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1、-分子标记在番茄抗性育种研究进展-第 13 页分子标记在番茄抗性育种中研究进展摘要：本文综述了近年来RFLP RAPD SSA AFLP CAPS和SNP分子标记技术在番茄抗性育种上的应用，分析了目前的研究进展，对今后研究的重点进行了讨论。关键词：分子标记；番茄；抗性；进展。Molecular marker in tomato resistance breeding research progress inAbstract: This paper reviewed recent RFLP RAPD SSA AFLP CAPS and SNP in the application of toma
2、to resistance breeding, analysis of the current research progress, the focus of the future research are discussed.Key words: Molecular markers; tomato; resistance; progress.番茄既是蔬菜也是水果, 其中含有丰富的维生素C对心血管有良好的保护作用；番茄红素具有良好的抗氧化作用,能清除体内废物,增加免疫力。它也是营养师大力提倡的减肥食品。它早已成为人们日常生活中的不可缺少的食物。随着遗传学的发展,遗传标记的种类和数量也在不断增加
3、。形态标记、细胞学标记、生化标记都是以基因表达的结果(表现型)为基础,是对基因的间接反映;而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映。与表型标记相比,DNA分子标记具有能对各发育时期的个体、组织、器官甚至细胞作检测,既不受环境的影响,也不受基因表达与否的限制;数量丰富;遗传稳定;对生物体的影响表现“中性”以及操作简便等特点。分子标记的所有这些特性,奠定了它具有广泛应用性的基础。本文在介绍一些常用的DNA分子标记技术基础上,综述分子标记应用于番茄遗传育种研究的新进展,并就我国今后番茄分子育种主要研究方向进行讨论。1 分子标记的介绍分子标记的概念:广义的分子标记是指可遗传的并可检测的DNA序
4、列或蛋白质。狭义分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段。在番茄遗传育种研究工作中使用的DNA分子标记主要涉及基于Southern杂交的限制性片段长度多态性标记( RFLP)、基于PCR技术的DNA扩增方法的随机扩增多态性DNA标记( RAPD),简单重复序列标记(SSR)、以及基于PCR与酶切相结合的扩增片段长度多态性标记(AFLP)、切割扩增的多态性序列标记(CAPS)和单核苷酸多态性(SNP) 等。2.分子标记基本原理RFLP(限制性片段长度多态性, restriction fragment length polymorphism,简称RFLP)基本原理是:植
5、物基因组DNA经限制性内切酶酶切后,通过电泳将大小不同的酶切片段按照各自的长度分离,通过Southern吸印与标记的探针杂交,放射自显影检测酶切片段的多态性,此方法稳定可靠。RAPD(随机扩增的DNA多态性，random amplified polymorphic DNA,简称RAPD)是以基因组总DNA为模板,利用随机引物对模板进行PCR扩增得到多态性DNA片段,然后通过电泳检测片段的多态性,以此来诊断生物体内在基因排布与外在性状表现规律的技术。它基于PCR,无需预先知道DNA序列信息。简单重复序列(simple sequence repeats,简称SSR)又叫微卫DNA( microsa
6、tellite DNA)。所谓微卫星是由2 6bp的重复单位串联而成,一个微卫星长度一般小于100bp,不同品种或个体核心序列的重复次数不同,但重复序列两端序列多是保守的单拷贝序列,通过PCR扩增其间的核心微卫星DNA序列,利用电泳分析不同基因型个体在每个SSR位点上的多态性。AFLP (扩增片段长度多态性，amplified fragments length polymorphism,简称AFLP)原理是把限制性酶切片段通过PCR反应进行扩增,再把扩增好的酶切片段通过聚丙烯酰胺凝胶等高分辨率的分析胶电泳,最后检出片段的多态性。切割扩增的多态性序列标记(cleaved amplified po
