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1、绪论，1.细菌的发现者：安东尼范列文虎克，1665年，列文虎克研制出了第一台显微镜，1675年，通过显微镜看到了细菌。法国的化学家、微生物学家巴斯德：“曲颈瓶实验”建立了病菌学说；创立了巴氏消毒法；研制了鸡霍乱杆菌、炭疽杆菌减毒菌苗、狂犬疫苗。德国的细菌学家郭霍：发明了固体培养基，并创立了细菌染色法；创立了实验动物感染方法。英国细菌学家亚历山大弗莱明发现了青霉素2.微生物：是存在于自然界的一大群形体微小、结构简肉眼直接看不见，必须借助光学显微镜和电子显微镜放大数百至数万倍才能观察到的微小生物。按照微生物的大小、结构和组成分类：原核细胞型微生物（细胞核无核膜、核仁，呈环状裸DNA结构，包括细菌、
2、放线菌、螺旋体、支原体、立克次体、衣原体）真核细胞型微生物（细胞核分化程度高，有核膜、核仁，细胞器完整，包括真菌和原虫）非细胞型微生物（仅有一种核酸类型，包括病毒、亚病毒、朊粒）根据微生物与人类的关系分类：正常菌群：定居在人类皮肤和黏膜上的各类微生物，在正常情况下无害，而且具有拮抗外来病原微生物和提供某些营养物的作用。条件致病微生物：原属正常菌群中的细菌，由于机体抵抗力下降、寄居部位改变或寄居微生物丛平衡失调，能引起内源性感染。病原微生物：指少数能引起人类和动、植物致病的微生物。3.微生物学：是生物学的一个分支，它是研究微生物的类型、分布、形态结构、生命活动及规律、遗传、进化以及与人类、动物、
3、植物等相互关系的一门学科。随着其研究的深入，形成了很多分支学科。4.医学微生物学：是研究与医学和疾病有关的病原微生物的生物学特性、致病性、免疫性以及特异性诊断和预防治疗措施的学科。5.临床微生物学的性质和任务：1.研究感染性疾病的病原体特征2.提供快速而准确的病原学诊断3.指导临床合理使用抗菌药物4.对医院感染进行监控6.临床微生物检验的思路与原则：1.确保分析前质量2.全面了解机体的正常菌群3.保证检验过程中的质量4.采用三定一结合（定性、定量和定位，结合病情）5.重视和加强与临床的联系第一章1.生物安全：采用微生物学技术、安全设施、保护设备,防止实验室工作人员、环境及公众暴露于实验室中处理
4、储存的已知或潜在的感染性微生物。2.实验室生物安全：描述防止实验室发生病原体或毒素意外暴露及释放的原则、技术及实践。3.获得性感染主要是由于处理感染性物质时的操作不当造成的。4.危险度评估是生物安全的核心。5.生物安全基本设备：生物安全柜和个人防护设备6.实验室生物安全保障：指单位和个人为防止病原体或毒素丢失 被窃、滥用、转移或有意释放而采取的安全措施。7.生物恐怖：是指使用致病性微生物或毒素等作为袭击手段, 通过一定的途径散布危险因子，造成疾病的暴发、流行，导致人群失能和死亡。8.消毒（disinfection）：通过物理或化学方法去除或杀灭大多数微生物的过程。灭菌（sterilizatio
5、n）：通过物理或化学方法杀灭或去除所有微生物的过程。消毒灭菌技术包括：热力（湿热灭菌和干热灭菌）、化学（液体或气体）、辐射（辐射和紫外线）、过滤技术。9.医院感染的定义：医院感染又称医疗机构相关感染。指病人入院时不存在也不处于潜伏期而在住院期间发生的感染，同时也包括在医院内感染而在出院后发病的感染。医院感染的分类：外源性感染：交叉感染和医源性感染；内源性感染：又称自身感染10.常见医院感染：泌尿道感染最常见：与留置导管有关、呼吸道感染、外科伤口感染、血流感染占医院感染的小部分，但是最重要的院内感染，近年来日益增加、其它：烧伤、皮肤和软组织感染，眼和结膜感染、子宫内膜炎、产后生殖道感染，胃肠炎、
6、肝炎等。第二章1.标本采集的一般原则：1无菌采集（标本部位和盛放容器）2早期采集3根据目的菌的特性用不同方法采集4采集适量标本5安全采集2.临床常见采血指征 ：1发热（38C）或低温（36C） 2寒战 3白细胞增多（计数大于12，000109/L，特别有“核左移” 未成熟的或杆状核的白细胞） 4粒细胞减少（成熟的多核白细胞1cmX1cm）结晶紫染色1min，水洗甩干 加碘液媒染1min，水洗甩干加95%乙醇脱色30s，水洗甩干 用稀释复红或沙黄复染30s，水洗吸干后镜检临床意义：鉴别细菌 选择治疗用药 与细菌致病性有关4.培养基：由人工方法配置而成的，专供微生物生长繁殖使用的混合营养物制品。5
