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1、现在学习的是第1页，共22页一、目的要求一、目的要求掌握发酵条件优化实验设计方法；掌握高压灭菌技术；提高实验动手能力和数据分析的能力。 现在学习的是第2页，共22页二、基本原理二、基本原理 发酵条件中培养基的配置可参照前人的经验配方，再结合菌种和产品的特性，采用摇瓶等小发酵设备对碳、氮、无机因子等单因子逐个试验，观察这些因子对菌体生长和产物合成的影响，再综合考虑各因素的影响。现在学习的是第3页，共22页 一个培养基设计的过程大约经过以下几个步骤：根据前人的经验和培养基成分确定实验时一些必须考虑的因素，初步确定可能的培养基成分；通过单因子实验最终确定出最为适宜的培养基成分；当培养基成分确定后，剩
2、下的问题就是各成分最适的浓度，由于培养基成分很多，为减少实验次数可考虑用“正交试验设计”等方法确定培养基的组分和浓度。现在学习的是第4页，共22页l定义：用正交表安排多因素试验与分析试验结果的办法，简称正交试验。l因素：影响试验指标的条件l水平：因素所处的状态现在学习的是第5页，共22页l简化试验次数l诸因素中哪些因素对指标的影响较大，哪些因素较小。l所考察的因素各取什么水平能使实验指标较好l指标在不同水平时的变化规律等现在学习的是第6页，共22页 正交实验设计是安排多因子的一种常用方法，通过合理的实验设计，可用少量的具有代表性的试验来代替全面试验，较快地取得实验结果。具体可以分为下面四步：根
3、据问题的要求和客观的条件确定因子和水平，列出因子水平表；根据因子和水平数选用合适的正交表，设计正交表头，并安排实验；根据正交表给出的实验方案，进行实验；对实验结果进行分析，选出较优的“试验”条件以及对结果有显著影响的因子。现在学习的是第7页，共22页 常用的正交表例如： L4（23）， L16（44）， L27（313） 正交表格式：Ln（tq） L代表正交表，n代表实验次数， t代表因素水平数，q代表因素数 。 常用的正交表可查阅有关统计学书籍直接套用。现在学习的是第8页，共22页l正交表选择依据：正交表选择依据： 在能容纳所研究的因素数和因素水平数的前提下选用试验次数最少的正交表来安排试验
4、l正交表安排试验注意事项：正交表安排试验注意事项： 尽可能使各因素的水平数相等， 试验的重复次数相当。现在学习的是第9页，共22页l例如考察细菌发酵产酸生产中最大糖酸转化率，探索发酵最佳工艺，准备对葡萄糖、尿素、玉米浆和KH2PO4浓度进行优化。（四因素）现在学习的是第10页，共22页现在学习的是第11页，共22页现在学习的是第12页，共22页现在学习的是第13页，共22页l各因素对产酸影响的大小顺序为： 葡萄糖 KH2PO4 尿素 玉米浆，l各因素的水平为：A2，B3，C2，D3 由此最终确立了菌株的优化配方： 葡萄糖4；尿素1.5； 玉米浆1；KH2PO40.5。现在学习的是第14页，共2
5、2页l直观分析优点：简便、计算工作量小l直观分析缺点：判断因素效应的精度不够，也不能给出误差的大小。现在学习的是第15页，共22页 三、三、 实验路线实验路线正交实验配方设计 配置液体培养基 接种 培养离心 取沉淀（胞内产物） 细胞破碎 溶解 包涵体 干扰素重组蛋白检测现在学习的是第16页，共22页四、四、 实验材料实验材料一）菌种：重组大肠杆菌；二）培养基及试剂：蛋白胨、酵母提取物、氯化钠、溶菌酶、裂解缓冲液：50mMTris-HCl pH7.5，50mM NaCl、2M尿素；三）其它材料：试管、接种环、高压蒸汽灭菌锅、光学显微镜、酒精灯、水浴摇床、离心机、冰箱等。现在学习的是第17页，共2
6、2页五、五、 实验步骤实验步骤、将重组大肠杆菌接种于LB液体培养基中，37振荡培养过夜，做为液体种子备用；（老师已准备好）、根据文献和初步研究结果，确定基础培养基成分：蛋白胨、酵母提取物、氯化钠，其基础浓度为%、0.5%、1%；、采用三因素、三水平正交实验设计，配制9组不同培养基进行发酵培养，每组3个重复；（ 5ml/支）4、配PBS、裂解液、2M尿素现在学习的是第18页，共22页5、培养基、PBS 121、20min高压蒸气灭菌，待冷却后，按5%接种量接种，放入37液体摇床250rpm，3.5h后加入IPTG诱导后继续震荡培养5h；6、收集每管重组大肠杆菌菌液，3000rpm离心10min,
7、弃上清，留沉淀，20与室温下反复冻融沉淀3次；7、细菌的裂解：将菌体沉淀混匀在9体积PBS中，4孵育5min。3000rpm离心10min后，称取菌体的湿重，每克湿重的菌体加入10ml裂解缓冲液，1mg溶菌酶重悬，充分混匀，37 0.5h。 现在学习的是第19页，共22页8、洗涤与纯化： 12000rpm(拟为4000)离心10min,获取沉淀，用2M尿素洗涤2次(拟删)，得到包涵体的粗提物；9、称取包涵体的重量，以此初步判断每组培养条件下重组大肠杆菌的蛋白表达量；10、采用正交实验直观分析法进行实验结果分析，确定较优的培养基浓度。现在学习的是第20页，共22页六、六、 实验结果与分析实验结果与分析1、讨论直观法正交实验分析的优缺点；2、应用正交实验直观法确定重组干扰素产生菌大肠杆菌培养基成分的优化配比，作为进一步发酵罐发酵依据。现在学习的是第21页，共22页感谢大家观看现在学习的是第22页，共22页