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1、关于单细胞培养现在学习的是第1页，共39页单细胞培养单细胞培养细胞悬浮培养细胞悬浮培养细胞培养现在学习的是第2页，共39页 第第5 5章章 单细胞培养及突变体筛选单细胞培养及突变体筛选 1 细胞培养细胞培养 2 单细胞的分离单细胞的分离 3 单细胞的培养方法单细胞的培养方法 4 突变体的筛选突变体的筛选现在学习的是第3页，共39页1 细胞培养细胞培养1.1 细胞培养：细胞培养：将植物体或其培养物游离的细胞或小细胞团进行培养的方法。 培养方式培养方式 单细胞培养单细胞培养 悬浮细胞培养悬浮细胞培养 培养对象培养对象 细胞个体细胞个体 细胞群体细胞群体 培养产物培养产物 单细胞克隆系单细胞克隆系
2、次生代谢产物次生代谢产物 酶制剂、人工种子等酶制剂、人工种子等 应用领域应用领域 筛选突变体，筛选突变体， 食品、药品、工业原料、食品、药品、工业原料、 细胞学研究，细胞学研究， 农业生产农业生产 进行遗传操作进行遗传操作 现在学习的是第4页，共39页1.2细胞培养的意义：细胞悬浮培养植株人工种子原生质体有用次生代谢产物突变体的筛选现在学习的是第5页，共39页2 单细胞的分离单细胞的分离分离的单细胞分离的单细胞平板培养平板培养看护培养看护培养饲养培养饲养培养微室培养微室培养单细胞无性系单细胞无性系现在学习的是第6页，共39页2.1 由外植体直接分离由外植体直接分离物理法：物理法：叶片叶片捣碎捣
3、碎过滤、离心过滤、离心收集细胞收集细胞酶解法：酶解法：酶解酶解果胶酶、纤维素酶果胶酶、纤维素酶外植体外植体具有代谢活性的细胞具有代谢活性的细胞注：必须对细胞进行渗透压的保护现在学习的是第7页，共39页2.2 由愈伤组织获得由愈伤组织获得固体培养固体培养液体培养液体培养过筛过筛单细胞体系单细胞体系外植体外植体获得愈伤组织，获得愈伤组织，并多次继代并多次继代悬浮细胞悬浮细胞高盐分、高生长素高盐分、高生长素现在学习的是第8页，共39页要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一般要求：松散性好，增殖快，再生能力强。其外观一般是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗粒状，松散易碎。是鲜艳的乳白或淡黄色，呈细小颗
4、粒状，松散易碎。 适于悬浮培养适于悬浮培养 适于再生植株适于再生植株现在学习的是第9页，共39页将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物将愈伤组织在液体培养基中培养，建立悬浮培养物优点：优点：细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均细胞团成小细胞团或单细胞；在培养基中均匀分布；有空气交流。匀分布；有空气交流。注：注：由愈伤组织分离单细胞的关键是获得由愈伤组织分离单细胞的关键是获得均一、松散均一、松散的的适合悬浮培养的愈伤组织适合悬浮培养的愈伤组织现在学习的是第10页，共39页现在学习的是第11页，共39页2、单细胞培养方法：、单细胞培养方法：2.1培养方法培养方法 1）平板培养法）平板培养法
5、 2）看护培养法）看护培养法 3）饲喂层培养法）饲喂层培养法 4）微室培养法）微室培养法2.2 单细胞培养的影响因子单细胞培养的影响因子 1）细胞植板密度）细胞植板密度 2）培养基的成分）培养基的成分现在学习的是第12页，共39页2.1 培养方法：培养方法：1）平板法）平板法（plating culture） （薄层培养）（薄层培养）1960年年Bergamann首创，是在固体培养基中首创，是在固体培养基中培养单细胞的一种方法。培养单细胞的一种方法。现在学习的是第13页，共39页现在学习的是第14页，共39页I I 细胞密度细胞密度：指单位体积内的细胞数量，是影响细胞培：指单位体积内的细胞数量
6、，是影响细胞培养的关键因子。养的关键因子。平板培养要求保证细胞密度为平板培养要求保证细胞密度为10 10 4 4 -10 -10 5 5 个个/ml/ml 。II II平板培养的效果用平板培养的效果用植板率植板率来衡量。来衡量。细胞密度和植板率细胞密度和植板率植板率植板率（plate efficiency） ：能长出细胞团的单细胞能长出细胞团的单细胞在接种单细胞中所占的比例。在接种单细胞中所占的比例。PE =平板中新形成的细胞团数平板中新形成的细胞团数/平板中接种的细胞数平板中接种的细胞数100 现在学习的是第15页，共39页优点：单细胞在培养基中分布较均匀，便于定点优点：单细胞在培养基中分布
