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1、-基因工程技术的现状和前景发展摘要从20世纪70年代初发展起来的基因工程技术，经过30多年来的进步与发展，已成为生物技术的核心内容。许多科学家预言，生物学将成为21世纪最重要的学科，基因工程及相关领域的产业将成为21世纪的主导产业之一。基因工程研究和应用范围涉及农业、工业、医药、能源、环保等许多领域。基因工程应用于植物方面农业领域是目前转基因技术应用最为广泛的领域之一。农作物生物技术的目的是提高作物产量，改善品质，增强作物抗逆性、抗病虫害的能力。基因工程在这些领域已取得了令人瞩目的成就。 由于植物病毒分子生物学的发展，植物抗病基因工程也也已全面展开。自从发现烟草花叶病毒(TMV)的外壳蛋白基因
2、导入烟草中，在转基因植株上明显延迟发病时间或减轻病害的症状，通过导入植物病毒外壳蛋白来提高植物抗病毒的能力，已用多种植物病毒进行了试验。在利用基因工程手段增强植物对细菌和真菌病的抗性方面，也已取得很大进展。植物对逆境的抗性一直是植物生物学家关心的问题。由于植物生理学家、遗传学家和分子生物学家协同作战，耐涝、耐盐碱、耐旱和耐冷的转基因作物新品种(系)也已获得成功。植物的抗寒性对其生长发育尤为重要。科学家发现极地的鱼体内有一些特殊蛋白可以抑制冰晶的增长，从而免受低温的冻害并正常地生活在寒冷的极地中。将这种抗冻蛋白基因从鱼基因组中分离出来，导入植物体可获得转基因植物，目前这种基因已被转入番茄和黄瓜中
3、。随着生活水平的提高，人们越来越关注口味、口感、营养成分、欣赏价值等品质性状。实践证明，利用基因工程可以有效地改善植物的品质，而且越来越多的基因工程植物进入了商品化生产领域，近几年利用基因工程改良作物品质也取得了不少进展，如美国国际植物研究所的科学家们从大豆中获取蛋白质合成基因，成功地导入到马铃薯中，培育出高蛋白马铃薯品种，其蛋白质含量接近大豆，*提高了营养价值，得到了农场主及消费者的普遍欢迎。在花色、花香、花姿等性状的改良上也作了大量的研究。基因工程应用于医药方面目前，以基因工程药物为主导的基因工程应用产业已成为全球发展最快的产业之一，发展前景非常广阔。基因工程药物主要包括细胞因子、抗体、疫
4、苗、激素和寡核甘酸药物等。它们对预防人类的肿瘤、心血管疾病、遗传病、糖尿病、包括艾滋病在内的各种传染病、类风湿疾病等有重要作用。在很多领域特别是疑难病症上，基因工程工程药物起到了传统化学药物难以达到的作用。我们最为熟悉的干扰素(IFN)就是一类利用基因工程技术研制成的多功能细胞因子，在临床上已用于治疗白血病、乙肝、丙肝、多发性硬化症和类风湿关节炎等多种疾病。目前，应用基因工程研制的艾滋病疫苗已完成中试，并进入临床验证阶段；专门用于治疗肿瘤的“肿瘤基因导弹”也将在不久完成研制，它可有目的地寻找并杀死肿瘤，将使癌症的治愈成为可能。由中国、美国、德国三国科学家及中外六家研究机构参与研制的专门用于治疗
5、乙肝、慢迁肝、慢活肝、丙肝、肝硬化的体细胞基因生物注射剂，最终解决了从剪切、分离到吞食肝细胞内肝炎病毒，修复、促进肝细胞再生的全过程。经4年临床试验已在全国面向肝炎患者。此项基因学研究成果在国际治肝领域中，是继干扰素等药物之后的一项具有革命性转变的重大医学成果。基因工程应用于环保方面工业发展以及其它人为因素造成的环境污染已远远超出了自然界微生物的净化能力，已成为人们十分关注的问题。基因工程技术可提高微生物净化环境的能力。美国利用DNA重组技术把降解芳烃、萜烃、多环芳烃、脂肪烃的4种菌体基因链接，转移到某一菌体中构建出可同时降解4种有机物的“超级细菌”，用之清除石油污染，在数小时内可将水上浮油中
6、的2/3烃类降解完，而天然菌株需1年之久。也有人把Bt蛋白基因、球形芽孢杆菌、且表达成功。它能钉死蚊虫与害虫，而对人畜无害，不污染环境。现已开发出的基因工程菌有净化农药的DDT的细菌、降解水中的染料、环境中有机氯苯类和氯酚类、多氯联苯的工程菌、降解土壤中的TNT炸药的工程菌及用于吸附无机有毒化合物(铅、汞、镉等)的基因工程菌及植物等。90年代后期问世的DNA改组技术可以创新基因，并赋予表达产物以新的功能，创造出全新的微生物，如可将降解某一污染物的不同细菌的基因通过PCR技术全部克隆出来，再利用基因重组技术在体外加工重组，最后导入合适的载体，就有可能产生一种或几种具有非凡降解能力的超级菌株，从而