7、.培养基的种类按物理状态分：液体、半固体、固体培养基（高层、斜面、高层斜面、平板）按用途分：基础、营养、鉴别、选择和特殊培养基5.细菌的培养方法需氧培养法（37，1824h） 二氧化碳培养法：二氧化碳培养箱和烛缸法 厌氧培养法6.生化反应 （一）碳水化合物的代谢试验1.糖（醇、苷）类发酵试验（1）原理：不同细菌分解糖（醇、苷）的酶各异，代谢能力产物各不同，有的不分解，有的仅产酸，有的既产酸又产气，利用此特点鉴别细菌。（2）培养基：0.51.0%糖类等，内有指示剂。（3）方法：细菌接种糖发酵管，37、24h孵育后观察结果结果判断：有的细菌能分解某些糖产酸产气（AG/+），有的只能产酸而不产气（A
8、/+），有的则不能分解糖类（N/-）2. 葡萄糖代谢类型鉴别试验（O/F试验） 原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必需有氧分子参加，在无氧环境下不能分解葡萄糖，称为氧化型; 在分解葡萄糖的过程中，可以进行无氧降解，称为发酵型，此型细菌在有氧和无氧环境下都能分解葡萄糖；不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。 培养基：H-L培养基（O/F 氧化-发酵培养基）阴性杆菌指示剂为溴麝香草酚兰；阳性球菌指示剂为溴甲酚紫。 方法：2支试管，一支加灭菌的液体石蜡覆盖，使培养基与空气隔绝；另一支不加灭菌的液体石蜡，培养基暴露于空气中。35培养1824h后，观察结果 结果及应用：氧化型细菌（O）仅在有氧环境中分解葡萄糖，在
9、无氧环境中不分解，加液体石蜡不变色，不加液体石蜡变色；发酵型细菌(F)在有氧或无氧环境中都能分解葡萄糖，两管均变色不利用型细菌(N)有氧或无氧的环境中都不能分解葡萄糖，两管均不变色产碱型细菌(K)开放管变蓝，封闭管不变色3.-半乳糖苷酶试验（ONPG）（1）原理：具有-半乳糖苷酶的细菌，可分解邻-硝基酚- -D-半乳糖苷（ONPG），生成黄色的邻-硝基酚，在很低浓度下亦可检出。（2）试剂：0.75M ONPG溶液（3）方法：取纯化菌落于0.25ml无菌生理盐水中，制成浓的菌悬液，加入一滴甲苯使酶释放，375min，再加入等量的ONPG溶液，水浴20min-3h观察结果。（4）应用：迅速或迟缓分
10、解乳糖的细菌ONPG试验为阳性，而不发酵乳糖的细菌为阴性。主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定a 细菌分解乳糖需要两种酶，一种是半乳糖苷渗透酶，可是乳糖通过细菌的细胞壁进入菌体内另一种是-半乳糖苷酶，可将乳糖分解成半乳糖和葡萄糖，进而再分解。缓慢分解乳糖的细菌缺乏渗透酶，不能将乳糖快速运到细胞内所以需几天乳糖才能被分解。b 乳糖：葡萄糖和半乳糖通过-半乳糖苷键连接 ONPG：邻硝基酚取代了葡萄糖，其分子小很多可直接进入菌体内。4.七叶苷水解试验（1）原理：有的细菌可将七叶苷水解成七叶素和葡萄糖，前者与二价铁离子反应，生成黑色化合物（2）培养基：七叶苷培养基、胆汁七叶苷培养基（3）方法及应用：肠球
11、菌阳性，其他链球菌阴性5.甲基红试验（MR）原理：细菌在代谢糖的过程中，分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸的代谢有两种途径，一种是丙酮酸进一步分解成甲酸、乙酸、乳酸等混合酸，使PH降低到4.5以下，加入甲基红试剂显红色（阳性）。如果酸进一步转化为其它物质（醇、酮、醛、气体和水），或丙酮酸按另一途径代谢，则PH仍保持在6.2以上，加入甲基红试剂呈黄色（阴性）。 培养基 ：葡萄糖蛋白胨水 方法：将待测纯菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，孵育后加入甲基红试剂，立即观察结果。结果应用：大肠埃希菌阳性，产气肠杆菌阴性。6. V-P试验原理 ：细菌分解葡萄糖产生丙酮酸，丙酮酸脱羧生成中性的乙酰甲基甲醇，乙酰甲基甲醇在碱