7、较均匀，便于定点观察，筛选效率高、量大，操作简便观察，筛选效率高、量大，操作简便缺点：通气状况不佳，排泄物质易积累造成毒害缺点：通气状况不佳，排泄物质易积累造成毒害或影响组织吸收。或影响组织吸收。 现在学习的是第16页，共39页看护培养看护培养 . 愈伤组织不仅愈伤组织不仅为细胞提供了营养为细胞提供了营养，还提供了，还提供了促促进细胞分裂的某些物质进细胞分裂的某些物质现在学习的是第17页，共39页现在学习的是第18页，共39页 优点：简便、成功率高优点：简便、成功率高 缺点：不能在显微镜下直接观察缺点：不能在显微镜下直接观察现在学习的是第19页，共39页现在学习的是第20页，共39页4）微室培
8、养（）微室培养（microchamberculture) 人工制造一个小室，将单细胞培养在小室人工制造一个小室，将单细胞培养在小室中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细中的少量培养基上，使其分裂增殖形成细胞团的方法，称为微室培养法。此法首先胞团的方法，称为微室培养法。此法首先是由是由Jones等（等（1960）设计）设计现在学习的是第21页，共39页现在学习的是第22页，共39页 优点：可对细胞培养过程连续进行显微观优点：可对细胞培养过程连续进行显微观察，了解一个细胞经过生长、分裂、分化，察，了解一个细胞经过生长、分裂、分化，形成细胞团的全部过程。形成细胞团的全部过程。 缺点：微室培养用的培养基
9、量少，营养和缺点：微室培养用的培养基量少，营养和水分就难以保持。水分就难以保持。pH值变动幅度大，培养值变动幅度大，培养的细胞仅能短期分裂。的细胞仅能短期分裂。 现在学习的是第23页，共39页2.2 单细胞培养的影响因子单细胞培养的影响因子细胞密度细胞密度培养基成分培养基成分现在学习的是第24页，共39页（1） 细胞密度与培养基成分关系细胞密度与培养基成分关系 当细胞植板密度当细胞植板密度高高时（时（104105个个/mL）可使用和愈伤组织培养相同的常规培养基可使用和愈伤组织培养相同的常规培养基 当细胞植板密度当细胞植板密度低低时时要求使用复杂培养基，常采用要求使用复杂培养基，常采用KM8P培
10、养基培养基或条件培养基，并结合使用看护培养、饲或条件培养基，并结合使用看护培养、饲喂层培养等方法。喂层培养等方法。现在学习的是第25页，共39页成分成分 数量（数量（mgL-1） 成分成分 数量（数量（mgL-1） 成分成分 数量（数量（mgL-1）NH4NO3 600 KNO3 1900 KCL 300 MgSO47H2O 300 CaCL22H2O 600 KH2PO4 170 KI 0.75 H3BO3 3.00 ZnSO47H2O 2.00 MnSO4H2O 10.00 Na2MO42H2O 0.25 CuSO45H2O 0.025CoCL26H2O 0.025 NaFeEDTA 28
11、 葡萄糖葡萄糖 68400 甘露糖甘露糖 125 蔗糖蔗糖 125 鼠李糖鼠李糖 125 果糖果糖 125 纤维二糖纤维二糖 125核糖核糖 125 山梨醇山梨醇 125 木糖木糖 125 甘露醇甘露醇 125 丙酮酸钠丙酮酸钠 5 苹果酸苹果酸 10 柠檬酸柠檬酸 10 延胡索酸延胡索酸 10肌醇肌醇 100 生物素生物素 0.005 尼克酰胺尼克酰胺 1氯化胆碱氯化胆碱 0.5 盐酸吡哆醇盐酸吡哆醇 1 核黄酸核黄酸 0.1盐酸硫胺素盐酸硫胺素 10 抗坏血酸抗坏血酸 1 D-泛酸钙泛酸钙 0.5维生素维生素A 0.005 叶酸叶酸 0.2 维生素维生素D3 0.005P-对氨基苯甲酸对氨
12、基苯甲酸 0.01 维生素维生素B12 0.01水解酪蛋白水解酪蛋白 125 椰子汁椰子汁 10 KM-8P现在学习的是第26页，共39页（2）细胞密度直接决定细胞分裂与否：）细胞密度直接决定细胞分裂与否：细胞分裂要求细胞密度达到一定水平；细胞分裂要求细胞密度达到一定水平；细胞会产生某些物质，并分泌到培养基中，细胞会产生某些物质，并分泌到培养基中，只有当这些物质在培养基中达到一定的临界只有当这些物质在培养基中达到一定的临界水平，细胞分裂才启动。水平，细胞分裂才启动。现在学习的是第27页，共39页生长因子何种物质？用量多少？ 简化的纯合成培养基培养单细胞现在学习的是第28页，共39页3、应用、应