7、*地提高降解效率。 四、前景展望 由于基因工程运用DNA分子重组技术，能够按照人们预先的设计创造出许多新的遗传结合体，具有新奇遗传性状的新型产物，增强了人们改造动植物的主观能动性、预见性。而且在人类疾病的诊断、治疗等方面具有革命性的推动作用，对人口素质、环境保护等作出具大贡献。所以，各国政府及一些大公司都十分重视基因工程技术的研究与开发应用，抢夺这一高科技制高点。其应用前景十分广阔。我国基因工程技术尚落后于发达国家，更应当加速发展，切不可坐失良机。但是，任何科学技术都是一把“双刃剑”，在给人类带来利益的同时，也会给人类带来一定的灾难。比如基因药物，它不仅能根治遗传性疾病、恶性肿瘤、心脑血管疾病
8、等，甚至人的智力、体魄、性格、外表等亦可随意加以改造；还有，克隆技术如果不加限制，任其自由发展，最终有可能导致人类的毁灭。还有，尽管目前的转基因动植物还未发现对人类有什么危害，但不等于说转基因动植物就是十分安全的，毕竟这些东西还是新生事物，需要实践慢慢地检验。转基因生物和常规繁殖生长的品种一样，是在原有品种的基础上对其部分性状进行修饰或增加新性状，或消除原来的不利性状，但常规育种是通过自然选择，而且是近缘杂交，适者生存下来，不适者被淘汰掉。而转基因生物远远超出了近缘的范围，人们对可能出现的新组合、新性状会不会影响人类健康和环境，还缺乏知识和经验，按目前的科学水平还不能完全精确地预测。所以，我们
9、要在抓住机遇，大力发展基因工程技术的同时，需要严格管理，充分重视转基因生物的安全性。近两年来我国化学生物学领域的突出进展时间：2015-04-17 来源：学术堂 所属分类：近年来，化学生物学已经成为具有举足轻重作用的一门新兴交叉学科，是推动未来生命科学和生物医药发展的关键研究领域。通过充分发挥化学和生物学、医学交叉的优势，化学生物学的研究具有重要的科学意义和应用前景，能够深入揭示生物学新规律，促进新药、新靶标和新的药物作用机制的发现，造福于人类的健康事业，推动社会经济发展。目前，化学生物学研究已经引起各国政府和全球重要科研机构的高度重视，成为发达国家竞相资助和优先发展的领域之一。化学生物学研究
10、受到各国政府、科研机构和大制药公司的高度重视。美国国立健康研究院 ( NIH) 提出的生物医学路线图计划 ( NIH oadmap) ，将化学生物学设定为 5 个研究方向之一。它们还设立了巨额预算作为化学生物学的培训经费以及建立了若干着名的小分子化合物筛选平台。例如，博大研究院( Broad Institute) 就是一个由哈佛大学和麻省理工学院共建的合作单位，致力于开发在生命科学和医药学中能探究基因组学的新工具。化学遗传学 ( chemical genetics) 以 及 化 学 基 因 组 学( chemical genomics) 在该过程中发挥着重要的作用。耶鲁大学基因组和蛋白质组研究
11、中心 ( YaleUniversity Center for Genomics and Proteomics) 专门成立了化学生物学研究小组，从事化学生物学新技术的开发，并应用于功能基因组等方面的研究中。美、日和大部分欧洲发达国家的一流大学均建立了化学生物学人才培养计划。各出版机构都相继出版了高水平的化学生物学专业学术杂志，此外许多生物和化学国际会议也设立了化学生物学分会。这些努力都极大地推动了国际上化学生物学研究水平的快速进步。在化学生物学的发展过程中，相继出现了如组合化学、高通量筛选技术、分子进化、基因组( 芯片) 技术、单分子和单细胞技术等一系列新技术和新方法，为化学与生物学、医学交叉领
12、域的研究注入了新的内涵和驱动力。近年来，化学生物学家以小分子探针为主要工具，对细胞生命现象，尤其是细胞信号转导过程中的重要分子事件和机理进行了深入的研究。通过充分发挥小分子化学探针研究信号转导的优势，探索和阐述信号转导途径的分子事件与规律以及在病理状态下的变化规律，为疾病的诊断和治疗研究探索新的思路。与此同时，化学生物学在与包括生物化学、分子生物学、结构生物学、细胞生物学等领域的交叉合作越发深入，研究优势越发明显，这也推动了化学、医学、药学、材料科学和生物学科相关前沿的探索研究，现举例介绍目前的一些具体的交叉研究趋势: 第一，生物有机化学与细胞生物学的交叉融合，利用有机化学手段，通过设计合成一
