCR反应。反应体系：序号反应物剂量110 PCR缓冲液2.5 ul2MgCl2 溶液1.5 ul3上游引物F0.5 ul4下游引物R0.5 ul5dNTP混合液3 ul6Taq聚合酶1 ul7cDNA1 ul8加水至总体积为25ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。35个PCR循环（941分钟；551分钟；721分钟）； 72C延伸5分钟。PCR产物与 DNA Ladder在2琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为11010，依次稀释至109、108
9、、107、106、105、104几个浓度梯度。6 待测样品的待测基因实时定量PCR 所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。体系配置如下：序号反应物剂量1SYBR Green 1 染料 10 ul2上游引物1ul3下游引物1ul4dNTP 1ul5Taq聚合酶2ul6待测样品cDNA5ul7ddH2O 30ul8总体积50 ul轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：932分钟预变性，然后按93 1分钟，551分钟，721分钟，共40做个循环，最后727分钟延伸。7 实时定量PCR使用引物列表
10、引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。8 电泳各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。实时荧光定量PCR组织RNA提取：一般认为100mg肝组织提取RNA 500ng，100mg肺提取RNA 200ng，脑内的RNA丰度适中，100mg脑组织，提取RNA 5-200ng。所以一个10mg的海马可匀出R
11、NA约为20ng。反转录反应 反转录反应参照TaKaRa RT-PCR说明书。反转录反应条件如下。 37C 15 min（反转录反应） 85C 5 sec（反转录酶的失活反应） Real Time PCR反应 选用脑源神经营养因子（BDNF）为目标基因，核糖体18S rRNA(18S rRNA)做为内参。基因引物序列扩增片段长度NR2BNR2B(+)CCGCAGCACTATTGAGAACA213 bpNR2B()ATCCATGTGTAGCCGTAGCC18s rRNA18s rRNA(+)TTTGTTGGTTTTCGGAACTGA198 bp18s rRNA()CGTTTATGGTCGGAAC
12、TACGA1） 按下列组份配制PCR反应液（反应液配制请在冰上进行）。 试剂 使用量 终浓度 SYBR Premix Ex TaqTM（2） 12.5 l1 PCR Forward Primer（10 M） 1 l0.4 MPCR Reverse Primer（10 M） 1 l0.4 M模板（cDNA溶液） 0.5 ldH2O 10 lTotal 25 l 全班40人，分为5组，每组做8管。4管做BDNF，4管做18S rRNA。4管BDNF或者18S rRNA，采用相应的正反PCR引物。每种基因做两个模板，一个模板采用原液浓度，一个模板采用稀释一倍浓度，体积均为0.5 l。2）三步法PCR
13、 首先95C 作用3 min。 PCR进行35个循环。步骤温度时间变性95C30 秒退火58C30 秒延伸72C30 秒融解曲线温度时间变温速度95C0秒20C/秒55C15秒20C/秒95C0秒C/秒PCR疑难解答当PCR结果不甚满意时，首先检查以下几方面并遵照执行：1将PCR反应的试管与反应板紧贴。2当酶反应混合物以70“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍3微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。4不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。5对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加
14、模板进行正常PCR扩增。没有扩增产物：1在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。2泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。3检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。4检查模板和引物的用量。5增加循环次数和/或模板DNA的用量。泳道中出现模糊条带：1减少循环次数或模板DNA的用量。2提高退火温度，但不要超过68。3重新设计引物或设计更长的引物。其他值得注意的条件：1建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管
