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1、-1.2.3.4. 分子与合成生物学知识点总结-第 9 页5. (生命的起源)三界的分类：古细菌、细菌、真核生物6. 小分子：氨基酸、糖类、核苷酸 77%7. 大分子：核酸、蛋白质、脂质 23%8. 古细菌更类似于真核细胞，原核细菌是真正的细菌9. 合成生物学的定义：设计和构建自然界中没有发现的生物功能和生物系统。构造生物零件装置和能量，药物以及科技系统中应用工程原则和数学模型。组装各领域专业知识的研究领域为了理解，构建，修饰生物系统。合成生物学的目标：操纵基因元件，将基础生物分子整合到基因线路上，来创造新性状，表达复杂的生物功能。从稳定、标准、已经改良好的基因模块来构建生物体系。合成生物学的
2、目的：改造系统、系统化构建.合成生物学与其他学科的不同：抽象性、模块性、标准化、设计和模型10. 根据进化树，古细菌和真核生物都来自细菌。11. 生物膜的作用：隔离、储存能量、物质传递、信号传导、阻断毒性12. 内共生学说：古细菌的真核细胞吞噬异样细菌，成为它的线粒体。 吞噬自养细菌，成为它的叶绿体。13. 基因的概念：基因是生物有机体遗传的分子单元 基因在染色体上 是有机体中可以编码多肽和RNA的DNA序列14. DNA的结构和功能： 遗传信息在DNA链的核苷酸序列中 遗传信息指导合成蛋白质 基因两条链碱基配对以氢键链接 一条链模板、半保留复制5-3、3端游离羟基、糖在外，碱基在内15. 染
3、色体结构与基因表达： 染色质的基本组成单位是核小体 核小体是组蛋白八聚体2H2A 2H2B 2H3 2H4 H1与核小体间DNA链接 染色质改造：连接DNA长度可变，结合DNA结构可变12.三个重要的DNA序列：端粒、复制起始区、着丝点13.核小体的N端修饰（共价修饰）： DNA甲基化和组蛋白去乙酰化协同作用共同参与转录阻遏。 磷酸化使生物学过程发生15.第三章总结：间期染色质解旋很难看见 基因表达loop结构处 常染色质结构疏松表达活跃，能编码蛋白质。 异染色质粘稠不编码。如端粒、中心粒、着丝粒 有丝分裂染色体是压缩的，有序的，染色体在细胞核中的存放时空间有序的16. 分子机器：调节DNA的
4、蛋白质 DNA：连接酶、解旋酶（95）、拓扑异构酶 钳蛋白、结合蛋白 RNA：引物、引物酶 停转的DNA聚合酶使其从钳蛋白中释放（需要DNA双螺旋的高度旋转）DNA复制过程; 拓扑异构酶解开双螺旋-DNA解旋酶解开双链-SSB结合单链-RNA引物酶结合DNA单链-DNA钳蛋白将DNA聚合酶结合上去-按碱基互补配对原则5-3-先导链连续，滞后链需要DNA连接酶-DNA双螺旋再次形成（两个复制叉）17. 三步提高DNA的高保真性：5-3的聚合、3-5的核酸外切酶校正的核酸外切酶或性 碱基互补配对机制 真核生物错配修复 原核位点特异性错配修复。原核母联甲基化 18. DNA重组：两个同源DNA发生重
5、组，序列上没有变化，来源上相互交叉。 同源DNA交叉互换可能发生在任意位置 减数分裂时期一般DNA重组 一般的DNA重组：起始：DNA杂交 大片段染色体交换，双螺旋解开，在细菌中需要RecA的 介导，中间形成holiday junction结构REC A蛋白介导DNA重组,也是一种DNA依赖的ATP酶 要有一条链有裂口，在细菌中靠介导蛋白，在原核中同源染色 位点特异性重组： 转座型 依赖于转座酶基因和DNA序列上的识别位点 保守位点特异性重组 不对等交换 例如噬菌体将DNA整合到宿主细胞内 保守序列型： 一种顺序型重组 19. 特殊的DNA序列： 原核系统：操纵子：结构基因、操作子（与结构基因
