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1、动物胃肠道菌群和其免疫功能和健康关系张日俊 (中国农业大学动物科技学院)摘要：本文主要论述了动物胃肠道微生物和对黏膜免疫、体液免疫和细胞免疫作用和特点，以及对动物健康状况影响。关键词：动物；胃肠道微生物；原籍菌群；外籍菌群；黏膜免疫；体液免疫；细胞免疫；健康状况人、猪、家禽、兔、马、犬、大鼠、小鼠等单胃动物消化道中寄居有大量活细菌。据LucKey估计，人类消化道中含1014细菌细胞(而人体或动物体细胞仅为1013)，不管是单胃哺乳动物(如人、猪、兔)或是禽类，其粪便中细菌含量在510951010/g粪便湿重之间，即粪便湿重40以上是细菌细胞。据Gustafsson(1984)研究表明，人体携带
2、微生物总量约为1271g，其中肠道占1000g，肺20g，皮肤200g，口腔20g，阴道20g，鼻10g，眼1g，即胃肠道微生物占人体总微生物量78.7。肠道微生物和肠道黏膜免疫关系十分密切，也是近年来免疫学及相关科学研究热点问题之一，并取得了重要进展。1.动物免疫系统及功能11免疫系统构成动物免疫器官有一级免疫器官和二级淋巴器官。一级（中枢）免疫器官包括骨髓、胸腺、腔上（法氏）囊（哺乳动物无此组织）；二级淋巴器官有脾脏、骨髓和分散淋巴组织（相关淋巴组织），如分布于消化道、呼吸道、泌尿生殖等不同部位弥散淋巴组织（黏膜免疫系统）。这里特别要强调是长期以来，人们对附着于眼球旁哈德氏腺和派依尔氏(P
3、eyers)结（肠道集合淋巴结）研究较少，实际上前者是参加点眼免疫反应主要淋巴组织，后者参加肠道黏膜免疫。 禽类血细胞结构和哺乳动物有很大不同，如禽类所有血细胞都有核，而哺乳动物红细胞、血小板无核。参加免疫反应细胞有5大类：（1）B细胞，主要参加特异性免疫反应体液免疫；（2）T细胞，主要参加细胞免疫反应，又分为杀伤性或细胞毒T细胞（Tk或Tc）、辅助性T细胞（TH）、抑制性T细胞(Ts)；（3）既非T细胞也非B细胞K细胞和NK细胞；（4）单核吞噬细胞系统细胞，通过吞噬细胞、巨噬细胞吞噬和细胞毒参和细胞免疫和体液免疫来发挥效应；（5）粒细胞，包括嗜中性粒（白）细胞、嗜碱性粒（白）细胞、嗜酸性粒（
4、白）细胞和肥大细胞。后3类细胞主要参加非特异免疫反应。动物机体通过特异性反应和非特异性反应强度调节来维持机体正常防御机能。12 肠道黏膜免疫肠道黏膜处于沟通机体内外环境重要位置，具有消化、吸收、分泌和防御等重要功能。动物每日摄取食物都含有大量微生物，其中也包括大量病原微生物，但是正常个体肠道中总是保持正常菌群状态，并不发生感染，从而维持肠道正常结构和功能状态，其原因除了黏膜机械屏障作用、常驻菌群形成菌膜屏障、正常菌群对致病菌和“机会”致病菌制约作用外，肠道黏膜免疫系统起着极其重要作用。肠道黏膜免疫系统包括肠道相关淋巴组织(Gut associated lymphoid tissues, GAL
5、T)和有关细胞、分子成分，如淋巴细胞、巨噬细胞、各种白细胞、嗜银细胞和抗体、溶菌酶、抗菌肽等（Bienenstock,1980）。肠道相关淋巴组织是指沿着呼吸道、胃肠道、泌尿生殖道黏膜上皮，并存在于上皮下淋巴组织。肠道有大量丰富淋巴组织，肠道内壁是机体最大免疫器官，人肠淋巴组织总量和脾淋巴组织相等占整个肠道25。Edeiman(1989)指出，肠内淋巴细胞比任何器官都多，这是和肠道接触抗原表面积最大相适应。在肠淋巴组织中，肠集合淋巴小节、固有膜淋巴细胞和上皮内淋巴细胞对机体防卫都具有重要功能。肠黏膜淋巴细胞道、乳腺、生殖道部位淋巴细胞相关，故认为肠黏膜和这些部位有着黏膜免疫系统。例如动物体细菌