15、在92时不能有效地使模板变性。2最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。3大多数反应中，0.75ml（0.51ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。4500mmol/L dNTP组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。5基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。6要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。7降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩
16、增时，引物长度一般为2434个核苷酸，溶点在6068间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。8变性：第一步变性在94下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94下进行20-30秒），除非模板中富含GC，则95下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。9延伸：68-72下进行延伸操作。10循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8
17、分钟。11长片断PCR系统扩增的片断其3-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。12测序时因酶的混合物带有35外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。13在无菌的0.5ml或0.2ml离心管中按下列操作程序加样：14反应物 加样顺序 体积(l) 终浓度10Buffer B 2 5 110PCRBuffer成分：Tris-HCl pH8.5 100 mMKCl500 mMMgCl15 mM4dNTP混合物 3 5 各200mol/LMgCl2mol/Lmol/LgTaqDNA聚合
18、酶 8 0.4 1unit2.用微量可调加样器和一次性Tip向每一管中加50l矿物油。每加一管换一次Tip。3.振荡每只管，然后短暂离心。4.将管放到预热的热循环中，按下列程序开始循环：预变性 94 4分钟 1次变性 94 1分钟退火 37-65 1分钟延伸 72 1分钟循环30次终延伸 72 7分钟 1次保存 4讨论1.假阴性，不出现扩增条带PCR反应的关键环节有模板核酸的制备，引物的质量与特异性，酶的质量，PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。模板：模板中含有Taq酶抑制剂，在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，有可能是模
19、板核酸提取过程出了毛病，可使用阳性对照的DNA模板配合检查模板质量。酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：选定一个好的引物合成单位。引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低
20、，在稀释引物时要平衡其浓度。引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏，导致引物变质降解失效。引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul、或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul 后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。物理原因：变性对PCR扩增来说相当重要，如变性温度低，变性时间
21、短，极有可能出现假阴性;退火温度过低，可致非特异性扩增而降低特异性扩增效率，退火温度过高影响引物与模板的结合而降低PCR扩增效率。有时还有必要用标准的温度计，检测一下 扩增仪或水溶锅内的变性、退火和延伸温度，这也是PCR失败的原因之一。靶序列变异：如靶序列发生突变或缺失，影响引物与模板特异性结合，或因靶序列某段缺失使引物与模板失去互补序列，其PCR扩增是不会成功的。出现的PCR扩增条带与目的靶序列条带一致，有时其条带更整齐，亮度更高。引物设计不合适：选择的扩增序列与非目的扩增序列有同源性，因而在进行PCR扩增 时，扩增出的PCR产物为非目的性的序列。靶序列太短或引物太短，容易出现假阳性。需重新