12、性溶液中被空气中的氧氧化生成二乙酰，二乙酰再与培养基中精氨酸、肌酐等所含的胍基结合，形成红色化合物（胍缩二乙酰）。培养基：同甲基红试验方法：将待测纯菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，孵育后加入V-P试剂，35放置1530分钟观察结果。 结果与应用: 同甲基红试验一起使用。甲基红阳性者V-P试验常阴性(二)蛋白质和氨基酸的代谢试验1.明胶液化试验（1）原理：细菌分泌的明胶酶（胞外蛋白水解酶）能分解明胶使明胶失去凝固能力而液化（2）方法：将待检菌接种于明胶培养基中， 35孵育24h到7日，每24h取出放入4 冰箱约30min以上，观察有无液化。（明胶的凝固点20 ，高于24 呈液化状态 ）（3）应用：a
13、肠杆菌科细菌鉴别b 厌氧菌鉴定c 非发酵菌鉴定常用2. 吲哚试验（靛基质试验）原理：具有色氨酸酶的细菌，可分解蛋白胨中的色氨酸，生成吲哚（靛基质），吲哚与加入试剂对位二甲氨基苯甲醛作用，生成玫瑰吲哚呈红色。培养基：蛋白胨水培养基方法与结果：将待测菌接种于葡萄糖蛋白胨水中，35培养1824h，再在培养基中加入靛基质指示剂（对二甲基氨基苯甲醛），试剂与培养基两液面接触处呈红色为阳性，无色为阴性。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。3.硫化氢试验原理：有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸，产生H2S，H2S与培养基中Fe2+（或Pb2+）反应生成黑色的硫化亚铁或硫化铅方法：接种细菌，35培养1824h，
14、呈现黑色沉淀者为阳性，无变化者为阴性应用：主要用于肠杆菌科细菌属与种的鉴定4.尿素酶试验原理：有些细菌能产生尿素酶，可分解尿素生成氨和CO2，氨在水液中形成碳酸铵，使培养基呈碱性方法：将待检菌接种于尿素培养基中，培养后出现红色为阳性，不变色（橙色）为阴性应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定5.苯丙氨酸脱氨酶试验原理：细菌产生的苯丙氨酸脱氨酶，使苯丙氨酸氧化脱氨生成苯丙酮酸，后者与三氯化铁(10%)产生深绿色反应。培养基：已用色氨酸作为替代反应。（深褐色经久不退）方法与结果：将待测菌接种于苯丙氨酸琼脂斜面上（接种量稍大），培养后在斜面上直接滴加45滴10%氯化铁试剂，出现绿色反应者即为阳
15、性。注意应立即观察结果，延长时间会引起褪色。 应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定6.氨基酸脱羧酶试验 原理：细菌分泌的氨基酸脱羧酶，使氨基酸脱羧生成胺和CO2，培养基变碱而指示剂发生颜色变化。 培养基：氨基酸培养基和氨基酸对照培养基。 方法及结果：将待检菌分别接种于氨基酸脱羧酶培养基（含葡萄糖、精氨酸或鸟氨酸或赖氨酸，指示剂为溴甲酚紫）和氨基对照管（不加氨基酸），培养后观察结果。对照管为黄色，若培养基由黄色变为紫色为氨基酸脱羧酶试验阳性，若仅发酵葡萄糖显黄色者为阴性。测定管由淡桔黄变紫（溴甲酚紫）或由淡绿变蓝，而对照管黄色，则为阳性。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定（三）碳源利用试验枸橼酸盐（丙
16、二酸盐）利用试验（1）原理：某些细菌能枸橼酸盐（丙二酸盐）为唯一碳源，可在枸橼酸盐培养基上生长，将其分解生成碳酸钠，使培养基变为碱性，指示剂溴麝香草酚兰由淡绿色变为深蓝色。（2）方法：将待测菌接种于枸橼酸盐培养基上，培养后观察。阳性淡绿色变为深蓝色。（3）结果及应用：主要用于肠杆菌科细菌属间的鉴定（四）各种酶类试验1. 氧化酶试验原理：氧化酶又称细胞色素氧化酶，是细胞色素呼吸酶系统中的最终呼吸酶。氧化酶首先使细胞色素C氧 化，然后氧化型细胞色素C使对苯二胺氧化，生成有色琨类化合物（二甲基为红，四甲基为蓝）。方法与结果：1）滤纸片法 2）菌落法3）试剂纸片法：制成干纸片，便于保存。为保证实验结果
