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1、-基因工程疫苗概述1 绪论现代意义的疫苗，就是一种使用抗原、通过诱发机体产生特异免疫反应、预防和治疗疾病或达到特定医学目的的生物制剂。目前用于人类疾病防治的疫苗有20多种，根据预防对象可分为病毒疫苗和细菌疫苗，根据技术特点则分为传统疫苗和新型疫苗。传统疫苗主要包括减毒活疫苗、灭活疫苗和亚单位疫苗；新型疫苗以基因工程疫苗为主，主要包括：基因工程疫苗（基因工程亚单位疫苗、基因工程载体疫苗、核酸疫苗、基因缺失活疫苗及蛋白工程疫苗）、遗传重组疫苗、合成肽疫苗、抗独特型抗体疫苗以及微胶囊可控缓释疫苗等。人类自1796年第一次成功使用疫苗到现在已经制备了近60余种不同的疫苗(表1),这些疫苗使人类最终免除
2、了天花的灾难,同时每年还使数以百万的人免遭多种疫病的侵害。表1 主要人用疫苗的发明时间及成份时间疫苗成份1796 年天花疫苗异源病毒1885 年狂犬病疫苗灭活病毒1897 年鼠疫疫苗弱毒/灭活细菌1920 年伤寒疫苗灭活细菌或多糖1923 年白喉疫苗灭活毒素1926 年百日咳疫苗灭活毒素1927 年卡介苗弱毒菌1927 年破伤风疫苗灭活毒素1935 年黄热病疫苗弱毒病毒1936 年流感疫苗灭活病毒1955 年脊髓灰质炎注射疫苗灭活病毒1962 年脊髓灰质炎口服疫苗弱毒病毒1964 年麻疹疫苗弱毒病毒1967 年腮腺炎疫苗弱毒病毒1970 年风疹疫苗弱毒病毒1981 年乙肝疫苗蛋白质1985 年
3、流感嗜血菌疫苗多糖1990 年甲肝疫苗灭活/弱毒病毒2 基因工程疫苗即DNA 疫苗（遗传工程疫苗），是用重组DNA技术克隆并表达保护性抗原基因，利用表达的抗原产物或重组体本身（多数无毒性、无感染能力、有较强免疫原性）制成的疫苗。基因工程疫苗就是用基因工程方法或分子克隆技术分离出病原的保护性抗原基因, 将其转人原核或真核系统使其表达出该病原的保护性抗原, 制成疫苗或者将病原的毒力相关基因删除掉或进行突变,使成为不带毒力相关基因的基因缺失苗或突变苗,基因工程疫苗只含有病原的部分组成,而常规疫苗往往是一个完整的病原体,因此基因工程疫苗的最大优点是安全性好, 对致病力强的病原更是如此。与传统疫苗相比,
4、基因工程疫苗还具有以下优点：第一,可以降低生产成本,更廉价更大批地生产。第二,易于区分感染动物和免疫动物, 由于荃因工程苗中只含有病原的1-2 种蛋白成份,或者缺失某一蛋白成份, 因此通过检测野毒中含有, 而基因工程疫苗中没有的病毒蛋白的抗体可以方便地从免疫动物中区分出野毒感染者。第三,利用活载体可制成多价疫苗,达到一针防多病的目的。目前用于防制人和动物传染病的疫苗,无论是灭活苗、弱毒苗,还是亚单位苗,其研制都是以大量培养致病微生物为基础的,这不仅给疫苗的制造带来了局限性,同时在疫苗的安全性、免疫性能、产量及保存等诸多方面存在缺陷, 如病原微生物灭活不彻底,导致强毒散播；致弱的疫苗返强等。近几
5、年发展起来的基因工程技术为研制新的更为有效的疫苗带来了希望, 已成为目前生物技术的热点之一。根据基因工程疫苗研制的技术路线和疫苗组成的不同,目前可分为四大类：基因工程亚单位苗；基因缺失苗或突变苗；活载体苗；DNA疫苗。各种基因工程疫苗的性质见表2。表2 几种基因工程苗的特性比较项目基因工程亚单位苗基因缺失或突变苗活载体苗DNA疫苗免疫效果较差好好较好免疫次数多次一次一次二次佐剂需要不需要不需要需要安全性好好较好好稳定性强强较强较强保存期长长较长较长研制周期较长较长长短2.1 亚单位疫苗基因工程亚单位疫苗（subunitvaccin）又称重组亚单位疫苗（Recombinant Subnit Va