13、系列多样化的分子探针，研究细胞信号转导过程的重要分子机理; 第二，药物化学与医学的交叉融合，为了实现“从功能基因到药物”的药物研发模式，采用信号传导过程研究与靶标发现相结合，注重药物靶标功能确证与化合物筛选相融合的研究策略; 第三，化学生物技术与生命科学问题的交叉融合，以化学生物学技术为手段，着重发展针对蛋白质、核酸和糖等生物大分子的特异标记与操纵方法，以揭示它们所参与的生命活动的调控机制; 第四，分析化学与生物学的交叉融合，以化学分析为手段，发展在分子水平、细胞水平或活体动物水平上获取生物学信息的新方法和新技术。化学在让生命可视、可控、可创造的进程中日益彰显其核心作用。以下对近两年来我国化学
14、生物学领域取得的突出进展加以具体的归纳和介绍。1 基于小分子化合物及探针的研究1. 1 以小分子化合物为探针，深入研究细胞生理、病理活动的调控机制 自吞噬( autophagy) 是细胞内的一个重要降解机制。中国科学院上海有机化学研究所马大为和美国哈佛大学袁钧英合作，发现 spautin-1 可以特异性地抑制泛素化酶 USP10 和 USP13，进一步促进了 VPS34/P13 复合物的降解，导致特异性地抑制自吞噬。他们发现 USP10 和 USP13 作用于VPS34 / P13 复合物的亚单位 Beclin-1，Beclin-1 是一肿瘤抑制剂，调控 P53 的水平。他们的发现提供了一个蛋
15、白去泛素化调控 P53 和 Beclin-1 的水平、抑制肿瘤的新机制1。近年来，细胞坏死逐渐被认为是哺乳动物的发育和生理过程的重要组成部分，并参与了人类的多种病理过程。雷晓光和王晓东等通过筛选得到 1 个抑制细胞坏死的小分子化合物坏死磺酰胺( necrosulfonamide) 。此前王晓东实验室的研究证实了 IP3 的激酶活性在肿瘤坏死因子 TNF- 诱导的细胞坏死过程中是不可或缺的，并发现 MLKL 扮演着 IP3 激酶其中1 个底物的角色。这次发现的小分子正是通过特异识别 MLKL 而阻止坏死信号的传导2，对于设计并开发针对细胞坏死相关疾病的药物起到了极大的提示和推动作用。裴端卿等继发
16、现维生素 C能够显着提高小鼠与人的体细胞重编程效率( 效率可以达到约 10%) 引起广泛关注之后，进一步研究发现体细胞的组蛋白去甲基化酶 Jhdm1a/1b是维生素 C 介导的细胞重编程的关键作用因子。他们发现，维生素 C 能够诱导小鼠成纤维细胞H3K36me2 /3 去甲基化，并促进体细胞重编程。该工作也证明了制约体细胞“变身”的分子障碍是组蛋白 H3K36me2/3，而维生素 C 能够突破这一障碍从而促进重编程的发生3，该工作被选为了Cell Stem Cell当期的封面文章。邓宏魁等通过系列筛选工作，首次发现 4 个小分子化合物可以完全替代 Yamanaka 四因子，将小鼠体细胞诱导成为
17、多潜能性干细胞，这项工作将直接导致化学再生医药新领域的产生4。宋保亮等针对胆固醇负反馈调控途径，筛选活性小分子化合物，研究其对代谢性疾病的功能作用，并揭示胆固醇代谢负反馈调控的信号转导机制。首先他们针对SEBP 途径构建报告基因系统，对数千种化合物进行筛选，获得 1 种名为白桦酯醇的小分子化合物，它能够特异性地阻断 SEBP 的成熟，抑制其活性。在细胞水平，白桦酯醇能显着抑制胆固醇、脂肪酸和甘油三酯等脂质合成基因的表达，减少脂质合成，降低细胞内脂质含量。因此，白桦酯醇具有良好的抗动脉粥样硬化作用和型糖尿病的治疗作用5。1. 2 若干细胞关键信号转导通路的研究 李林发现了 NC043 和中国科学
18、院昆明植物研究所郝小江发现了天然产物 S3 类似物 HLY78两个全新的调节 Wnt 信号途径的小分子。其中，NC043 影响细胞内 -catenin 和 TCF4 的相互作用而抑制 Wnt 信号途径并抑制结肠癌细胞的生长6; S3 抑制经典 Wnt 信号途径，并且它发挥作用的主要机制是在细胞核里，这为治疗由于经典Wnt 信号途径异常激活而引起的癌症提供了先导化合物。同时，他们还发现 S3 对于不同的经典Wnt 信号途径异常激活的肿瘤细胞系的抑制效率也是不一样的，这为后期探明不同肿瘤细胞系之间的差别和揭示 Wnt 信号途径下游转录调控的机理提供了契机。1. 3 重要靶标、抑制剂和标记物的发现