17、的准确性，应设阴、阳性对照菌株。阳性者立即出现红色，继而变为深红色至深紫色。应用：1）奈瑟菌属阳性、莫拉菌属阳性的鉴定2）肠杆菌科阴性、弧菌科、假单胞菌阳性及其它非发酵菌的鉴别注意事项1.培养物应新鲜2.试剂应每周配制，空气中易氧化3.避免接触含铁物质4.不宜采用含葡萄糖的培养基上的细菌，因为葡萄糖发酵可抑制氧化酶活性2. 过氧化氢酶试验（触酶试验）原理：细菌分泌的过氧化氢酶，使过氧化氢分解成水和新生态氧，后者进一步形成氧分子出现气泡方法与结果：取洁净滤纸条，粘取被检菌菌落，滴加氧化酶试剂1滴于菌落上；或将试剂直接滴加在被检细菌的菌落上。阳性者立即出现红色，继而变为深红色至深紫色。应用：主要用
18、于革兰阳性球菌的初步鉴别注意事项不宜用血平板上的菌落作试验，以免出现假阳性。不宜用陈旧的培养物，以免出现假阴性 需设阴（链）、阳（葡）性对照试剂需新鲜配制3.硝酸盐还原试验 （1）原理：某些细菌可将硝酸盐还原成亚硝酸盐，后者在与乙酸作用生成亚硝酸，亚硝酸与对氨基苯磺酸作用，形成重氮苯磺酸，在与萘胺合成红色的萘胺偶氮苯磺酸。（2）试剂：甲液：对氨基苯磺酸和乙酸，乙液： 萘胺和乙酸（3）结果：a 加入试剂后显红色阳性b 加入试剂后不显红色加入锌粉，显红色为阴性,不显红色为阳性4. DNA酶试验原理：细菌产生的DNA酶，可使长链脱氧核糖核酸（DNA）水解成寡核苷酸。因为长链DNA可被酸 沉淀，而寡核
19、苷酸则溶于酸，所以当在长有产酶菌落的培养基上加酸后，由于DNA 已被水 解，菌落周围出现透明环。培养基：0.2% DNA琼脂平板方法与结果 ：于DNA琼脂平板上点种待测菌，培养后，在培养基上加入1mol/L的盐酸覆盖平板，观察结果。出现透明环者为阳性，无透明环为阴性。应用：用于金葡菌+的鉴定。 用于G杆菌的鉴定。（沙雷+、变形+）。5凝固酶试验原理：金黄色葡萄球菌能产生凝固酶，使血浆中的纤维蛋白原转变为不溶性的纤维蛋白。凝固酶有两种，一种是结合凝固酶，结合在细菌细胞壁上，可用玻片法检测；另一种是分泌到菌体外的游离凝固酶，可用试管法检测方法：a.玻片法：取未稀释的兔血浆和生理盐水各一滴分别置于载
20、玻片的两侧，挑取金黄色葡萄球菌少许分别混匀，立即观察结果。细菌在生理盐水中无自凝，菌液呈均匀混浊状态，为阳性；菌液聚集呈团块或颗粒状，为阴性b.试管法：3支洁净试管，各加入0.5ml 1:4稀释的血浆，在其中一只中加入0.5ml待检菌的肉汤培养液，另两只中加入0.5ml凝固酶阳性和阴性的菌株肉汤培养物做对照，37水浴箱中孵育14h后观察结果。细菌使试管内血浆凝固成胶冻状，为阳性；试管内血浆能流动、不凝固，则为阴性（24h后不凝固才报告阴性）。注意事项1）玻片法为筛选试验，阴、阳性结果均需进行试管法。2）血浆必需新鲜。3）应使用EDTA抗凝血而非枸橼酸盐抗凝。有些凝固酶阴性的葡萄球菌和肠球菌可利
21、用枸橼酸盐，使抗凝血再次凝固而出现假阳性结果。4）最好不用人血。存在潜在的感染因子和凝固障碍6.CAMP试验（1）原理：B族链球菌能产生CAMP因子，可促进葡萄球菌的溶血素溶解红细胞的活性，因此在两菌（B族链球菌和葡萄球菌）的交界处溶血力增加，出现半月形的溶血区。（2）培养基：血琼脂平板（3）应用：B族链球菌阳性，特异性鉴定（4）注意事项血平板的质量影响试验结果，因此每次需同时做阴、阳性对照。指示菌只能用ATCC25923，而不能用其它金葡代替：因为ATCC25923结果明显，其它金葡结果不典型，甚至出现假阴性结果。试验时必须将待测菌垂直于指示菌划线接种，否则结果不典型。7.胆汁溶菌试验（1）