22、设计引物。靶序列或扩增产物的交叉污染：这种污染有两种原因：一是整个基因组或大片段的交叉污染，导致假阳性。这种假阳性可用以下方法解决：操作时应小心轻柔，防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外。除酶及不能耐高温的物质外，所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管及样进枪头等均应一次性使用。必要时，在加标本前，反应管和试剂用紫外线照射，以破坏存在的核酸。二是空气中的小片段核酸污染，这些小片段比靶序列短，但有一定的同源性。可互相拼接，与引物互补后，可扩增出PCR产物，而导致假阳性的产生，可用巢式PCR方法来减轻或消除。PCR扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩
23、增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是Mg2+离子浓度过高、退火温度过低，及PCR循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。其对策有：必要时重新设计引物。减低酶量或调换另一来源的酶。降低引物量，适当增加模板量，减少循环次数。适当提高退火温度或采用二温度点法(93变性，65左右退火与延伸)。PCR扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过多或酶的质量 差，dNTP浓度过高，Mg2+浓度过高，退火温度过低，循环次数过多引起。其对策有：减少酶量，或调换
24、另一来源的酶。减少dNTP的浓度。适当降低Mg2+浓度。增加模板量，减少循环次数。 PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：模板DNA经加热至93左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；引物的延伸：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配
25、对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。 PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA 扩增量可用Y(1X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着
26、PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。 PCR扩增产物可分为长产物片段和短产物片段两部分。短产物片段的长度严格地限定在两个引物链5端之间，是需要扩增的特定片段。短产物片段和长产物片段是由于引物所结合的模板不一样而形成的，以一个原始模板为例，在第一个反应周期中，以两条互补的DNA为模板，引物是从3端开始延伸，其5端是固定的，3端则没有固定的止点，长短不一，这就是“长产物片段”。进入第二周期后，引物除与
27、原始模板结合外，还要同新合成的链(即“长产物片段”)结合。引物在与新链结合时，由于新链模板的5端序列是固定的，这就等于这次延伸的片段3端被固定了止点，保证了新片段的起点和止点都限定于引物扩增序列以内、形成长短一致的“短产物片段”。不难看出“短产物片段”是按指数倍数增加，而“长产物片段”则以算术倍数增加，几乎可以忽略不计，这使得PCR的反应产物不需要再纯化，就能保证足够纯DNA片段供分析与检测用。基因表达谱基因表达谱(gene expression profile)：指通过构建处于某一特定状态下的细胞或组织的非偏性cDNA文库,大规模cDNA测序,收集cDNA序列片段、定性、定量分析其mRNA群
28、体组成,从而描绘该特定细胞或组织在特定状态下的基因表达种类和丰度信息,这样编制成的数据表就称为基因表达谱 基因表达谱的获得与表示 在基因芯片的实验中，首先选取来自不同状态的样本，如正常组织与肿瘤组织、不同发育阶段组织，或用药前后的细胞或组织等。其中一种被称为实验样本，另一种就是相应地被称为参考样本。实验样本和参考样本mRNA在逆转录过程中，分别用不同的红、绿荧光基团标记，并将它们混合，与微阵列上的探针序列进行杂交，经过适当的洗脱步骤后，用激光扫描仪对芯片进行扫描，获得对应于每种荧光的荧光强度图像，通过专用的图像分析软件，可获得微阵列上每个点的红、绿荧光强度（Cy5和Cy3），其比值（Cy5/C
29、y3）称为该基因在实验样本中的表达水平。 Step1：基因芯片的制备。在硅胶、玻璃片、聚丙烯或尼龙膜等载体上按特定的排列方式固定大量的探针，形成DNA芯片。芯片种类较多，制备方法也不尽相同，基本上可以分为两大类：原位合成和直接点样法。 Step2：荧光标记探针的制备。将待分析的基因探针在芯片杂交之前进行纯化、逆转录或扩增级荧光标记。最普遍的荧光标记法是用Cye3-dUTP(绿色荧光)标记对照样本，Cye5-dUTP(红色荧光)标记实验室样本。 Step3：标记探针与芯片杂交。选择杂交条件，将制备的荧光探针与芯片进行杂交，一定时间以后，洗去未结合探针，然后进行荧光信号的扫描与分析。 Step4：