13、用筛选细胞突变体筛选细胞突变体3.1 突变体的特征突变体的特征 自然界突变体发生频率低自然界突变体发生频率低 突变体继代多次都能稳定遗传突变体继代多次都能稳定遗传 突变体中具有相应变化了的基因产物或生理生化代谢突变体中具有相应变化了的基因产物或生理生化代谢上的差异上的差异 突变体细胞形成的再生植株能通过有性传递保证其突变体细胞形成的再生植株能通过有性传递保证其突变型突变型现在学习的是第29页，共39页3.2 获得突变体的方法获得突变体的方法自发突变（体细胞无性系变异）自发突变（体细胞无性系变异）在组培过程中形成的再生植株表现出的遗传变异在组培过程中形成的再生植株表现出的遗传变异特点：自发产生，
14、无外在的选择压力；对于筛选目的突特点：自发产生，无外在的选择压力；对于筛选目的突变体有一定的盲目性变体有一定的盲目性适应材料：植物组培的培养物适应材料：植物组培的培养物现在学习的是第30页，共39页诱发突变诱发突变人为地采用物理和化学因素，诱发生物体产生遗传物质人为地采用物理和化学因素，诱发生物体产生遗传物质的突变，经分离、选择、培育成新品种的途径的突变，经分离、选择、培育成新品种的途径方法：物理诱变、化学诱变方法：物理诱变、化学诱变对象：种子、营养器官、离体培养材料（愈伤组织、对象：种子、营养器官、离体培养材料（愈伤组织、单细胞单细胞、原生质体）原生质体）现在学习的是第31页，共39页3.3
15、 细胞突变体筛选的优点与意义（与整体植物相比）细胞突变体筛选的优点与意义（与整体植物相比）培养细胞壁薄培养细胞壁薄, 缺乏角质层和蜡质层，且处在不断分裂中，缺乏角质层和蜡质层，且处在不断分裂中， 比整体植物或种子比整体植物或种子更容易接受诱变更容易接受诱变； 细胞水平诱变周期短，细胞水平诱变周期短，缩短育种年限缩短育种年限 ；处理数目多，处理数目多，收率高收率高；避免了整株水平上常出现的避免了整株水平上常出现的嵌合体；嵌合体； 节省人力和物力进行选择，节省人力和物力进行选择，筛选效率高筛选效率高；现在学习的是第32页，共39页3.4 细胞突变体筛选的技术路线：细胞突变体筛选的技术路线：选择起始
16、材料，获得愈伤组织，制备单细胞悬浮系选择起始材料，获得愈伤组织，制备单细胞悬浮系 人工诱变或自发突变人工诱变或自发突变 单细胞突变体单细胞突变体 筛选有益突变体筛选有益突变体 单细胞培养，获得克隆单细胞培养，获得克隆 再分化再分化 再生植株再生植株 突变株的鉴定突变株的鉴定 栽培栽培 种苗表型：种苗表型： 抗除草剂、抗盐碱、抗病、抗除草剂、抗盐碱、抗病、 抗氨基酸等抗氨基酸等现在学习的是第33页，共39页（1）选择方法直接选择：将培养细胞置于一定选择压力之下的选择方法。 选择抗性植株eg：耐盐、抗除草剂、抗病、抗氨基酸突变体等现在学习的是第34页，共39页间接选择：利用细胞内反应，形成某种有毒
17、物质使野生型被淘汰，从而选出突变体eg：硝酸还原酶突变株在氯酸盐培养基上，具有硝酸还原酶活性的野生型细胞将被杀死，而突变株可以存活。现在学习的是第35页，共39页 小麦耐盐细胞突变体筛选小麦耐盐细胞突变体筛选1.1.小麦穗（花粉发育到单核晚期）射线辐照诱变。小麦穗（花粉发育到单核晚期）射线辐照诱变。2.2.取花药接种在取花药接种在N N6 6+2,4-D+2,4-D2.02.0+KT+KT0.50.5+ +NaCl0.3NaCl0.3上诱导愈伤组织。上诱导愈伤组织。3.3.在去盐培养基上，将上述愈伤组织继代在去盐培养基上，将上述愈伤组织继代1 13 3次。次。4.4.移愈伤组织至移愈伤组织至N
18、 N6 6+NAA+NAA1.01.0+KT+KT1.01.0+ +NaCl0.3NaCl0.3上分化成苗。上分化成苗。5.5.将再生植株移栽到将再生植株移栽到盐渍土盐渍土中，检测其中，检测其耐盐性耐盐性。对耐盐好的植株。对耐盐好的植株以秋水仙素处理，使染色体加倍。以秋水仙素处理，使染色体加倍。6.6.对入选株后代进行耐盐稳定性测定、遗传分析及育种应用。对入选株后代进行耐盐稳定性测定、遗传分析及育种应用。现在学习的是第36页，共39页（2）鉴定方法 形态鉴定 细胞水平鉴定 生理生化鉴定 遗传鉴定现在学习的是第37页，共39页 嵌合体是指具有不同细胞系的组织共存于嵌合体是指具有不同细胞系的组织共存于同一个体或同一器官之中同一个体或同一器官之中 （由不同基因型（由不同基因型的细胞所构成的生物体）的细胞所构成的生物体） 杂合体是由来自不同的物种的两个配子形杂合体是由来自不同的物种的两个配子形成一个合子。一个杂合体的所有细胞来源成一个合子。一个杂合体的所有细胞来源于这一个合子。于这一个合子。 现在学习的是第38页，共39页感谢大家观看现在学习的是第39页，共39页