6、ccines），它通过DNA重组技术，在受体菌或细胞中高效表达编码病原微生物保护性抗原基因（protective antigen），将相应佐剂加入分泌的保护性肽段中乳化制成疫苗。该疫苗仅含有病原体的部分抗原，使其免疫反应为单一蛋白质所诱导。其具有安全性好，便于生产等优点。在研制亚单位疫苗时，首要任务是选取目的基因，病原体保护性抗原的编码基因或具有协同保护功能的基因为优先选择，如病原体表面糖蛋白编码基因。但对于易变异的病毒（如A型流感病毒） 则选择各亚型共有的核心蛋白基因序列， 然后在PCR对目的基因扩增后， 选择合适的表达系统来表达基因产物。目前原核表达系统（如大肠杆菌）是比较成熟的，但表达出
7、的蛋白抗原性较差； 而真核系统（如酵母）的表达产物好，有巨大发展潜力。最后是加入佐剂，由于亚单位疫苗免疫原性较弱，因此需要既安全又有强活性的佐剂来增强其免疫效果。吕舟等通过比较不同佐剂的猪附红细胞体亚单位疫苗的免疫效果，白油佐剂与弗氏佐剂均能使机体获得较高的免疫应答。另外，荣俊等发现新型的纳米佐剂的易扩散性，减少了副反应，从而能更好地提高亚单位疫苗的安全性。根据作用对象基因工程亚单位疫苗主要分为预防细菌性疾病、病毒性疾病和激素类三种：细菌性疾病亚单位疫苗，病毒性疾病亚单位疫苗，激素亚单位疫苗。2.2 活载体疫苗基因工程重组活载体疫苗(Liverecombinant vaccine)是用基因工程
8、技术将病毒或细菌(常为疫苗弱毒株)构建成一个载体，把外源基因插入其中使之表达的活疫苗。用该类疫苗免疫后，同自然感染类似的是其向宿主免疫系统提交免疫原性蛋白的方式，同时其诱导包括体液免疫、细胞免疫，甚至黏膜免疫在内的多种免疫效应。另外活载体疫苗可构建多价或多联疫苗，取得一针防多病的效果。总之，病毒活载体疫苗既具有活疫苗免疫效力高、成本低的优点，也具有灭活疫苗的安全性好等优点，所以其是当今与未来疫苗研制与开发的重要方向之一。该类疫苗主要分为两类： 基因缺失疫苗和复制性活载体疫苗。2.3 合成肽疫苗合成肽疫苗(Synthetical peptidevaccine) 也称表位疫苗，是根据病原体抗原表位
9、或者抗原决定簇氨基酸序列特点而开发设计的一类疫苗。该疫苗通过人工合成病原微生物的保护性多肽或抗原表位，并辅以适当的载体与佐剂而制成的一种新型基因工程疫苗。特别适用于不能通过体外培养而获得足够量抗原的微生物病原体或生长滴度低的微生物。肽疫苗具有诱发细胞反应强烈，持续时间长，有记忆功能等优点，但同时其缺点也很明显，比如抗原表位的局限性，某些需制造的肽段构象必须与完整病毒上的抗原决定簇构象一致，选定的单一抗原决定簇必须有足够强的免疫原性以及多肽合成和纯化技术的局限性等。目前合成肽疫苗的生产成本昂贵，一般只用于人及珍稀动物。合成肽疫苗的早期研究以口蹄疫病毒(FMDV)合成肽疫苗为主。目前，我国已成功研