30、杂交芯片的扫描。杂交后的芯片用特定波长的激光进行激发，此时芯片上的探针会发出不同波长的荧光。用共聚焦激光扫描仪检测探针的荧光强度，可以得到Cy5和Cy3的两幅单色图像。分别对这两幅图像进行伪色彩处理，然后叠加称为一幅图像，这就是实验所得到的原始数据杂交图像。图像中样点的荧光强度值间接给出了基因芯片中对应探针的相对丰度值。如果来自测试样本的表达丰度高，那么样点呈红色；如果来自参考细胞样本的表达丰度高，那么样点呈绿色；如果两者丰度相当，样点就呈黄色；如果二者没有进行杂交反应，则样点保持背景黑色不变。通过这种方法，取自两个不同样本的基因相对表达水平差异就可以表现出来。 Step5：将基因表达谱数据从
31、杂交图像中提取出来，即将原始杂交图像转化为基因表达谱数据。 研究意义 肿瘤在组织形态学上被划分为多种不同的类型和亚型，而肿瘤亚型的准确诊断对肿瘤的临床治疗具有重要意义，然而肿瘤的分型在临床上一直处于难以处理的状态，许多形态学上相似的肿瘤，如白血病的许多亚型等都会有相似的临床症状，但却需要不同的治疗方法，从分子生物学的角度上看 ，肿瘤是由于某些染色体上DNA损伤致使细胞内基因异常表达，导致细胞生长失控、缺乏分化和异常增生的一类复杂基因疾病。正因为肿瘤发展机制的复杂性，100多年来的研究仍未揭开其中的奥秘。研究肿瘤基因表达谱、选取信息基因是从信息学角度出发以寻找肿瘤相关基因、发现肿瘤基因表达特征的
32、直接手段。肿瘤基因表达谱数据显著特点是样本的位数高而样本很小、噪声冗余大而信息基因少。每个样本都记录了组织细胞中所有可测基因的表达水平，但实际上只有少数基因才真正同样本类别相关，它包含了样本分类的信息。信息基因选取问题是肿瘤基因表达谱分析的核心内容。它既是建立有效分类模型的关键，也是发现肿瘤分类与分型的基因标记物以及药物治疗潜在靶点的重要手段，目前人们对该问题已进行了一定程度的探索。然而，如何在基因表达谱的成千上万个基因中有效选出样本的分类特征，一直是肿瘤基因表达谱分析中的难点所在，这个问题仍有待深入研究。 当前的肿瘤分类技术高度依赖病理学工作者对肿瘤组织的主观判断，而基于微阵列技术，即使一些
33、组织没有显著变化，利用基因表达谱也能够对之做出早期诊断；基于基于基因表达谱的肿瘤分型和分类研究为理解肿瘤的发生的机制，以及肿瘤的临床治疗提供了重要依据；研究人员可以根据基因表达谱的变化来区分形态学上相似的肿瘤，而肿瘤类型的精确诊断将有助于制定配套的最佳治疗方案。表达谱基因芯片实验操作流程一、试剂1.TRIzol2.异丙醇3.氯仿4.75%乙醇（RNase-free）5.Milli-Q水（RNase-free）6.无水乙醇7.dNTPs8.Cy5-dCTP和Cy3-dCTP9.杂交试剂110.标记试剂I11.杂交试剂212.标记试剂II13.反转录酶14.标记试剂III15.反转录引物16.洗片
34、试剂117.反转录酶缓冲液18.洗片试剂219.DTT20.洗片试剂3*试剂720为产品芯片杂交试剂盒中的组分。二、仪器与设备1.电动玻璃匀浆机2.电子天平3.低温高速离心机4.低温高速台式离心机5.超净工作台6.制冰机7.电热恒温水槽8.电泳槽9.电泳仪10.微波炉11.凝胶成像仪12.台式离心机13.核酸定量分析仪14.移液枪15.可调电炉16.旋涡混合器17.杂交箱18.杂交舱19.S-200纯化柱20.真空浓缩仪21.盖玻片22.芯片扫描仪三、总RNA提取1)将超低温保存的样品除去样品袋，在电子天平上称重后，转移至用液氮预冷的碾钵中，用杵子碾磨组织，其间不断加入液氮，直至碾磨成粉末状。
35、2)将碾磨成粉末状的样品，转移至已经加入适量TRIzol试剂的匀浆管中，把匀浆管置于冰浴中，在组织匀浆粉碎机上进行匀浆。匀浆至匀浆液不粘且无颗粒即可。3)将匀浆液转移至15ml离心管中，于4，12000g，离心10min。4)小心吸取上清液转入新的15ml离心管，在1530放置5min。5)向匀浆液中加入氯仿，盖紧离心管盖，用力震荡离心管，在1530放置3min。6)于4，12000g，离心15min。7)从离心机中小心地取出离心管，吸取上清至另一15ml离心管。8)向上清加入异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，在1530放置10min。9)于4，12000g，离心10min。10)弃去上清，
36、缓慢地沿管壁加入75%乙醇5ml，轻轻颠倒洗涤离心管管壁，小心弃去乙醇。11)再加入75%乙醇10ml，在涡旋器上短暂涡旋；于4，8000g离心10min。12)小心弃上清，短暂离心，用移液枪吸去所有上清，在超净工作台中干燥沉淀5min。13)加入RNase-free的Milli-Q水完全溶解RNA沉淀后，-80保存。四、探针标记与杂交1、预杂交1)配制预杂交液：杂交试剂1加入到的Eppenderf管中，振荡混匀后，加入杂交试剂2混匀。2)将配制好的预杂交液放入95水浴锅内变性2min，将待预杂交的玻片放入95水浴锅内变性30sec，玻片取出后即放入无水乙醇中30sec，晾干。3)将已变性的预