22、原理：胆汁或胆盐可溶解肺炎链球菌，可能是胆汁降低了细菌细胞膜表面的张力使菌体裂解，也可能是胆汁加速了肺炎链球菌的自溶过程。（2）培养基：10%去氧胆酸钠或纯牛胆汁（3）方法：平板法 3530min 试管法 培养液0.9ml+0.1ml试剂，同上放置（4）应用：肺链+与甲链-的鉴别（五）抑菌试验1.O/129敏感（抑菌）试验（1）原理：O/129对弧菌属和邻单胞菌属有抑菌作用，而对气单胞菌无此作用。（2）培养基：碱性琼脂平板（3）方法：10ug/片、 150ug/片（4）结果与应用：属间鉴定2.杆菌肽试验（1）原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感，而其他群链球菌绝大多数对其耐药。（2）培养基：血
23、琼脂平板（3）结果及应用：d10mm敏感3.奥普托欣试验（1）原理：肺炎链球菌对奥普拖欣敏感，而其他链球菌对其耐药。（2）培养基：血琼脂平板（3）结果及应用：用于肺炎链球菌与其他链球菌的鉴别（六）其它试验1.氢氧化钾拉丝试验 原理：革兰阴性菌的细胞壁在强的稀碱溶液中易于破裂，释放出未断裂的 DNA螺旋，使氢氧化钾菌悬液呈粘性，可用接种环搅拌后拉出丝来，而革兰阳性菌无上述变化。 方法与结果：4%的KOH溶液保存期限不超过一周取一滴4%的氢氧化钾水溶液（应新鲜制）于洁净 的玻片上再取新鲜菌落少许，与 氧化钾溶液搅拌均匀， 每隔几秒上提接种环，观 察能否拉出丝来。能拉出粘丝为阳性结果（革兰阴性 菌）
24、，仍为菌悬液者阴性（革兰阳性菌）。大多革兰阴性菌于510s出现阳性反应，革兰阳性菌60s以后仍为阴性反应。 应用：用于染色结果不明显的革兰阴性菌和革兰阳性菌的鉴别。2. 克氏双糖铁试验（复合生化反应）原理：克氏双糖铁（KIA）琼脂用于观察细菌对糖（葡萄糖和乳糖）的利用能力,以及是否产生硫化氢,可对细菌的种属进行初步鉴定。克氏双糖铁培养基制成高层（下层）和短的斜面（上层）其中乳糖浓度为葡萄糖浓度的10倍，。如果细菌只分解葡萄糖而不分解乳糖，葡萄糖分解产生少量的酸，在最初培养的8 12h内也足以使高层和斜面变黄（酚红指示剂6.8 8.4，黄红），但随着培养时间的延长，培养基斜面部分所产的酸因接触空
25、气被氧化，并因细菌利用含氮物质生成碱性化合物，经18 24h后整个斜面又恢复成红色，深层在相对缺氧的情况下，所产生的酸暂时不被氧化而仍呈黄色；如果细菌既分解葡糖糖，又分解乳糖，因培养基中含乳糖的浓度较高，产生大量的酸，所以整个培养基变黄；如果细菌分解培养基中的蛋白质产生硫化氢，与培养基中的亚铁离子生成硫化亚铁黑色沉淀，使培养基的底层出现黑色。7.抗原检测：凝集反应、免疫荧光技术、酶联免疫吸附试验（ELISA）8.抗体检测：血清学诊断试验以抗体效价明显高于正常人水平或患者恢复期抗体效价比急性期升高4倍才有意义。9.细菌毒素检测：内毒素（革兰阴性）鲎试验；外毒素：体内试验动物试验、体外试验抗原抗体
26、反应第四章1.对革兰阳性球菌的抗菌效果：一代头孢菌素二代三代；对革兰阴性球菌的抗菌效果：一代头孢菌素二代三代2.抗菌药物敏感试验（AST）的意义预测抗菌治疗的效果指导抗菌药物的临床应用发现或提示细菌耐药机制的存在，帮助临床选择合适的药物，避免产生或加重细菌的耐药。监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握耐药菌感染的流行病学，以控制和预防耐药菌感染的爆发和流行。3.敏感（S）:血药浓度达到MIC48倍或以上。是指分离菌株能被测试药物使用推荐剂量时，在感染部位通常可达到的抗菌药物浓度所抑制。耐药（R）：MIC高于药物在血液或组织中的浓度。是指分离菌株不能被测试药物使用推荐剂量时在感染部位通常可达到的
27、抗菌药物浓度所抑制；和/或证明分离菌株存在某些特定的耐药机制；治疗研究显示药物对分离菌株的临床疗效不可靠。4.中介（I）:血药浓度相当于或略高于MIC。是指抗菌药物MIC接近血液和组织中通常可达到的浓度，疗效低于敏感菌株，在药物生理浓集的部位具有临床效力，或者可用高于正常剂量的药物进行治疗；另外中介还作为缓冲区，以避免微小的不能控制的技术因素造成重大的结果解释错误。5.非敏感（NS）:由于没有耐药菌株或耐药菌罕见，此分类特指仅有敏感解释标准的分离菌株。对于这些菌株应当确证鉴定结果和药敏结果。6.常用的药敏试验方法:1.纸片扩散法（K-B法）2.稀释法:（1）宏量肉汤稀释法（2）微量肉汤稀释法（