6、相连的DNA序列，阻遏蛋白可以结合组织结构基因的转录）、启动子、其他调控序列。富含A-T 便于打开。TATA保守序列，-35、-10. 真核系统：由顺式作用元件调控20. 基因调控：顺式作用元件(DNA) 包含共有序列，模块相关但是不相同，没有固定位子，大致在起始点200bp上游，一个单一元件就可以引起调控应答，也可位于启动子或增强子。控制转录的准确性和频率例：增强子、沉默子 反式作用元件（蛋白质）与顺式作用元件结合调控基因表达三个功能域：包括DNA结合域（螺旋转角螺旋、锌指结构、亮氨酸拉链、同源域、螺旋-环-螺旋）、转录活性域、蛋白质-蛋白质作用域。RNA聚合酶的亚基与RNA聚合酶结合使复合
7、物更稳定，与启动子在特定序列结合，有转录起始复合物时结合部分启动子，促进基因表达。DNA与蛋白质非共价键结合蛋白质与蛋白质的结合优于DNA蛋白质可以形成同质、异质二聚体，蛋白质与蛋白质的结合在真核原核中都有转录水平原核生物基因调控系统(多顺反子-操纵子系统)（1） 主要用于负调控，诱导物将阻遏蛋白移除。（2） 其他调控序列-启动子（RNA聚合酶）-操作子（阻遏蛋白）-结构基因（3） 蛋白质-蛋白质（4） 蛋白质-基因（5） 边转录边翻译，没有转录后修饰 真核生物基因调控系统（单顺反子）（1） 单顺反子，正调控（2） RNA聚合酶：起始转录，延长RNA,终止RNA（3） 顺式作用元件：启动子，T
8、ATA框起始转录，有TFD（转录因子）结合位点 增强子，沉默子（4） 转录因子可分为转录激活子和转录抑制子 转录后水平 （1）外显子，内含子的拼接可能不同 （2）存在正调控：有激活蛋白，无阻遏蛋白 负调控：有阻遏蛋白，无激活蛋白 （3）RNA编辑（在不同位点插入尿嘧啶改变编码序列） -核内向外运输-RNA在细胞内定位-开始翻译 翻译水平：延长因子EF，起始因子，释放因子 AUG甲硫氨酸起始 翻译水平： 3含有定位信号影响翻译水平 mRNA内部有核糖体进入位点 真核：5端帽子，介导核糖体的结合 原核、病毒：折叠成类似于tRNA的结构，介导核糖体与其结合mRNA衰退：5端去帽子降解，使3端有规律降
9、解 内切核苷酸降解和快速去帽子降解 翻译和降解存在竞争 降解：反义/干扰RNA翻译后调控：对合成蛋白质的修饰分子伴侣：帮助蛋白质折叠（序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，帮助其他含多肽的结构正确组装，之后脱离。） 折叠正确可容，或在分子伴侣的帮助下正确折叠 折叠不完全被蛋白酶体催化降解（泛素激活酶、泛素连接酶。泛素：标记无用的蛋白质从而降解）真核总结：转录水平调控-对RNA的修饰-RNA的转运和定位调控-翻译调控-mRNA降解-蛋白质激活产生蛋白质不同水平的调节： 转录、转录后、翻译、翻译后 乳糖操纵子;有乳糖无葡萄糖表达，弱启动子有基础水平表达调节基因-CAP结合位点-启动子-操纵基因-结
10、构基因（1） 有葡萄糖无乳糖：调节基因表达出阻遏蛋白，与操纵基因结合阻止了与启动子结合的RNA聚合酶的移动，大肠杆菌不能利用乳糖。（2） 没有葡萄糖，有乳糖时：乳糖作为诱导物，与阻遏蛋白结合，使其结构发生改变不能与操纵基因结合，操纵基因开启，可以利用乳糖。（乳糖操纵子的启动子是弱启动子。）（3） 葡萄糖存在且浓度很高时：cAMP水平低，与CAP结合受阻RNA聚合酶不能与启动子结合。（4） 葡萄糖不存在：cAMP水平高，与CAP结合，复合物结合到启动子上游的结合为点，促进RNA聚合酶与启动子的结合。 色氨酸操纵子：（负调控）调节基因-启动子-操纵基因-5个相连的结构基因（1） 不含有色氨酸;调节
11、基因产生没有活性的阻遏蛋白不能与操纵基因结合，结构基因表达，生成合成色氨酸的5种酶。（2） 有时：色氨酸作为辅阻遏物与阻遏蛋白结合，阻遏蛋白有活性，与操纵基因结合，结构基因不表达。 细菌具有双组份信号传导系统。组氨酸激酶（感受结构域、接收结构域、输出结构域）真核生物基因调控系统(单顺反子)内含子、外显子（断裂基因）真核基因表达调控：（1） 转录控制（2） RNA生成mRNA控制（3） RNA转运定位控制（4） 翻译控制（5） mRNA降解控制（6） 蛋白质活性控制染色体结构的复杂性一般是正调控，有转录后修饰转录与翻译分开调控，DNA有高敏位点，通过细胞间和细胞内信号调控。21. DNA与蛋白质