7、lymorphic sequence,简称CAPS)技术利用PCR对RFLP标记进行了转化, CAPS技术与AFLP技术相反,它是在先获得某个位点特异扩增产物的基础上,再将该扩增产物进行酶切,电泳检测酶切片段的多态性。单核苷酸多态性(SNP)技术检测的是单核苷酸的差异。主要是指由基因组核苷酸水平上的变异引起的DNA序列多态性,包括单碱基的转换、颠倒、插入和缺失等。SNP在基因组内可以人为地划分为2种形式:基因编码区的功能性突变,主要分布于基因编码区(coding region) ,故又称为CSNP；遍布于基因组的大量单碱基变异。与以前的一些遗传学标记相比较,SNP具有位点丰富、检验成本低、检出
8、率高等优点。同一位点的不同等位基因之间常常只有一个或几个核苷酸的差异，因此在分子水平上对单个核苷酸的差异进行检测是很有意义的。3.番茄分子标记在抗性育种中研究进展 番茄分子标记在番茄抗性育种，耐冷性育种，耐盐性育种，抗病虫害育种，抗病性育种(主要包括晚疫病，烟草花叶病毒，青枯病，斑萎病)等方面的应用十分广泛，研究也日趋深入。在番茄耐冷性育种中的研究番茄是喜温植物，温度低于10时生长发育就受到阻碍，8时生长量增加迟缓，5时生长完全停止，有些品种还会表现出明显的冷害症状。黄锡志等人利用RFLP分子标记构建了番茄的基因连锁图，把2个抗冷性基因和3个番茄种子发芽期抗冷性相关的基因在基因连锁图上进行了明
9、确的定位1。赵福宽等人以番茄耐冷性基因系为试材，从耐冷及冷敏感植株中提取DNA构建耐冷DNA池及冷敏感DNA池，采用RAPD分子标记技术，从280 个随机引物中筛选出一个在两池间具有多态性的引物OPF14，用轮回亲本及回交后代的单株DNA进行验证，证明了该引物扩增出的特异性片段是一个与番茄耐冷性相连锁的RAPD标记。从琼脂糖凝胶回收OPF14扩增出的多态性条带与载体pGEMR_T_Eas 连接，并转入大肠杆菌DH5_，对克隆片段测序表明实际大小为792bp，这为转化成稳定的SCAR标记奠定了基础。研究从DNA分子水平上了解耐冷性状的差异，筛选与番茄耐冷性相关的RAPD分子标记，为番茄耐冷育种提
10、高选择效率奠定基础2。在番茄耐盐性育种中的研究中国的北方地区土壤都是盐碱地，对番茄的生长和产量有着很大程度的影响，研究人员对番茄进行耐盐性试验，以期加速作物耐盐育种进程，提高番茄的产量。Saranga等人通过分子标记方法得出来自耐盐的L.pennellii LA716 F2群体的总产量和总干物质含量在盐胁迫下的遗传力为，试验结果表明可以通过后代选择获得耐盐新材料。大大的提高了选出耐盐品种的育种速度3。Monforte等人通过分子标记技术在L.esculentum E9和L.cheesmanii L2的F2群体中鉴定出了一个数量性状位点，这个数量性状位点在盐的胁迫下能够对番茄的早熟性起主要影响作
11、用，解释表型变异的35.6%，这个数量性状位点在非胁迫下的效应明显减小，说明该数量性状位点在盐胁迫下控制早熟性，也发现其它微效数量性状位点和上位互作效应存在4。33在番茄抗病性育种中的研究3.3.1. 抗白粉病育种中的研究Huang等人将易感品种Mongker 和抗病品种L.hirsutum G1.1560 杂交后的得到的F代、F3代材料进行PAPD分析，把Ol-1基因定位在RFLP标记TG153和TG164之间。试验还找到了与抗番茄白粉病基因紧密连锁的5个均为共显性RAPD标记，并转化为SCAR01、SCAR10、SCAE16、SCAR11和SCAR16的SCAR标记，这有利于该基因的克隆以
12、及番茄抗白粉病分子标记辅助选择系统的建立，这个结果使得需要5至9次回交的传统育种方式完成的工作，只需23次即可完成，大大缩短了育种时间5。卫丽等人对由显性核基因(RL-4)控制的番茄野生种L.peruvianum 抗白粉病抗性进行了分子标记研究。通过采用F2代群分法，在F2代抗、感池间随机筛选了256对引物，找到了与番茄抗白粉病基因RL-4连锁的6个AFLP标记, 遗传距离分别为，6.6 和6。3.3.2.抗叶霉病育种中的研究Thomas等利用AFLP技术在L.esculentum(Cf-9)和L.pennellii 的F2世代中筛选出了近42 000个AFLP座位，试验获得了3个与Cf-9共
13、分离的AFLP标记(M1、M2、M3)，集中于Cf-9 基因两侧。对含有Cf-9基因克隆的质粒再用AFLP标记进行分析，得知M1和M2分别位于Cf-9基因的两侧，相距间隔为。Jones等人通过这3个标记为起点，通过转座子示踪子技术将Cf-9基因克隆7。于拴仓等人以9个含不同叶霉病抗病基因的番茄品种为试材，通过接种鉴定表明，Cf-5、Cf-9、Cf-11和Cf-19基因对中国目前的2个叶霉菌优势生理小种均具有较强的抗性。根据Cf-9基因设计引物，扩增Cf-9基因的片段，含Cf-9、Cf-11和Cf-19基因的3种番茄均获得了的扩增片段。但用限制性内切酶Taq对PCR产物酶切可以将3 种材料明显区