19、陈国强等在前期发现从腺花香茶菜中提取的腺花素( Adenanthin) 能够诱导白血病细胞分化的基础上，成功地捕获了它在细胞内的靶蛋白过氧化还原酶( peroxiredoxin) I/II，并依此阐释了白血病细胞分化的新机理7。通过对腺花素进行分子改造，并在明确其活性基团后，合成生物素标记的腺花素分子，他们借助蛋白质组学和生物信息学技术平台的支持，以生物素标记的腺花素为“诱饵”，利用蛋白质组学和生物信息学技术，在白血病细胞中“垂钓”腺花素可能结合的蛋白质，结果发现，腺花素能够与过氧化还原酶 Prx I和 Prx II 共价结合，该工作对白血病的病理研究及治疗都将起到极大的推动作用。吴乔、林天伟
20、、黄培强等发现了名为 TMPA 的化合物，能够通过与吴乔等前期发现的与糖代谢调控密切相关的新靶点Nur77 的基因转录调控因子的结合，使原先结合 Nur77 的 LKB1 得到分子释放。后者能够从细胞核转运到胞浆，并激活直接参与糖代谢调控的重要蛋白激酶 AMPK，达到降低血糖目的。此外，他们还通过晶体结构解析了 Nur77-TMPA的复合物晶体，从原子水平上进一步解释了TMPA 结合 Nur77 的构象和精确位点，为今后设计和研发新型的糖尿病药物提供了必不可少的结构基础8。该工作所发现的化合物 TMPA 或可成为一种新型糖尿病治疗药物的“雏形”，为未来新型糖尿病治疗药物的研发提供一个全新方向和
21、路径。杨财广等9进行了基于 mNA 中 N6 位甲基化修饰的腺嘌呤( N6-methyladenosine，m6A) 去甲基化酶 FTO 结构开展小分子调控的研究，首次获得了对核酸去甲基化酶 FTO 具有酶活和细胞活性的小分子抑制剂。张翱、镇学初等10针对帕金森氏病治疗过程中出现的异动症进行作用机制研究，阐明了 5-羟色胺 1A 受体和 FosB 基因与异动症的关系，进而发现了同时靶向多巴胺 D2 和5-羟色胺 1A 受体的新型抗帕金森活性化合物。1. 4 天然产物分子的生物及化学合成谭仁祥等通过研究发现了螳螂肠道真菌( Daldinia eschscholzii ) 产 生 的 结 构 全
22、新 的Dalesconol 类免疫抑制物及其独特的“异构体冗余现象”。在此基础上，发现 Dalesconol 类免疫抑制物是由不同的萘酚通过酚氧游离基耦合产生的，同时发现其“异构体冗余现象”很可能源于真菌漆酶引致的关键中间体优势构象11。该成果不仅为此类免疫抑制物来源问题的解决奠定了重要基础，而且为酚类合成生物学研究提供了新的思路和概念。萘啶霉素( NDM) 、奎诺卡星( QNC)及 Ecteinascidin 743 ( ET-743) 均属于四氢异喹啉生物碱家族化合物，它们都具有显着的抗肿瘤活性，其中 ET-743 已发展为第 1 例海洋天然产物来源的抗肿瘤新药。这 3 种化合物都具有一个
23、独特的二碳单元结构，其生物合成来源问题一直没有得到解决。唐功利等12在克隆了 NDM 和 QNC生物合成基因簇的基础上，通过前体喂养标记、体内相关基因敲除-回补以及体外酶催化反应等多种实验手段相结合的方式，阐明了二碳单元的独特生源合成机制: NapB/D 及 QncN/L 在催化功能上均属于丙酮酸脱氢酶及转酮醇酶的复合体，它们负责催化二碳单元由酮糖转移至酰基承载蛋白( ACP) 上，而后经过非核糖体蛋白合成( NPS)途经进入到最终的化合物中。这种将基础代谢中的酮糖直接转化为次级代谢所需要的二碳单元在非核糖体肽合成途径中是首次报道。该研究结果也有助于揭示海洋药物 ET-743 独特的二碳单元生
24、物合成来源，为非核糖体聚肽类天然产物的组合生物合成带来新的前体单元。此外，他们还利用全基因组扫描技术定位了抗生素谷田霉素生物合成的基因簇，通过基因敲除结合生物信息学分析确定了基因簇边界。谷田霉素可以抑制致病真菌，且对肿瘤细胞表现出极强的毒性( 比抗肿瘤药物丝裂霉素的活性高约 1000 倍) ; 该家族化合物属于 DNA 烷基化试剂，典型的结构特征是吡咯吲哚环上的环丙烷结构。在对突变株的发酵检测中成功分离、鉴定了中间体 YTM-T 的结构，并结合体外生化实验揭示了一类同源于粪卟啉原 III-氧化酶( Coproporphyrinogen III oxidase) 的甲基化酶以自由基机理催化 YT