12、的相互作用; （1）螺旋转角螺旋、锌指结构、亮氨酸拉链、同源域、螺旋-环-螺旋 （2）二聚体作用22. tRNA的3端链接氨基酸，5端可变性较大，反密码环携带反密码子23. 分子伴侣：帮助蛋白质折叠（序列上没有相关性但有共同功能的蛋白质，帮助其他含多肽的结构正确组装，之后脱离。） 折叠正确可容，或在分子伴侣的帮助下正确折叠 折叠不完全被蛋白酶体催化降解（泛素激活酶、泛素连接酶。泛素：标记无用的蛋白质从而降解）24. 不同水平的蛋白质合成调控;转录水平： （1）有时与距离有关，可以远距离调控（开关调控、量调控） （2）基因调控蛋白帮助招募组装转录机器 （3）调控有协同效应 （4） 阻遏蛋白实现功
13、能：竞争活性位点、屏蔽、与转录因子作用、招募抑制染色质重组复合物、招募组蛋白去乙酰化酶。 （5）蛋白组装成复合物 （6）激活蛋白、绝缘体元件转录后水平; 剪切、拼接、3端降解，选择性RNA拼接，RNA编辑（在不同位点插入尿嘧啶改变编码序列） 25. 基因工程的核心技术：核酸杂交、基因测序、限制性核酸内切酶、DNA定向复制或者PCR、监控基因表达。 26. 组学：（蛋白、代谢、转录、基因）基因组学：研究有机体中出现的所有基因。 依赖于高通量技术： 自动测序、荧光染料、基因芯片、克隆技术、高通量基因组 功能基因组学：知道序列之后，我们需要知道功能，基因在个体的每个细胞中都相同，除了突变，每个细胞只
14、有一小部分基因表达，基因表达与不同分化状态有关。功能基因组学又称为后基因组学，通过识别基因在环境中的作用来识别基因的功能。 4.比较基因组学：比较基因组学：所有生物中都有相同的基因，比较生物间的相似性。理解不同物种间的独特性。 5.农业基因组学：小块的基因表达 6. 药物基因组学：为个体定制治疗方案生物信息学：计算机分析基因组学数据 序列分析、基因测序、生物过程建模 转录组学 ：所有的mRNA出现在特定的细胞，特定的地方和时间 转录组学有复杂的组成和可变性。最直接的研究方法就是构建cDNA文库。再与基因组学比较。 蛋白组学：不等于转录组学在特定的时间不是所有的mRNA都被翻译。 包括合成新的，
15、降解旧的多肽代谢组学：获得细胞代谢产物，与转录、蛋白组学比较，可以获得大量高质量的代谢产物得到可靠地生物化学和功能的信息。（核磁、电泳、毛细管电泳）27. 促进合成生物学研究的技术： （1）逆转录技术，转录组学 （2）克隆技术 （3）DNA芯片技术 （4）测序技术 （5）蛋白组学技术 （6）代谢组学技术 （7）质谱分析技术 28基因测序的自上而下：随机打碎-测大量片段-拼接运用工程学与生物学知识（二） 自下而上：染色体-片段-小段-测序-拼接 （一代） 29.细胞种类的不同 细胞大小：真核细胞大，原核细胞小 DNA结构：真核线状结构可以与组蛋白形成核小体，再高度盘旋形成染色体。 原核就是单条环
16、状双链DNA 细胞结构：原核细胞只有核糖体和拟核，真核有各种酶和细胞器 繁殖方式：真核细胞有丝分裂或减数分裂，原核二分裂 细胞死亡：真核细胞程序化死亡，原核细胞没有30. 革兰氏阴性杆菌与阳性：细胞膜外结构不同31. 多细胞原核生物：蓝细菌、链霉菌32. 无细胞结构生物：噬菌体33. 沃尔森和克里克1953年DNA双螺旋结构34. DNA合成蛋白质：转录-RNA修饰和剪接-RNA转运-翻译-蛋白质修饰和折叠 核糖体：三个结合位点A/P/E凝胶阻滞实验：测定与特定DNA结合的蛋白质的大小，放射性DNA才能看见免疫共沉淀实验：找一个与已知蛋白结合的序列，在体内基因与特定蛋白质结合DNA亲和色谱：找