6、性抗原从肠道吸收后可在乳腺产生特异性IgA，在支气管致敏细胞可游走至肠黏膜固有层，鼻咽部接触某抗原可以同时在直肠、呼吸道、阴道产生IgA和IgG。GALT细胞包括B淋巴细胞、T淋巴细胞、浆细胞、巨噬细胞等，其中以淋巴细胞和浆细胞最多。固有膜中B细胞7080可以产生IgA，15产生IgM，2产生IgE，但缺乏产生IgG细胞。sIgA是黏膜体液免疫主要效应因子。肠道抗原(蛋白质、颗粒物菌、病毒、寄生虫)被M细胞摄取并穿行M细胞，传递给PP节(Peyers Patches)，由那里树突状细胞获得，经处理后和MHC类分子形成复合物，呈递给特殊T细胞，激活免疫反应(Liu LD等, 1997)。 T细胞
7、被激活后，促使未成熟B细胞进行型转换进而形成抗原特异性IgAB细胞。这些受刺激淋巴细胞离开淋巴结，流经淋巴管和肠系膜淋巴结进行体循环，最后回归肠固有层和其它黏膜效应部位。此时B细胞在T细胞（主要是CD4T细胞）作用下，进行最终分化。除体液免疫外，肠道黏膜还存在细胞免疫。参和细胞免疫细胞有毒性淋巴细胞(CTL)、ADCC细胞和NK细胞。黏膜固有层内及 GALT中均含有细胞毒性淋巴细胞，病毒感染细胞被这些T细胞所溶解。最近研究表明，上皮内淋巴细胞(IEL)在诱导和调节黏膜免疫应答中起着重要作用。IEL分为两个亚群，一种具有抗原特异性细胞毒功能，另一种具有NK功能，显示抗原特异性溶解细胞能力。在抵抗
8、病原微生物入侵方面，肠道黏膜体液免疫和细胞免疫均发挥着十分重要作用。但除了以克隆选择为基础获得性免疫外，肠道还存在另一种重要防御机制天然免疫系统。天然免疫在发生学上是最古老抗感染防御系统，是相对于高等动物高度特异性和获得性免疫系统而提出来。在无脊椎动物如节肢动物和软体动物中，由于缺乏相应高度特异和记忆性免疫系统，抗菌蛋白(肽)是主要机体防御屏障。而在高等脊椎动物中，抗菌肽作为适应性免疫系统早期防御反应，在获得性免疫系统响应之前发挥其防御功能。无论是植物还是动物，这些抗菌分子都由基因编码并能较快地表达和传递。和以克隆选择为基础典型免疫防御机制不同，抗菌肽产生免疫防御作用不是通过记忆获得，所以它作
9、用现在统称为天然免疫。天然免疫能在宿主被感染后极短时间内控制、延缓、甚至阻止细菌生长(Boman,1995)。研究还发现，在皮肤、口腔、肠道和生殖道等不同部位，可维持一定抗菌肽浓度，使共生自然菌落处于稳定状态(Boman,1996; Cole等,1997; Zhao C等,1995)。Fang等（1997）认为是天然免疫肽单独完成，可能还有其它分子参和。研究发现，在宿主免疫防御过程中，有机体产生防御作用必须快于细菌和病原体繁殖速度，才能使宿主免受伤害，因而需要各种防御机制协同作用。在昆虫主要是由各种抗菌肽来完成。在哺乳动物，除小分于抗菌肽外，天然免疫可能还包括巨噬细胞、嗜中性细胞、T细胞和 N
10、K细胞等细胞吞噬作用和细胞毒性作用。这些作用涉及到许多信号分子，如 NO、碳酸、 IL1、肿瘤坏死因子等（Anderson等,1995）。虽然对这些作用分子信号途径还不完全了解，但它们诱导转录因子完全一样。研究发现，细菌表面物质脂多糖可同时引起高等动物体液和细胞免疫反应。大多数情况下，天然免疫可能是单独完成免疫应答。但在天然免疫不能完全抑制病原菌对有机体损害时，需要两者共同作用（Saberwal等，1994）。2.原籍菌和过路菌及其免疫反应21 原籍菌、过路菌（外籍菌）和宿主关系高等动物胚胎通常是无菌，出生后数小时内，便可在胎儿肠道中检出大肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌、棒状杆菌、酵母菌等需氧菌和兼