25、M-T 发生 C-甲基化13，这是此类蛋白催化自由基甲基化反应的首例报道，为下一步阐明 YTM 结构中最重要的环丙烷部分生物合成途径奠定了基础。Pyrroindomycins( PT) 是能够有效对抗各类耐药病原体的一种天然产物，它含有 1 个环己烯环螺连接的 tetramate这一独特的结构。刘文等14通过对 PY 生物合成的研究揭示了 2 个新的蛋白质，均能够单独在体外通过迪克曼环化反应将 N-乙酰乙酰基的-l-丙氨酰硫酯转化成 tetramate。这一工作揭示了一种通过酶的方式首先生成 CX( X O 或 N)键，然后再生成 CC 键来构建 5 元杂环的生物合成途径。1. 5 金属催化剂
26、在活细胞及信号转导中的应用利用化学小分子在活体环境下实现生物大分子的高度特异调控是化学生物学领域的前沿热点问题之一。作为生物体内含量最多的一类生物大分子，蛋白质几乎参与了所有的生命活动，因此“在体”研究与调控其活性及生物功能意义重大。与发展较为成熟的蛋白质活性抑制剂及相应的“功能缺失性”研究相比，小分子激活剂对于研究蛋白质的结构与功能更为有效。这主要是因为后者可以在活细胞及活体动物、组织内实现“功能获得性”研究，从而为目标蛋白质在天然环境下的功能及其在生命活动中扮演的角色提供更准确和细致的信息。然而，通过小分子实现蛋白质的原位激活是一项极具挑战性的任务，目前大多数成功的例子都来源于大规模小分子
27、库筛选而获得的针对某一特殊蛋白质靶标的“别构剂”，而没有一种广泛适用于不同类型蛋白质的普适性小分子激活策略。陈鹏课题组通过将基于钯催化剂的“脱保护反应”与非天然氨基酸定点插入技术相结合，首次利用小分子钯催化剂激活了活细胞内的特定蛋白质15。该方法通过将一种带有化学保护基团的赖氨酸( 炔丙基碳酸酯-赖氨酸，Proc-赖氨酸) 以非天然氨基酸的形式定点取代目标蛋白质上关键活性位点的天然赖氨酸，使蛋白质的活性处于“关闭“状态。利用能够高效催化“脱保护反应”的钯化合物，他们在活细胞内实现了蛋白质侧链的原位脱保护反应( Proc-赖氨酸向天然赖氨酸的转化) ，使该蛋白质重新回到“开启”状态，实现“原位”
28、激活。这一策略的优势在于将非天然氨基酸直接插入了目标蛋白质酶的催化活性位点，使其处于完全“关闭”的状态; 而在激活过程中只要产生少量的处于“开启”状态的蛋白质就足以对其功能及相关生物学功能进行研究。利用这一技术，他们深入研究了一种细菌三型分泌系统的毒素效应蛋白 OspF( 磷酸丝氨酸裂解酶)对宿主细胞内的胞外信号调节激酶( Erk) 参与的信号转导通路的影响，并证明了该方法可作为普适性平台，为活细胞及活体内的生物大分子激活提供了新的策略和工具。2 基于蛋白质和多肽的研究李艳梅课题组长期致力于化学合成糖肽疫苗和免疫学研究，取得了一系列成果。现阶段化学合成疫苗的研究主要存在两大问题: 一是需要寻找
29、有效的特异性抗原，以区分正常组织和病变组织，二是需要寻找疫苗体系以打破免疫耐受，促进机体免疫反应。针对第 1 个问题，他们以 MUC1糖肽为骨架，合成了具有不同糖基化修饰的肿瘤相关糖肽抗原。以牛血清白蛋白为载体，筛选表位，并研究构效关系，发现 T9 位苏氨酸的糖基化修饰对糖肽的免疫原性具有至关重要的影响。针对第 2 个问题，他们对疫苗进行了结构优化，通过T 细胞表位、免疫刺激剂和自组装片段等策略提高免疫反应效果，设计合成了两组分疫苗、三组分疫苗以及自组装疫苗等一系列高效的疫苗，能够产生高强度的 IgG 抗体，同时可以通过疫苗分子调节体液免疫和细胞免疫。这些疫苗产生的抗体能够结合并通过补体依赖细
30、胞毒性作用杀死瘤细胞。该研究为进一步的疫苗研究打下了坚实的基础16，17。目前，治疗癌症的主要方法仍然是化疗法。利用能够特异性靶向癌细胞的药物可以减少药物的负效应，提高癌症患者的治愈率。不同类型的纳米载体，如脂质体类、多聚纳米颗粒、嵌段共聚物胶团和树枝状高分子，常用于抗癌药物的靶向性释放。为了更大地提高抗癌药物的特异性释放效率，多种方法被相继开发，例如，将叶酸配体引入纳米载体引导药物靶向癌细胞的特定部位，将对生理特性的环境敏感分子( 酸度敏感分子、温控分子以及特定酶响应分子) 引入纳米载体用于体内特定环境的释放。刘克良等18制备了外围为疏水性含有叶酸修饰的聚乙二醇( PEG) 而核心为超顺磁性