28、3）琼脂稀释法3.E-test法4.自动化仪器法7.K-B法药敏试验的原理：将含有定量抗菌药物的纸片贴在涂有测试菌的琼脂平板上，纸片中的药物吸收培养基中的水分，溶解后不断向纸片周围扩散，形成递减的浓度梯度；在纸片周围可抑菌的浓度范围内，测试菌的生长被抑制，从而形成无菌生长的透明圈即抑菌圈，圈的大小反应测试菌对测定药物的敏感性程度，并与该药对测试菌的MIC呈负相关，即抑菌圈越大，MIC值越小。根据CLSI最新抑菌圈直径解释标准折点，判定为敏感(S)、中介(I)或耐药（R）培养基和抗菌药物纸片： M-H水解酪蛋白琼脂平板（pH7.27.4，厚度为4mm），纸片为直径6.35mm，吸水量为20微升的
29、专用敏感纸片。试验方法1）菌悬液的调配：0.5麦氏单位。（直接菌落法和培养法） 2）细菌接种：涂抹法 (15分钟内接种完毕),放置35分钟。 3）贴药物纸片：15分钟内完成。纸片中心距离不小于24mm,纸片与培养基边缘距离不小于15mm 4）培养：15分钟内将贴好纸片的平板倒置放入 35(不超过)大气环境培养24h。结果判读,：量取抑菌圈直径（结果判读）细菌应呈融合生长抑菌圈呈透明环状，磺胺类药物抑菌圈内允许出现菌株轻微生长。在平板背面量取抑菌圈直径，通过纸片中心量取。测量较明显抑制的边缘，单位mm,小数点后数据四舍五入注意事项1）菌悬液中严防菌块存在。2）粘液型菌株、干燥型菌株可配成高浓度菌
30、悬液，经沉淀后取上清液稀释至0.5麦氏浊度单位。3）细菌接种后静置35分钟后再贴药敏纸片。4）菌悬液调配好后15分钟内接种完毕。5 ）注意药敏纸片之间的距离及纸片与培养基边缘之间的距离6）药敏纸片一旦贴上不得再移动。7）常规工作中应按要求进行质量控制8.细菌对药物产生耐药性的过程也就是染色体或质粒基因的表达过程。细菌获得性耐药可通过以下几种机制来实现。1.产生各种灭活酶类：1.-内酰胺酶（又称灭活酶、水解酶 2.氨基糖苷类钝化酶和修饰酶、磷酸转移酶、乙酰转移酶、腺苷转移酶3.氯霉素乙酰转移酶4.甲基化酶2.抗菌药物作用靶位的改变：数量减少和/或构型变化3.细胞壁通透性的改变，细菌突变造成孔蛋白
31、丢失或降低其表达4.细菌的主动外排机制5.细菌生物被膜形成9.MRS:耐甲氧西林葡萄球菌MRSA:耐甲氧西林金黄色葡萄球菌MRCNS:耐甲氧西林凝固酶阴性葡萄球菌VRE:耐万古霉素的肠球菌ESBLs：超广谱-内酰胺酶AmpC：超超广谱-内酰胺酶 KPC，NDM-1：碳氰酶烯酶10.多重耐药细菌（MDR）：细菌对常用抗菌药物主要大类中的3类或以上耐药。广泛耐药细菌（XDR）：细菌对常用药物几乎全部耐药，G-杆菌对粘菌素和替加环素敏感；G+球菌仅对糖肽类和利奈唑胺敏感。泛耐药细菌（PDR）：细菌对所有大类的常用抗菌药物全部耐药，G-杆菌对包括粘菌素和替加环素在内的全部药物耐药；G+球菌仅对糖肽类和
32、利奈唑胺在内的全部抗菌药物耐药。11. -内酰胺酶检测原理：-内酰胺酶是一类水解青霉素、头孢菌素类抗生素的灭活酶；该酶位于革兰阳性球菌菌体外，革兰阴性杆菌间质中。最常用的检测方法为头孢硝噻吩纸片法。纸片纸片由黄变为红色为阳性。临床意义：可快速检测流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他布兰汉菌、葡萄球菌和肠球菌对青霉素类的敏感性。流感嗜血杆菌、淋病奈瑟菌、卡他布兰汉菌内酰胺酶阳性表示上述细菌对青霉素、氨苄西林、阿莫西林耐药。葡萄球菌、肠球菌（ 内酰胺酶阳性菌株罕见）-内酰胺酶阳性表示上述细菌对青霉素、氨基青霉素、羧基青霉素、脲基青霉素耐药。12.超广谱内酰胺酶纸片法检测原理：超广谱内酰胺酶（ESBLs）