11、性厌氧菌。随后厌氧菌逐渐取代需氧菌和兼性厌氧菌，最终占肠道细菌总数90，甚至99以上。各种动物建立起较稳定和完善正常菌群所需时间不等，和各种动物发育特点及饲养管理密切相关，通常至断奶一段时间才完成。正常菌群一旦建立，虽然不同生态区内细胞种类和数量会随着食物不同和年龄增长等生理因素而有所改变。但正常菌群种类，每种细菌数量及所占比例，不同细菌所定居部位等在每一种动物则是相对稳定。正常菌群中各种细菌依据其特性及其和宿主形成适应性，定位于不同生态多系统生境、微生境中，形成各自群落。有细菌经常能从宿主体内分离到，而且数量较多，被称为常住菌。反之，不能经常从动物和人体分离出来，称为过路菌（外籍菌）。过路菌
12、通常不定植或仅短时间在宿主上皮或黏膜细胞表面，和宿主细胞关系不密切，而常住菌则常和宿主细胞紧密接触，关系稳定。根据正常菌群和宿主细胞关系不同，美国哈佛大学兽医学院Dubos(1965)将正常菌群分为原籍菌群和外籍菌群。他认为：原籍菌群是长期进化过程中形成，和宿主关系极为密切和稳定，对宿主是有益，故又称之为固有菌群。他同时指出：任何肠道内都同时存在两类性质不同生物群落，即原籍菌群和外籍菌群。在肠道内有细菌生活在腔道内，有生活在黏膜上皮细胞表面，有生活在隐窝内，因此，肠道生境可分为腔道类型、上皮类型和隐窝类型。这是3个完全不同微生境。定植于宿主黏膜上皮细胞表面和隐窝微生境内菌群(当然绝大多数是原籍
13、菌群)和宿主胃肠黏膜细胞有着极为密切关系，上世纪初就曾观察到一些微生物，如螺旋体和乳杆菌等和正常动物胃肠上皮细胞表面紧密相连。用扫描电镜观察后表明，在小鼠和大鼠胃非分泌性磷状上皮细胞表面有大量乳杆菌，有似乎根植于上皮细胞内，只有半截留在外面。类似情况还见于鸡、猪、羊、猴和人胃肠道。用电子显微镜观察表明，在细菌黏附到上皮细胞表面后，多数上皮细胞并不发生形态学变化。虽然细菌黏附部位上皮细胞膜依然是完整，但黏附细胞形态却发生了明显改变，细胞浆特异性地包围着插入菌体。螺旋体和螺旋菌也使恒河猴结肠上皮细胞发生超显微结构改变。菌体一端插入上皮细胞膜后，在上皮细胞表面形成一个小窝，定植部位微绒毛被破坏，刷状
14、体末端网状结构减少。进一步研究表明，大部分细菌细胞壁和宿主细胞膜不直接接触，它们之间有几十皮米距离，其间充满来源于细菌细胞壁和宿主上皮细胞纤丝状物。这些丝状物长58m，宽35m。细菌和细胞通过这些丝状物保持着密切接触。最近研究表明，在上述丝状物中，除部分为细菌菌毛外，其中还有某些化学物质。这种化学物质呈纤维状，从细胞伸向细胞周围，似将细菌包围起来，故称糖须或糖被(glycocalyx)。糖须或糖被同时存在于细菌和宿主细胞表面，是以细胞膜表面延伸出来一种多聚体，包括有蛋白质、蜡质、多糖、葡萄糖、醛酸、唾液酸等，带有强烈阴性电荷。现在认为糖须或糖被有利于细菌黏附到细胞表面，并在糖须或糖被保护下发展
15、各自种群，形成微菌落，避免不同细菌间过度混杂和竞争。包容于糖须或糖被内细菌和宿主肠道黏膜上皮细胞紧密黏附在一起，比较固定，很少迁移。这些细菌生理和代谢活动和细胞生理和代谢活动密切相关，甚至溶为一体。现在还发现一些正常细菌甚至可长期寄居在宿主组织和细胞内而不对宿主产生有害作用。现已证实，并非所有病毒均对宿主有致病作用。许多病毒致病作用都是在一定条件下发生。可以肯定，更多病毒属于正常病毒群，虽然它们在宿主体内长期存在，但对宿主非但无害，而且具有促进生长发育、细胞成熟和提高免疫机能作用。动物体内许多正常病毒群是以前病毒形式存在于宿主细胞核酸链中。这些病毒可以自然释放出来，也可以人工诱导出来，在这种情