31、 Fe3O4的纳米药物载体，并展示了该组装体细胞内酸性环境定点释放 AD 药物的功能。非共价作用力是维持蛋白三维结构的重要因素，小型多肽因结构小和非共价相互作用位点少而难以形成稳定的三维空间结构。他们19 21利用多肽间相互作用催化分子间硫酯的胺解，制备了新型的共价偶联的 6HB 多肽分子，并在多种条件下展示均具有高的热稳定性。该策略为稳定多肽的三维结构提供了新的思路。化学方法能够实现原子水平精确控制蛋白质的序列和结构，是获取特定修饰的生物体系难以表达的蛋白质的一种重要手段。当前使用最为广泛的技术是以硫酯为合成子的自然化学连接反应。然而，多肽硫酯因其高度的热不稳定性和反应活性而不容易采用目前最
32、为广泛使用的 Fmoc固相合成技术合成。刘磊等22利用烯胺的水解反应，基于所提出的溶液中分子内从 N 到 S 不可逆酰基迁移制备硫酯的策略，以多肽酰胺为底物，实现了 Fmoc 固相合成硫酯。基于酰肼能够在弱酸性条件下被亚硝酸转化为酰基叠氮的特征，刘磊等发展了以多肽酰肼为结构单元的合成蛋白质的多肽酰肼连接技术23，结合保护基 Tbeoc 实现了全收敛酰肼连接制备蛋白质24，并结合非天然氨基 酸 嵌 入 技 术 发 展 出 蛋 白 质 半 合 成 的 新策略25。抑制病变蛋白 A 聚集及解聚已成为治疗阿尔茨海默症( AD) 的重要手段，受到人们的广泛关注。大多数报道的 A 抑制剂是有机小分子或肽。
33、然而，这些抑制剂或不能穿透血脑屏障( BBB) ，或缺乏与 A 的识别能力，应用受到限制。能够靶向结合 A，进而抑制 A 聚集的药物成为本领域目前研究的重点。利用自主设计细胞荧光筛选体系，结合化学、分子生物学、生物化学、生物物理和现代波谱学等手段，曲晓刚等发现一些特殊结构类型聚金属氧酸盐能够调控 AD 病变蛋白 A 的聚集，抑制效果与聚金属氧酸盐的结构、所带电荷数及体积密切相关。研究成果作为封 面 文 章 发 表 在 德 国Angew Chem IntEd 24并被CEN News作为亮点给予报道。此外，他们最新研究发现，具有锌指结构的 2 个三螺旋金属超分子化合物能够有效地抑制 A 聚集，并
34、已获得专利授权。进一步研究表明，这 2 个金属超分子化合物能够特定地结合在 / -不一致伸缩区域，抑制 A 的细胞毒性。体内研究表明，这些化合物可改善转基因小鼠模型的空间记忆障碍，并降低脑内不溶性 A 的水平。同时，该化合物还能解聚已经形成的 A 聚集体。这表明金属超分子化合物不仅可以预防早期 AD 的发生，还具有缓解 AD 的作用，并已获专利授权。这将为设计和筛选金属超分子化合物作为 A 抑制剂提供新的途径。工作作为封面文章发表在Chem Sci 27， 并 被 英 国 皇 家 化 学 会Chemistry World以“新超分子阿尔茨海默症药物( New supramolecular Al
35、zheimers drugs) ”26为题给予亮点报道。刘扬中等29开展了金属配合物抑制结核菌内的蛋白剪接功能的研究，发现结核菌内一些酶通过 Intein 的蛋白剪接被活化，抑制蛋白剪接将抑制结核菌的生长。高等生物不具有 Intein，因而Intein 是抗结核菌药物的理想靶点。通过体外蛋白剪接实验和细胞实验证实，顺铂在结核菌的作用靶点是 Intein 蛋白。王江云课题组30通过扩展基因密码子，实现了具有光点击活性的非天然氨基酸环丙烯赖氨酸在哺乳动物中的基因编码。光照条件下，特异位点整合了环丙烯赖氨酸的蛋白质与小分子四唑化合物发生环加成反应，生成荧光活性基团，从而实现了时空可控的对哺乳动物细胞
36、内蛋白特异位点的标记。此外，该课题组和陆艺课题组利用非天然氨基酸的定点插入，首次实现了用 18kD 的肌红蛋白模拟呼吸链中重要膜蛋白复合物细胞色素c 氧化酶。该工作首次提供了细胞色素 c 氧化酶中保守翻译后修饰 Tyr-His 功能的直接证据，是蛋白质设计领域的重要进展，并有望在生物能学中获得重要应用31。电子传递( ET) 涉及生物体内许多重要的生化过程，王江云课题组及龚为民课题组通过基因密码子扩展，实现在活细胞中编码螯合金属的非天然氨基酸 3-吡唑基酪氨酸，为研究生物大分子中的光致电子转移现象以及利用生物元件实现高效可控的光致电荷分离提供了有力的工具。这为蛋白动态构象变化研究提供了新的研究