33、是革兰阴性杆菌产生的由质粒介导的能水解所有青霉素类、头孢菌素类、单环内酰胺类氨曲南的一类酶。是一类由广谱酶TEM、SHV的酶基因发生核苷酸点突变衍化而来的系列酶。目前CLSI用于超广谱内酰胺酶表型检测的细菌有大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和奇异变形杆菌。治疗采用加酶抑制剂的-内酰胺类抗菌药、头霉菌素类或碳青霉烯类药物。初筛试验：按标准纸片扩散法的规定进行 如果ESBLs初筛试验是阳性，需要进一步进行确证试验，按标准纸片扩散法的规定进行 。13.耐甲氧西林葡萄球菌检测原理：细菌产生内酰胺酶、青霉素结合蛋白（PBP)位点改变和DNA解旋酶、膜的通透性下降和泵出机制的改变造成对抗菌药物耐药。
34、 青霉素结合蛋白位点改变是葡萄球菌耐药的重要原因之一，检测方法有头孢西丁纸片法、苯唑西林琼脂稀释法、PBP2a胶乳凝集法。头孢西丁纸片法、苯唑西林琼脂稀释法是目前检测耐甲氧西林葡萄球菌最常用筛选方法。头孢西丁纸片法1. 挑选孵育1624h的葡萄球菌。2. 按K-B法要求，每种细菌接种一个M-H平 板，盖上平板盖子，放置310分钟， 贴上头孢西 丁（30g）纸片。3放置培养箱内孵育，33-35空气孵育24h，量取抑菌环直径。注意温度高于35不能检出MRS。4.结果判读头孢西丁对临床分离的金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌抑菌环直径21mm应报告对苯唑西林耐药，22mm应报告对苯唑西林敏感；头孢西丁对临
35、床分离的除路邓葡萄球菌外的凝固酶阴性葡萄球菌抑菌环直径24mm应报告对苯唑西林耐药，25mm报告对苯唑西林敏感。 临床意义：MRS对所有-内酰胺类抗菌药（具有抗-MRSA活性的头孢菌素例外），可在体外显示活性，但临床上治疗无效。这些药物的敏感试验应报告耐药或不报告。14.诱导克林霉素耐药试验 （D-试验）葡萄球菌对大环内酯类药物的耐药机制1、泵出机制（主动外排）MS型 由msrA基因编码 红霉素（R） 克林霉素（S） B型链阳霉素（R）2、核糖体靶位改变 由erm基因编码 1）MLSb固有表型： erm基因稳定表达 红霉素(R) 克林霉素(R) B型链阳霉素（R） 2）MLSb诱导表型： er
36、m基因需要诱导剂诱导才能表达对克林霉素耐药 红霉素(R) 克林霉素(S) B型链阳霉素（R）erm基因介导细菌产生核糖体甲基化酶，导致23S rRNA甲基化，降低了MLSb类抗生素与核糖体靶位的结合，产生耐药。另外此酶对药物的结合位点进行修饰产生耐药。什么情况下进行DT?待测菌对红霉素耐药、克林霉素敏感或中介时。结果：克林霉素抑菌环不出现“截平”现象，应报告分离株对其敏感。邻近红霉素纸片侧克林霉素抑菌环出现“截平”现象（称为“D”抑菌环），提示存在可诱导的克林霉素耐药，应报告分离株对其耐药，在报告中应注明“通过诱导克林霉素耐药试验，推测此菌株对克林霉素耐药，克林霉素对某些病人可能仍有效”。第五
37、章1.质量保证（QA）：是指有计划地、系统的评估和检测患者诊疗质量的整个过程，以便及时的发现问题，采取有效措施，提高服务质量。2.对检验结果的要求：准确性高、可靠性好、重复性好、快速第六章1.细菌分类学：是指研究细菌分类、命名和鉴定的一门学科。2.自上而下依次为界、门、纲、目、科、属、种。种是最基本的分类单元。3.多相分类学：是将所有可以获得的表型、基因型和进化学信息(系统发育信息)整合在一起，进行综合分析，建立普遍适用于所有细菌的分类方法。4.细菌鉴定：是指将一个未知细菌按照分类原则放入系统中某一适当位置，和已知细菌进行比较，用对比分析方法确定细菌的分类地位。若相同即采用一直菌的名称不同则按
38、照命名原则确定一个新名称。细菌1.链球菌分类：1根据菌落周围的溶血情况将链球菌其分为三大类。 甲型溶血链球菌溶血、草绿色溶血 乙型溶血链球菌溶血、透明溶血 丙型溶血链球菌溶血、不溶血2. 根据抗原：A、B、C、D等20群。3. 临床分类1）A、C、G群溶血性链球菌 菌落直径大于0.5mm 化脓性链球菌（A群）、马链球菌（C 群） 似马链球菌 （G群） 菌落直径小于0.5mm 米勒链球菌（咽峡炎、中间型、星座）2）B群溶血性链球菌： 无乳链球菌3）草绿色溶血链球菌：肺炎链球菌和草绿色链球菌4）不溶血D群链球菌：牛链球菌2.A群链球菌、B群链球菌和肺炎链球菌是链球菌属中的三种重要病原菌。3.一伤口