37、杂交液加到玻片的点样区域内，盖上盖玻片，放入杂交箱内42预杂交56hr。2、标记探针（以下在冰浴中进行）1)于一已灭菌的1.5mlEppendorf管内依次加入以下试剂（反应终体积为50l，以下试剂均为RNase-free）：ddH2O 23l逆转录引物5l总RNA50100g振荡混匀，置于70水浴10min。取出后，迅速置于冰上。2)分别加入以下试剂：逆转录酶缓冲液10lDTT5ldNTPs4l3)而后在暗室中加入以下试剂：逆转录酶2lCy5-dCTP或Cy3-dCTP 3l4)用手指弹打管壁以混匀样品，手浴2min。将Eppendorf管置于42水浴2hr。5)依次在Eppendorf管中
38、加入标记试剂I 4l，65水浴10min后加入标记试剂II 4l。混匀，合并对照组、实验组。避光，真空抽干至50l左右。6)使用DNA纯化柱（或乙醇沉淀）纯化DNA。7)将柱体在旋涡混合器上剧烈振荡摇匀，悬浮内溶的树脂。将柱顶端的小帽旋松四分之一圈，掰断柱下端的密封头。8)将柱置于一个1.5ml的Eppendorf管中，以3000rpm离心1min将柱置于另一个新的1.5ml Eppendorf管中，去掉顶端的帽，将样品慢慢加到树脂上表面的中间，注意不要搅动柱体。以3000rpm离心2min，经纯化的样品流出，被收集在支持用的Eppendorf管中。9)加入标记试剂III 8l，真空抽干。3、
39、杂交l杂交试剂II，混匀备用。2)将预杂交的玻片取出，用ddH2O冲去盖玻片。3)将探针置于95水浴中变性2min；玻片置于95水浴中变性30sec，玻片取出浸无水乙醇30sec，探针取出后迅速置于冰上。4)将探针置于芯片上，用盖玻片覆盖，置于杂交舱中，用Parafilm密封，放入42杂交箱内杂交过夜（1618h）。4、洗片1)用0.5%的洗涤液1冲洗玻片，去除盖玻片。2)准备两个染色缸，分别装有0.5%的洗片试剂1+2%的洗片试剂2、5%的洗片试剂3，放入60水浴锅中。3)将玻片依次浸入以上两个染色缸中洗涤10min。4)用0.5%的洗涤液1冲洗玻片，晾干后扫描。 基因芯片技术原理及其在表达
40、谱中的应用 摘要：基因芯片（Gene chip），又称DNA芯片（DNA chip）或cDNA微矩阵（cDNA Microarray），是利用光刻合成、高速打印或电定位等技术在硅、玻璃或尼龙膜上按照特定的排列方式固定有大量的基因探针（Gene probe），形成DNA微阵列。样品DNA/RNA通过PCR/RT-PCR扩增、体外转录等技术摻入荧光标记分子与DNA微阵列杂交后，通过荧光扫描器及计算机分析，即可获得样品中大量基因序列及表达的信息。该技术可应用于高通量基因表达平行分析，大规模基因发现及基因分析，基因多态性分析和基因组研究等,特别在表达谱中有重大应用价值。关键词：基因芯片，微阵列，基因表
41、达检测，DNA测序，人类基因组计划随着人类基因组计划的顺利进行，预计到2003年人类可以完全测出自身的基因组序列。届时，人类将进入后基因组时代。探明人类全部基因的结构及其表达调控将成为后基因组时代的一个重要目标，而进行基因表达的检测则是研究基因功能的一个重要环节。传统的建立在电泳基础上的基因表达、序列测定、突变和多态性检测等研究方法，如PAGE、mRNADD和RDA等，不仅费时、费力、费钱，且不利于自动化；而DNA芯片技术结合人类基因组计划提供的大量信息，使得我们能够在全部基因组水平上对上述问题进行研究，其精细度可达到单个细胞中的一个拷贝。因此有人说今后基因组研究的大部分工作将在缩微芯片实验室
42、（Laboratory on a chip）完成。DNA芯片是生物芯片（Biochip）的一种。微阵列包括上万种寡核苷酸或DNA样品，密集排列在硅片、玻片、聚丙烯或尼龙膜等固相支持物上。通过激光共聚焦荧光显微镜获取信息，经电脑系统处理，分析所得资料。一次微排列实验可对上千种基因的表达水平、突变和多态性进行快速、准确的检测。1. DNA芯片技术的基本原理DNA芯片实质上就是在芯片上按照特定的排列方式固定上大量的探针，形成一种DNA微矩阵，将样品DNA/RNA通过PCR/RT-PCR扩增、体外转录等技术掺入荧光标记分子后，与位于芯片上的探针杂交，最后通过荧光扫描仪及计算机进行综合分析后，即可获得样
43、品中大量基因序列及表达的信息。其中制备芯片的材料通常是硅片、玻片、或者是尼龙膜；探针可以是寡核苷酸或cDNA，视用途而定。1-1基因芯片的制备芯片种类较多，制备方法基本上可分为两大类：一类是原位合成；一种是直接点样。原位合成，是指直接在芯片上用四种核苷酸合成所需的探针；而直接点样，是指将已经合成好的探针定位在芯片上。1-2样品制备、杂交和检测待分析基因在与芯片结合探针杂交之前必需进行分离、扩增及标记。根据样品来源、基因含量及检测方法和分析目的不同，采用的基因分离、扩增及标记方法也各异。为了获得基因的杂交信号必须对目的基因进行标记，目前采用的最普遍的荧光标记方法采用的荧光素种类更多，这可以满足不同来源样品的平行分析。用计算机控制的高分辨荧光扫描仪可获得结合于芯片上目的基因的荧光信号，通过计算机处理即可给出目的基因的结构或表达信息。杂交条件的选择与研究目的有关。多态性分析或者基因测序时，每个核苷酸或突变位点都必须检测出来。如果芯片仅用于检测基因表达，只需设计出针对基因中的特定区域的几套寡聚核苷酸即可。表达检测需要长的杂交时间，更高的严谨性，更高的样品浓度和低温度，这有利于增加检测的特异性和低拷贝基因检测的灵敏度。突变检测，要鉴别出单碱基错配，需要更高的杂交严谨性和更短的时间。