37、手段，为利用合成生物学手段生产可再生能源提供了新的研究思路，为金属蛋白设计提供了新的工具。该项研究成果以内封面文章的形式发表于德国Angew Chem Int Ed 32。作为哺乳动物体内酸性最强的器官，胃所含的强酸性胃液( pH 为 1 3) 是人和动物抵御绝大多数微生物病菌的一道天然屏障。然而，肠道病原菌能够在强酸性的胃液下存活，并进而造成肠道感染。陈鹏等33通过在蛋白中定点嵌入含有光交联基团的非天然氨基酸系统地捕获了一种酸性分子伴侣蛋白在酸胁迫下的“客户蛋白”，并依此阐释了大肠杆菌抵御胃酸的机理，理解大肠杆菌的抗酸性机理将极大地加深我们对这类病原菌的认识，为今后发展新型抗生素奠定基础。结
38、果发表后CEN News作了专题报道。其后，他们进一步运用非天然氨基酸编码技术成功地在肠致病性大肠杆菌、志贺氏菌及沙门氏菌中实现了光交联及叠氮非天然氨基酸的定点嵌入，为病原菌侵入宿主细胞的机理研究打下基础34。此外，他们结合在蛋白中定点嵌入末端为烯烃的非天然氨基酸及 Thiol-ene 反应，实现了药用蛋白质定点的标记及 PEG 化修饰，为药用蛋白的化学改性提供了新途径35。3 糖化学生物学的进展寡糖化合物的合成是制约糖科学发展的瓶颈之一。叶新山等利用“糖基供体预活化”策略，将添加剂控制的立体选择性糖基化方法应用于葡萄糖和半乳糖硫苷供体的糖基化反应中，实现了路易斯酸控制的高 -立体选择性糖基化
39、反应36;并将该策略成功应用于伤寒 Vi 抗原寡糖重复片段的合成37。俞飚等对一价金催化的以糖基邻炔基苯甲酸酯为供体的糖基化方法的机理38进行 了 深 入 研 究，并 进 一 步 用 于 药 用 分 子Digitoxin39和皂苷类化合物40的合成; 他们还首次实现了结构复杂的含脱氧糖单元的抗生素Landomycin A 的合成41。发展糖化学生物学研究的新方法至关重要。陈兴课题组42报道了一种具有细胞靶向性的非天然糖代谢标记新方法。他们将非天然糖包裹在靶向性脂质体内，并通过受体介导的细胞内吞，将非天然糖传输到特定的细胞内，进入细胞的非天然糖通过糖代谢途径修饰于细胞表面聚糖上，最后可通过生物正
40、交反应进行成像和检测。张延等43建立了一种从复杂生物样品中分离富集糖基化蛋白的新方法，开发了一种具有选择性富集叠氮标记 O-糖基化多肽及蛋白的炔基修饰纳米磁珠，通过炔基与叠氮基团之间的点击反应富集带有叠氮标记的糖蛋白，通过 DTT 及 TCEP 等的还原作用将磁珠结构上的二硫键切断，从而将富集的糖蛋白从磁珠上解离，再通过 SDS-PAGE、LC-MS 等技术对这些糖基化蛋白进行鉴定。王鹏课题组与美国西北大学 Mrksich 教授合作44，发展了一种糖基转移酶快速鉴定的新方法。该方法结合了高通量基因克隆技术、无细胞蛋白表达技术、自组装单层糖芯片技术以及在线质谱分析技术，将 7 种糖基供体与近 1
41、00 种细胞外表达的糖基转移酶分别放到含有 23 种不同糖基受体的芯片上进行反应，反应后冲洗糖芯片并使用全自动的在线质谱检测系统分析结果，超过 3 万个的反应可在几天内完成。糖类化合物在药学上的用途一直吸引着研究者的兴趣。叶新山等45对肿瘤相关天然糖抗原STn 进行结构修饰，发现某些经适当修饰后的抗原具有更高的免疫原性，所产生的抗体能识别天然抗原，并且与表达 STn 抗原的肿瘤细胞相作用，从而为抗肿瘤糖疫苗的研究提供了新的路径。他们46还设计合成了几种 N-烷基二脱氧氮杂糖化合物，这些氮杂糖化合物能够抑制 Con A 诱导的小鼠脾 T 淋巴细胞的增殖; 进一步研究表明，这种抑制效应源于它们对细
42、胞因子 IFN- 和 IL-4分泌的抑制; 然后进行了动物水平的皮肤移植实验，结果显示这些氮杂糖类化合物能够延长小鼠皮肤移植后皮片的存活时间。这些结果为新型免疫抑制剂的研制提供了希望。4 核酸化学生物学的进展随着化学、生物学和医学研究的发展和融合，现在发现大量重大疾病，如恶性肿瘤、遗传疾病等，都与核酸相关。核酸不仅是遗传基因信息的载体，同时基因信息调控的正确与否与生命体的正常生理功能和健康与疾病有密切的联系。而且，机体受各因素影响发生基因变异到形态学或生理功能发生病变，是一个多阶段的改变累积过程。端粒 DNA 和端粒酶与人的寿命和癌症等疾病密切相关，已成为癌症治疗的特殊靶标。曲晓刚等47发现，