10、制出猪O型FMD合成肽疫苗（多肽2570+7309）并投入生产销售。中牧实业股份有限公司和申联生物医药(上海)有限公司均有猪口蹄疫O型合成肽疫苗产品问世。陈方志等在对这两种产品的抗体水平进行检测时发现单次免疫即能维持阳性水平以上的抗体直至生猪出栏。同时，在注射疫苗前后未观察到应激反应，也是该疫苗的一大优势。另外国内天康公司正在进行二价口蹄疫合成肽疫苗的研究。2.4 核酸疫苗核酸疫苗(Nucleic vaccine)又名基因疫苗(Gene vaccine) 或DNA 疫苗(DNA vaccine)，是通过重组DNA技术，定向插入抗原基因至动物细胞表达载体， 在宿主细胞内筛选并获得重组克隆的过程。
11、简单说就是在动物体内接种能编码异源蛋白基因的质粒，产生的功能性蛋白并诱发免疫反应。其合成的抗原蛋白类似于亚单位疫苗，但核酸疫苗的抗原蛋白是在免疫对象体内产生，并能引起全面的免疫反应。核酸疫苗作为疫苗家族的新兴产物，相对于传统疫苗及亚单位疫苗，其最突出的优势有抗原合成和递呈过程类似于病原的自然感染，并通过MHCI类和II类分子直接递呈免疫系统。特别是引起CD4+、CD8+T细胞亚群的活化。另外细胞中只有所需抗原的基因得到表达，载体不具抗原性。同时该疫苗易于构建和制备，适于规模化生产。但其潜在危险性也不容忽视。如外缘DNA整合到宿主的染色体中可能引起插入突变，外源抗原的长期表达及在体细胞的转移可能
12、导致免疫病理反应，可能产生抗DNA抗体，导致自身免疫反应，所表达的抗原可能具多余的生物活性等。解决这些安全问题才能使核酸疫苗进一步发展。据报道，至2008年全球共有94种DNA疫苗产品在进行临床I期至III期试验。犬的黑色素瘤与马的西尼罗病毒核酸疫苗在美国已注册成功。国内疾病预防控制中心与北京生物制品研究所联合研制的DNA天坛痘苗复合型艾滋病疫苗已完成二期临床试验。另外哈尔滨兽医研究所研制的禽流感DNA疫苗(H5亚型，pH5-GD)正在进行临床试验， 免疫后HI抗体可持续1年，并持续抵抗强毒攻击。结论基因工程疫苗技术是疫苗发展史上的一次新革命，它具有许多传统疫苗无法比拟的优点。我国虽然在相关研
13、究上起步较晚，但也已具备一定的基础，并研制多种新型疫苗投入生产，为我国动物疾病防控提供有力支持。同时政府应加大扶持，并充分利用我国在基因工程上游操作的优势， 在现有体系上进一步开发和创新，如开发新型分子佐剂和免疫增强剂， 平衡制品种类与结构等举措来促进产业化进程。基因工程疫苗的进一步发展对于构建完善的疫病防御体系，保障我国畜牧业的健康发展具有举足轻重的作用。参 考 文 献1 陆德如.新型疫苗研究的现状与展望，北京：学苑出版社, 1992,312-820.2 苏国富,等.中国科学（B辑）1993, 23（1）；61.3 皇甫泳穆,等.卡介苗载体及其在疫苗研究中的应用,北京：学苑出版社, 1992
14、 ,321-333.4 Kapusta J , Modelska A , Figlerowicz M ,et al. FASEB J ,1999,13(13): 17961799.5 Vaccine,1998,16(13):13361343.6 韩雪清，刘湘涛基因工程疫苗的研究进展中国兽医科技，2003(5)：19-23.7 智海东,王云峰，陈洪岩.我国兽用基因工程疫苗研发现状与策略.动物医学进展，2011(6)：174-178.8 郑鸣. DNA疫苗的研究进展. 郑州牧业工程高等专科学校学报，2009(29)：15 -18.9 唐金明，花群义，张烈韬，等.我国动物基因工程疫苗的研究进展.养殖技术顾问，2011(7):248-249.10 周国辉，仇华吉，田志军，等伪狂犬病病毒基因缺失及活载体疫苗研究进展动物医学进展，2005(3)：19-22.-第 7 页-