17、一个与已知蛋白结合的序列，通过质谱确定氨基酸序列 低浓度-中-高 从游离的DNA中分离DNA-蛋白质复合物，移去蛋白质，测序离心技术： 平衡最重要，超速离心分离生物大分子 可溶性物质用蔗糖梯度离心色谱分离技术：（固体介质，需要洗脱） 三种：离子交换层析 凝胶过滤层析 亲和层析（基因克隆，目的性最强）变性蛋白质电泳：SDS（十二烷基磺酸钠）和-巯基乙醇 SDS PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳，免疫方法检测手段蛋白质杂交DNA杂交RNA杂交通过等电位集中分离蛋白质分子：等电点蛋白质静电荷为0，不移动双向电泳：考马斯亮蓝染色，应用蛋白质的缩氨酸图或指纹 蛋白质分离后，比较存在的多少。质谱分析：基质辅助激
18、光解吸电离飞行时间铺（MALDL-TOF） 气相，液相色谱与质谱联用DNA琼脂糖凝胶电泳：DNA带负电会发生迁移，依据分子量大小不同分离 溴化乙锭染色，紫外光下照射，可通过切割凝胶得到片段DNA杂交：不同DNA退火温度不同体外DNA标记;原料：dATP32，整合到链 每条链一端被P标记核酸杂交：测定序列，之后要使用凝胶电泳 杂交可以看到凝胶测不出的微量序列 上-下：吸水纸-硝化纤维纸-琼脂糖凝胶-海绵-碱性溶液 标记过的放射性DNA芯片;转录组学反转录DNA进行杂交定量蛋白质组学分析（iTRAQ）：蛋白质样品-法蛋白定量-蛋白质酶解-定量蛋白质组学定位- SCX分离-液相色谱质谱分析DNA测序
19、：dNTP链接，dd不连接。荧光PCR技术：实时定量PCR 缓冲溶液中有镁离子，可以影响突变位点个数 反应液中加入各种类型的荧光染料，检测荧光强度 基本成分与传统PCR一样SYBR GREEN1染料法;不进入链的染料没有荧光 复制进行，荧光强度增加 与所有双链结合无特异性，可通过溶解曲线检测特异性聚合酶链式反应1. 高温变性95度，1分钟2. 低温退火，加引物和模板杂交55-60度3. 延伸温度加DNA聚合酶和dNTP，68-72度，延长时间由长度而定4. DNA聚合酶Taq：从嗜热菌中获得，保真性不好，多一个3的尾巴 Puf：平末端，高保真性5. 引物的要求：不能有内部配对 退火温差5度 G
20、C含量 3端不要有连续的AT 不可以有发卡结构 不要过长6. 反应需要的物质：模板。引物、原料、DNA聚合酶、水、缓冲溶液7. 实验结果：当有杂交带时，可提高退火温度 没有时，可以适当降低 梯度PCR可以不同退火温度同时实验8. 应用：法医、检查病变、基因克隆、在引物中定向突变、延长PCR（增加保护碱基）9. 融合PCR：同源交换重组，抗性基因进入，菌落PCR验证 10. PCR动力曲线：基线期-指数增长期-线性增长期-平台期 阈值在指数增长期，精度高，阈值后指数形式增长 横坐标循环数，纵坐标DNA对数11.绝对定量PCR:给出目标基因的绝对数量 便于处理，难以制备标准溶液12. 相对定量PC
21、R：不用做标准曲线，内标一般为持家基因，受环境影响小DNA克隆1. 过程：克隆载体准备-克隆片段准备（PCR产物）-DNA连接酶（T4DNA连接酶）连接成重组DNA-导入受体细胞，转化受体细胞-摇瓶或平板富集培养验证克隆子-受体细胞富集培养-裂解纯化得到产物或者研究突变表型2. 其中验证：提取质粒-酶切之后跑胶-PCR验证用目标引物进行PCG扩增，看是否有目标片段生成。或者使用菌落PCR验证（有酶和蛋白的干扰）3. 限制性核酸内切酶：每种酶识别特定的序列切割 酶切位点大部分为回文序列 大部分粘性末端，极少也有平末端4. 酶切：加保护碱基，使酶切位点称为内部序列。5. 形成的粘性末端至少有一端磷酸化才能与质粒链接，可去磷酸化防止自连接6. 智力没有形成克隆子的原因：酶切效率达不到100 碱性磷酸酶去磷酸化不干净，出现自连接7. 酶的选择：载体上有合适的酶切位点，多克隆位点，基因内部没有该位点8. 载体选择：有宿主细胞对用的复制子， 可以使用穿梭质粒（其特点是有多克隆位点） 穿梭质粒：含有两个亲缘关系不同的复制子 有时需要克隆位点前有强的启动子 载体导入细胞有诱导剂才表达9. 宿主细胞DNA转化;化学转化，电转化10. 双酶切法;两个粘性末端用不同的酶切 质粒不用去磷酸化，没有自连接 效率高，没有方向限制 成功率不高11.TA克隆：提高正确性和效率