43、碳纳米管可以通过稳定人端粒 i-motif 结构来抑制端粒酶的活性，此实验结果第一次证实单壁碳纳米管( SWNT) 干扰端粒功能。这为 SWNT 的生物医学效应和 i-motif DNA 的生物学重要性提供了新的认识。周翔等48发现 G-四链体能够诱导 DNA 链间的交换，这种高度选择性的链交换反应揭示了基因重组和 DNA 修复的一种全新机制。谭铮等49鉴定得到了一个端粒DNA 结合蛋白，该蛋白能够与端粒、端粒酶相互作用，提高端粒酶延伸端粒 DNA 的催化活性和进行性。在 DNA 甲基化方面，周翔等50设计了系列卤代铵盐衍生物，可以高选择性识别 DNA 链中的 5-甲基胞嘧啶，这种精确的识别还
44、可以区分 5-甲基胞嘧啶和 5-羟甲基、5-醛基胞嘧啶，有望融合下一代测序方法为表观遗传学的研究提供了有力的工具和新的突破。任劲松等51首次将适体DNA 同时用作介孔硅封盖试剂和癌细胞靶向试剂，结合化学疗法、光热疗法和成像于一体系，用于癌症诊断和治疗，该工作作为封面文章发表在Adv Mater 上。他们52还通过纳米金可视化的方法对微量端粒酶活性进行快速检测。这些针对 miNA、端粒酶、循环肿瘤细胞的研究对于目前癌症的快速诊断和早期预警提供了技术支撑。NA 干扰近年来一直被认为可用于新一代生物制药技术，各国政府及制药巨头投入巨大，但小核酸生物制药一直受到核酸稳定性、脱靶效应及给药性差等因素制约
45、。梁子才、席真等53通过深入研究小核酸在人血清中的稳定性，发现血清中 Nase A 具有双链 NA 限制性内切酶性质，是造成小核酸血清不稳定性的主要因素，并发现对双链 siNA 中热切位点的单碱基修饰可以极大提高小核酸血清稳定性。他们进一步发现，利用普适性碱基对双链 siNA 进行单点突变，可以极大提高 NA 干扰中双链 siNA 的链选择性，降低siNA 的脱靶效应54。通过研究 siNA 的体内不对称性选择机制而设计合成的超高效 siNA可以达到 pmol/L 级的 NA 干扰活性55。5 分析方法和手段的进展徐涛和徐平勇等在超高分辨率成像领域取得重要研究成果。近期发展的超高分辨率成像技术
46、( F) PALM/STOM 能够在纳米尺度展示生物分子的精确定位，是蛋白质研究和荧光成像领域的研究热点和发展趋势。然而，现有的荧光蛋白限制了当前( F) PALM/STOM 等超高分辨成像技术的发展和广泛应用。为了进一步完善和优化现有的超高分辨成像方法，发展具有普适性和颜色多样的新型光激活荧光蛋白( PAFPs) 至关重要。但是与传统的光不敏感荧光蛋白( 比如 GFP，FP) 领域相比较，可逆光转化荧光蛋白 SFP 的发展较为滞后，品种较少。他们通过一种光转化荧光蛋白 mEos2 的随机突变，获得了一系列具有光开关功能的绿色荧光蛋白，改善了现阶段光开关荧光蛋白( SFP) 发展滞后、品种单一
47、的问题。其中的 mGeos-M 因其具有十分优异的单分子特性，有望成为替代 Dronpa 的新一代超高分辨率显微成像分子探针56。此外，为了解决膜蛋白的标记问题，同时发展综合性质更佳的荧光蛋白探针，他们57通过晶体结构解析和定点突变，获得了 2个真正单体荧光蛋白: mEos3. 1 和 mEos3. 2。进一步的研究显示，mEos3 具有成熟时间短、亮度高的特性。用于单分子定位时具有很高的标记密度和光子产出，在超高分辨成像中比当前所有PAFPs 都表现出色。杨弋等58发明了一种简单实用的光调控基因表达系统，将可以广泛应用于基础研究领域，并可能用于光动力治疗，这是我国科学家在合成生物学与光遗传学
48、前沿领域获得重要突破。通过合成生物学的方法，他们成功开发出一种简单、稳定、容易使用的光调控基因表达系统。该系统称为 LightOn 系统，由 1 个光调控的转录因子和含有目的基因的转录单元构成。在蓝光存在的情况下，转录因子能够迅速被激活，从而启动目的基因的转录与表达。利用该系统在小鼠活体内进行实验，他们成功实现了红色荧光蛋白在小鼠肝脏的指定区域的光控表达。此外，他们课题组59还开发了一系列检测 NADH 的遗传编码荧光探针。方晓红、郭雪峰等60利用具有 G4 构象的DNA 适配体分子构建了功能化的单分子器件，实现了对凝血酶的高选择性的可逆检测，最低检测浓度可达 2. 6amol/L( 88ag/mL) 。与微流控技术相结合，进一步实现了对单个生物结合过程的在线检测，从而发展了一种高特异性、高灵敏度的在线生物检测的可行性技术。该方法也提供了单个蛋白质分子检测的新思路。颜晓梅等61通过对噬菌体进行基因改造，构建了双砷染料-四半胱氨酸重组噬菌体体