39、感染患者，是由金黄色葡萄球菌引起的，你对临床送检的标本（伤口拭子）如何进行普通细菌学检验？1.标本直接涂片检查发出初步报告（可写疑似葡萄球菌的术语）。2.选用血平板进行分离培养。3.挑选可疑菌落（菌落特征描述）分纯。4.鉴定：a 革兰染色：菌体形态描述。 b 触酶试验：阳性 c 血浆凝固酶试验：阳性5.药敏试验：常规药敏试验、MRS测定、D试验、可诱导-内酰胺酶检测。6.结果分析与报告：a 鉴定结果：金黄色葡萄球菌（特殊耐药需注明） b 药敏结果：根据CLSI规则的标准报告S，I或R，必要时作出适当的提示或解释。4.肠杆菌科：对人致病性较强:鼠疫耶尔森菌和伤寒沙门菌；可引起肠道感染的:埃希菌属
40、（致病性大肠埃希菌）、沙门菌属、志贺菌属和耶尔森菌属；引起院内感染：枸橼酸杆菌属、肠杆菌属、埃希菌属、克雷伯菌属、沙雷菌属、变形杆菌属等。5.沙门菌属一般于第1、2周取血液，第2、3周取粪便，第三周可取尿液，全程皆可取骨髓分离培养细菌。血清学诊断应在病程的不同阶段分别采血23次。6.钟乳石现象：鼠疫耶尔森菌在液体培养基表面有白色菌膜，并可见有白色的长丝状物沿管壁自液面的薄膜下垂。7.一革兰阴性杆菌，初步生化反应结果为 ：KIA：K/A+；氧化酶试验阴性，这一细菌可能是哪种细菌，你将对它如何鉴定？(1)根据革兰染色结果和初步的生化反应初步判断为肠杆菌科的产硫化氢菌株，可能是迟缓爱德华菌弗劳地枸橼
41、酸杆菌、变形杆菌属细菌或沙门菌属细菌。(2)苯丙氨酸脱氨酶试验阳性即为变形杆菌属、吲哚阳性为普通变形杆菌，阴性为奇异变形杆菌。(3)苯丙氨酸脱氨酶试验阴性，吲哚试验阳性而枸橼酸盐试验阴性者为迟缓爱德华菌。(4) 枸橼酸杆菌和沙门菌属细菌的鉴别用赖氨酸脱羧酶试验，阳性者为沙门菌属细菌；阴性者为枸橼酸杆菌。(5) 沙门菌属细菌的种间鉴别用血清学凝集试验。8.不发酵革兰阴性杆菌的初步认定：需氧或兼性厌氧的革兰阴性杆菌有下列情况之一或多种者，应考虑可能是非发酵菌。1、双糖铁上不发酵葡萄糖。（O-F试验）2、氧化酶试验阳性排除肠杆菌科细菌3、血平板上生长，麦康凯上不生长。9.假单胞菌属一大群氧化分解葡萄
42、糖、专性需氧，触酶、氧化酶阳性（少数菌种阴性）吲哚、甲基红、V-P阴性、有鞭毛的革兰阴性杆菌。生化反应非常相似，代表菌种为铜绿假单胞菌。10.铜绿假单胞菌：液体培养基：均匀浑浊生长，并形成菌膜。因产生多种水溶性色素，可使液体呈灰绿、蓝绿或黄绿色，液面下最明显。培养时间 延长色素扩散至全部液体培养基。普通琼脂平板：大小不一、边缘不整齐、扁平光滑、 湿润、且常呈融合状态的绿色或黄绿色菌落，琼脂被染成绿色血平板：扁平、湿润有金属光泽，有生姜气味的灰绿色或黄绿色菌落菌落周围有透明溶血圈。SS、MAC：微小半透明菌落，48小时后菌落及周围常呈棕绿色。鉴定思路 特征明显者：溶血现象、氧化酶+、色素、特殊气
43、味。特征不明显者：氧化酶+、精氨酸双水解酶+、氧化分解葡萄糖和木糖、42可生长、枸橼酸盐+、特殊气味。耐药机理有：产生多种-内酰胺酶、外膜蛋白的改变、主动外排机制的增强、生物膜的形成11.嗜血杆菌属生物型：根据对吲哚、脲酶和鸟氨酸反应的不同分为8个生物型。血清型：根据荚膜多糖抗原分为6个血清型,b型毒力最强。卫星现象卫星试验12.布鲁菌属常用染色法：柯兹洛夫斯基染色法（柯氏染色）：本菌为鲜红色，背景（其它细菌或细胞）为绿色。13.弧菌科是一群兼性厌氧、菌体短小、弯曲成弧形或直杆状的革兰阴性杆菌。大多氧化酶阳性、发酵葡萄糖、具有一端单一鞭毛，运动活泼，某些菌株生长需要一定量的NaCl. 伯杰细菌鉴定手册将本科细菌分为四个属，分别是弧菌属、气单胞菌属、邻单胞菌属和发光杆菌属。引起人类感染的主要是前三属的细菌，而发光杆菌属存在于海水中，对人不致病。14.气单胞菌属和邻单胞菌属是氧化酶阳性，具有端鞭毛的革兰阴性杆菌。临床微生物检验细菌整理（球菌）菌群形态结构培养特性菌落特征生化反应直接检查与分离培养鉴定