16、况下，这些前病毒和宿主细胞间平衡就被打破，病毒就可能对宿主致病。对正常微生物群(包括正常细菌群和正常病毒群)和宿主相互关系，目前虽已积累了许多资料，但仍有许多问题未弄清楚。这一领域目前正引起人们越来越多关注。相信随着研究深入，正常微生物和宿主关系方面知识将会迅速增加。2.2 原籍菌群免疫反应特点原籍菌群和宿主关系密切，数量大，不仅皮肤和黏膜表面上有，黏膜下层、上皮细胞表面和细胞间隙也有，有栖居在细胞壁内细胞浆膜外，有些病毒长期定居在细胞内。从理论上讲，宿主应对这些微生物有强烈免疫反应，但事实却相反，不但反应很低，而且有根本无反应，并表现出如下特点：(1)原籍菌群和宿主组织具有相同或相似抗原性：
17、 原籍菌群不易引起宿主产生抗体。例如将类杆菌经口或非经口接种于分离出该菌动物就不会诱生抗体，即使诱生了抗体，其滴度也远远低于外籍菌群诱生抗体水平。这是用单联悉生动物证明。这就是说，原籍菌不能诱生和其抗原起反应抗体。(2)宿主低反应性：宿主对原籍菌群低反应是一个特点。原籍菌群一般不引起宿主产生抗体或即使产生也是低水平。通过悉生动物实验证明，外籍菌较原籍菌易引起宿主产生抗体。例如双歧杆菌一般就不会引起机体产生抗体，尽管数量很大。(3)自然抗体：在人和动物血清及其它分泌物质中可以找到对原籍菌群自然抗体。许多微生物如嗜碱性韦荣氏球菌(Veillonella alkalescens)和多形态梭杆菌(Fu
18、sobacterium polymorphum)，在正常人血清内有其杀菌素，但他们都是口腔正常微生物群。另外，在正常人血清、唾液和尿内都有被认为是正常微生物群低抗体水平，如轻链(S.mitis)、唾液链(S.salivarius)、肠球菌及大肠杆菌等。通过被动血凝反应和琼脂扩散沉淀反应证明，在健康人或动物体内存在着对厌氧菌，如类杆菌和梭杆菌低水平抗体，而且还证明这些菌脂多糖能和该抗体起反应。另外用放射免疫方法也证明正常血清内有对脆弱类杆菌(B. frasilis)、肠球菌和大肠菌抗体。(4)分泌型免疫球蛋白：分泌型IgA分泌片是由黏膜上皮细胞合成，而在唾液、泪液、初乳、上呼吸道分泌物、胃肠液、
19、尿及汗液内 IgA双体(dimer)是由黏膜下浆细胞合成。分泌片作用可帮助IgA透过腺体黏膜表面和抵抗蛋白酶水解作用。胃肠黏膜如果合成IgA或其分泌片能力障碍，就会引起菌群失调。3.原籍菌群保健作用定植抗力和抗感染作用3.1 原籍菌群对致病菌和潜在致病菌抵抗作用： 许多试验证明，动物肠道中正常菌群对外来细菌大量增殖有着很强限制作用，即使在免疫系统受到损害（辐射）后仍然如此。动物失去肠道菌群后，其它细菌（包括致病菌和条件性致病菌）在肠道中定植并大量增殖就容易得多。这种由肠道正常菌群提供对致病菌和潜在致病菌在肠道中定植和增殖抵抗性被称为定植抗力。对因辐射等原因使免疫系统受到损害，抵抗力下降动物而言
20、，定植抗力极为重要。缺乏定植抗力，动物肠道中病原菌或潜在病原菌极易大量增殖，并突破肠黏膜进入组织中，最终致全身感染，甚至因此而死亡。定植抗力并不仅仅存在于胃肠道。凡是有正常菌群存在部位（包括皮肤表面、口腔、呼吸道黏膜等），都有正常菌群形成定植抗力存在。无菌动物当然没有定植抗力，但只要将从常规健康大鼠分离出厌氧菌群和无菌大鼠联系两周后，带有肠道厌氧菌群大鼠便具备了定植抗力。因此，可以肯定正常动物肠道中厌氧菌群（原籍菌群或固有菌群）在定植抗力中起着主要作用。 (2) 抗感染作用：肠道中原籍菌群对防御病原菌和潜在病原菌对宿主感染起着重要作用。用抗生素破坏肠道中原籍菌群后，对其它细菌定植抗力明显降低，