14、分开来，Cf-9 的2个差异酶切片段为1170和460bp；Cf-11的2个差异酶切片段为1100和410bp；Cf-19的2个差异酶切片段为1210和300bp，从而建立了3个基因的分子标记。在F2分离群体中验证表明，3个基因的分子标记鉴定结果与抗性接种鉴定结果是一致的，用这些标记可以进行分子标记辅助选择8。3.3.3.抗晚疫病育种中的研究番茄的抗晚疫病是番茄生长过程中容易感染的一种病，由两类不同的基因控制：一种受单显性Ph因控制；另受多基因控制，与多种因素有关，属数量性状。已在野生番茄中发现2个Ph基因(Ph1和Ph2)。Chunwongse等人利用感病品种CLN657(susceptib
15、le)和抗病品种L3708(resistant)杂交的F2群体对基因Ph-3进行标记，找到1个RFLP标记TG591(LOD=18.41)和2个AFLP，该基因与Ph和Ph-2为非等位基因9。Moreau等人利用Hawaii7996和WVa700杂交的F2代群体，把基因定位在标记CP105和TG233的的范围内(第10条染色体的长臂上)，并利用BSA群体找到了与Ph-2连锁的AFLP标记。从而构建了Ph-2区域的高密度图谱，为该基因的图谱克隆奠定了基础10。3.3.4.抗烟草花叶病毒病育种中的研究番茄烟草花叶病毒病是番茄发生普遍的，危害严重的病害，在番茄中目前已鉴定出了3个显性抗病基因Tm-1
16、、Tm-2和Tm-22(或Tm-2a)。Pillen等人利用2112个回交群体，对Tm-2a区域高分辨率遗传图谱进行了构建，在周围约的范围内定位了13个RFLP标记和RAPD标记，其中10个标记集中在的窄小范围内，而离Tm-2a最近的两侧标记仅相距。有一个RFLP标记(R12)与Tm-2a呈共分离现象。利用Tm-2两侧遗传距离为1cM的RFLP标记，只用两代就可以获得导入片段仅为2cM的含Tm-2基因的植株，而用常规方法至少需要100代才能得到同样的结果11。Dax等人利用两个近等基因系Tom-1S和Tom-1R，找到了两个共显性的RAPD标记，长度分别为450bp和500bp，并将其转化为稳
17、定的SCAR标记，来鉴定分离群体的杂和性和纯和性，这为育种工作提供了一种方便、快速的方法。2000年田苗英等人运用RAPD技术和BSA法，找到了一个与Tm-2基因连锁的分子标记OPD201700()12。3.3.5.抗青枯病育种中的研究番茄青枯病(Ralstonia solnacearum) 是一种发生普遍、危害严重的土传性病害,其病原细菌可在土壤中存活多年，是热带、亚热带地区番茄生产上的重要病害。迄今为止尚未找到防止此病的有效药物，因此进行抗病育种是防治该病的最有效手段。Thoquet等人利用Hawaii7996和WVa700杂交的3500株F3群体和已有的RFLP标记，利用不同的数量性状位
18、点模型，发现了2个QRL主要分布在第6条染色体上，为番茄抗青枯病育种提供了方向13。寿森炎等人用番茄高抗青枯病品种“T51A”与高感青枯病品种“T9230”配制杂交组合，接种鉴定其正反交F1代及F2代分离群体的青枯病发生情况。结果表明，T51A对青枯病的抗性属于细胞质遗传，受1 对杂合基因加性控制。用64个EcoR/Mse引物组合对“T51A”、“T9230”2个亲本及其F2代抗病和感病基因池进行AFLP分析，共扩增出约4 200条可分辨的带，其中2条为稳定的差异。用“T51A”和“T9230”杂交产生的F2代分离群体对2个特异条带与目的基因的遗传连锁性进行分析，发现特异条带AAG/CAT与暂
19、定名为RRS-342的抗青枯病基因紧密连锁，二者之间的遗传距离为。将AAG/CAT片段回收、克隆和测序，成功地将其转化为SCAR标记，可以更加方便地用于对番茄青枯病基因的标记辅助选择14。3.6.抗斑萎病育种中的研究番茄斑萎病(Tomatospotted wilt virus)是一种严重的番茄病害之一，通常引起番茄的茎和叶片的发育不良、坏死，造成植株死亡。而由野生番茄转移到栽培番茄中的Sw-5基因对番茄斑萎病具有明显的抗性。Chague等人通过用BSA法和RAPD技术筛选与Sw-5连锁标记，找到了9 个与Sw-5连锁的标记, 其中标记R1和R2分别位与Sw-5两侧的范围内，与Sw-5的距离均为
20、，并认为这2个标记都是因种间杂交随同Sw-5进入的。他们还把其中的R2改造成稳定的SCAR 标记15。根结线虫(Meloidogynespp.)是番茄重要病害之一，随着保护地蔬菜面积的增加，特别是日光温室的大面积推广，导致根结线虫危害日趋严重，目前生产上防治根结线虫的方法虽然很多，但防治效果不理想，不能从根本上解决问题，而培育抗病品种，是经济有效的办法。Klein-Lankhorst等人利用83M7133和83M7138近等基因系(只在Mi 和Asp-1位点有差异的群体)，找到了2个RFLP标记(GP79和H6A202)和3个RAPD标记。均与番茄根结线虫基因紧密连锁，并且利用GP79标记能鉴