21、这些细菌便容易大量定植和增殖，在肠道中形成和保持很高峰顶浓度，并感染宿主。如果经抗生素处理动物又经致死量射线辐射，使免疫功能完全被破坏，动物同时失去了定植抗力和免疫力保护，最终因细菌急性感染而死亡。4.外籍菌群具有刺激动物免疫功能作用外籍菌群免疫反应是较强，侵入人或动物体内外籍菌很易引起其宿主产生抗体和致敏免疫活性细胞。在宿主体内，由于存在一些兼性厌氧菌和肠杆菌和肠球菌等，常可引起宿主产生一定水平抗体，因而对和这些菌有共同抗原致病菌或条件致病菌具有明显控制作用。各种动物血清伤寒沙门氏菌杀菌效力并不同，无菌动物最弱，普通动物最强，其它悉生动物居中。单联大肠杆菌悉生动物血清杀菌效力也很强，接近普通
22、动物。这说明大肠杆菌可能和宿主对病原菌或潜在病原菌自然抗体有关。大肠杆菌和双歧杆菌相联，杀菌力反而下降，可能由于双歧杆菌阻挡了大肠杆菌刺激宿主产生抗体能力有关。有些微生物是良好免疫激活剂，能有效地提高干扰素和巨嗜细胞活性，通过促进B细胞产生抗体和提高嗜菌作用活性等刺激免疫力和抗病力。Perdigon等（1986，1987，1990，1991）研究发现乳酸菌（嗜热链球菌和嗜酸乳杆菌）都能显著增强巨噬细胞活性，增加动物肠黏膜免疫反应，促进肠道分泌型免疫球蛋白（SIgA）分泌。Nahashon等（1994）研究表明,在蛋鸡中添加乳酸菌可增大回肠派伊氏结(Payers Patch)细胞结构,这说明乳酸
23、菌可刺激和抗原结构有关黏膜系统。Yamazaki等(1985)、Sekine等(1985,1995)、Yasui等(1989,1991,1994)报道双歧杆菌一些菌种具有刺激免疫系统,促进派伊氏结淋巴细胞增生,诱导产生SIgA,增强动物免疫功能作用。Alvarez等(1998)报道乳酸菌可增强消化道和呼吸道黏膜系统产生SIgA。Yasui等、Sekine等（1994）、Hatcher等（1993）Susumn等（1992）进一步研究证实,乳酸菌及其代谢产物刺激动物机体免疫系统,其作用和免疫佐剂相似,可诱导动物一些和免疫有关细胞产生白细胞介素、促进细胞分裂素、干扰素、肿瘤坏死因子等。Lessar
24、d和Brisson（1987）给断奶仔猪饲喂乳酸杆菌后，接种传染性胃肠炎病毒疫苗，试验组血清中特异性抗体IgG水平显著高于对照组。史俊华（1992）、张朝等（1993）、Jonghwa等（1993）、Yasui等（1994）、Duffy（1994）、Sekine等（1995）对双歧杆菌对宿主免疫功能研究有不同结果，均和菌株之间差异有关。Inooka（1986）报道，用纳豆芽孢杆菌饲喂127日龄白来航公鸡，发现T、B淋巴细胞百分率显著增加。ShuQuan等（2000）发现一种新型双歧杆菌可使大鼠存活率提高10倍，并且显著提高采食量和增重，降低病原菌向内脏组织（脾脏和肝脏）转移，可有效防止沙门氏菌感染，提高免疫功能。KarputIM 等（1996）发现出生5天仔猪，每天饲喂1次益生菌芽孢杆菌或乳酸杆菌，饲喂1个月，可以显著增加血液中蛋白、免疫球蛋白浓度，嗜中性粒细胞中过氧化物酶活性及血清杀菌力；增加粪中双歧杆菌和乳酸杆菌数量，提高了仔猪健康水平。张日俊用含有乳酸杆菌、芽孢杆菌和酵母菌微生物饲料添加剂益生康饲喂肉仔鸡，结果表明益生康能明显刺激胸腺 、脾脏和发氏囊发育，以及增强鸡T淋巴细胞对丝裂原Con A或B淋巴细胞对丝裂原LPS刺激反应性，即能明显增强机体细胞免疫和体液免疫功能，进而增强鸡体抗病力。(参考文献略)