21、定具有抗根结线虫性状的番茄植株的杂合性和纯合性，从而为育种工作提供了方便16。王孝宣等人将Multiplex-PCR和CAPS的优点结合起来建立了Multiplex-CAPS技术。这种技术能同时检测2个、3个或多个CAPS标记的多态性，其效果等同于每个CAPS标记的多态性的叠加，重复性好，分析效率高，降低成本数倍17。李红双等人研究应用RAPD技术，筛选到一个与番茄抗根结线虫病基因连锁的RAPD标记，并将该标记成功地转化成了SCAR标记，为应用分子标记辅助育种及为进一步克隆该抗病基因打下基础18。 分子标记是随着生物技术迅速发展的日趋完善，建立在分子水平上的，不受环境因素影响的技术。分子标记技
22、术现今已经广泛用于各种试验研究中。分子标记辅助选择技术在番茄抗病虫育种中得到了越来越广泛的作用。据统计,目前，已找到了与20余个抗病虫基因连锁的分子标记。分子标记技术还被用于番茄抗病基因的分离。据统计, 目前已分离的番茄抗病基因已达9个, 其中包括抗细菌性斑点病的Pto基因和Prf基因, 抗枯萎病的I22基因和I22C基因, 抗叶霉病的Cf22基因、Cf24基因、Cf24A基因、Cf25基因和Cf29基因, 这些研究对于探讨抗病基因的作用机理和提高番茄的抗病性具有十分重要的意义。5. 存在的问题与前景以上是近年来人们在番茄分子方面的研究，这些可以让研究人员对番茄分子标记方面的进展有了一定程度上
23、的了解，研究人员对番茄抗虫性和抗病性方面的研究比较多，成果也很普遍，但是在耐寒性，耐盐碱，耐热方面的研究还是比较少，这就要求科研人员的试验不但要把重点集中到抗病虫害方面，还要集中到耐寒抗耐盐碱方面。当然，分子标记技术必须依附于常规育种，因此，将分子标记选择应用于常规育种计划，对番茄的生产，具有长远的意义。参 考 文 献：1 黄锡志,寿森炎,廖乾生.转基因番茄研究进展.北方园艺，2011， 3:29-31.2 RAPD分子标记的筛选及特异片段的克隆.中央民族大学学报(自然科学版,2004,13(1):70-74.3 Saranga Y.Cahaner A.,Zamir D.1992,84(3-4
24、):390-396.4 Monforte A.J.Asins M J, and Carbonell E.A. Salt tolerance in Lycopersicon species, IV.Efficiency of marker-as-sisted selection for salt toler-ance improvement. Theor.Appl Genet,1996,93 (5/6):765-772.5 , et al. Development of diagnostic PCR markers closely linked to the tomato powdery mil
25、dew resistance gene Ol-1 on chromosome of tomato.TAG, 2000,101:918-924.6 AFLP标记.河南农业大学学报，2005，（6）：188-189.7 种2004，(3):313-320.8 于拴仓,柴敏,姜立纲.番茄叶霉病高抗基因Cf-9、Cf-11和Cf-19的分子标记.植物病理学报,2005,(3):286-288.9 Chunwongse J,Chunwongse C,Black L,et al. Molecular mapping of thePh- 3 gene for late Biotechnology,2002,
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28、lant Microbe Interact,1996,9:826-836.14 AFLP分子标记遗传2006（2）:195-199.15 Chague V, Mercier J.C, Guenard M, et al, Identification and mapping on chromo-some 9 of RAPD markers linked to Sw-5 in tomato by bulked segregant analysis. TAG,1996,92:1045-1051.16 , Vermunt A., Weide R., et al. Isolation of molecular markers for tomato (L.esculentum) using random amplified poly-morphic DNA (RAPD).TAG,1991,83(1): 17 王孝宣,杜永臣,朱德蔚,等.Multiplex-CAPS技术及其在番茄遗传鉴定中的应用.园艺学报,2003,30(6):673-677.18 RAPD报. 2006,36(2):185-188.分子标记在番茄抗性育种中研究进展综述报告院 系：园艺林学学院姓 名：张 涛学 号：