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1、-人血管生长素的真核表达及亚细胞定位.-第 3 页人血管生长素的真核表达及亚细胞定位 08-02-14 16:18:00 编辑：studa20 作者：张宏斌, 武婕, 杨太成, 冼江, 赖晃文, 杨传红, 郑文岭【关键词】 人血管生成素;,真核表达;,定位;,细胞核摘 要 目的: 建立人血管生成素（angiogenin, ANG）的真核表达系统并在细胞内亚定位。方法: 采用亚克隆技术构建重组荧光真核细胞表达质粒pEGFP/ANG, 然后经脂质体介导转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）并对转染细胞内pEGFP/ANG的表达用荧光显微镜和免疫组化染色进行鉴定。用共聚焦显微镜和免疫电镜观察ANG的亚细
2、胞定位。结果: 荧光显微镜观察可见转染的HUVEC内发出强绿色荧光。免疫组化染色检测显示, 转染的HUVEC中有棕色颗粒。共聚焦显微镜及免疫电镜检查显示, ANG集聚于细胞核区。结论: 以构建的重组体pEGFP/ANG转染HUVEC后, 可表达人ANG蛋白; 表达的ANG定位于细胞核区。关键词人血管生成素; 真核表达; 定位; 细胞核血管生成素（angiogenin, ANG）是一种相对分子质量(Mr)为14100、 pI为9.5、 由123个氨基酸组成的蛋白质, 存在于正常人的血浆及实体肿瘤组织中, 属于核糖核酸酶超家族成员1 , 其基因定位于14号染色体的q11区。ANG具有很强的促进血管
3、生成的作用。大量研究表明, ANG与肿瘤的快速生长和转移有密切的关系2, 3, 肺癌、 胰腺癌及乳腺癌等患者的外周血中ANG的水平明显升高, 而且血清ANG的水平与这些肿瘤的发展及转移呈显著的正相关, 因此, 通过检测血清ANG的水平可预测肿瘤的发生与发展情况4-6。然而, ANG对于创伤、 烧伤及血循环较差的股骨头、 半月板等损伤的修复则具有较大的临床应用价值。为此, 我们构建了人ANG基因的真核表达质粒, 并转染人脐静脉内皮细胞（HUVEC）进行表达, 鉴定了其亚细胞定位。1 材料和方法1.1 材料 荧光标记试剂盒为Molecular Probes 公司产品。鼠抗Golgi 58K或Cal
4、nexin单克隆抗体（mAb）为Sigma公司产品。EcoR、 BamH为Promega公司产品。荧光质粒pEGFP/C2购自Clontech公司。T4 DAN连接酶为宝生物工程（大连）有限公司产品。Lipofectamine2000为Invitrogen公司产品。DMEM培养液为Gibco公司产品。金标记的羊抗鼠IgG抗体为美国ZYMED公司产品。质粒抽提试剂盒为上海博彩生物科技有限公司产品。抗人ANG mAb由本室制备7。脐静脉内皮细胞（HUVEC）为本室保存。其他生化试剂购自华美生物工程公司等。1.2 方法1.2.1 人ANG基因的真核表达 构建含有人ANG全长基因序列的原核质粒pBV220/ANG, 用EcoR和BamH双酶切后, 回收并纯化400 bp 的ANG cDNA片段。将pEGFP/C2质粒以同样的酶酶切处理后, 将ANG cDNA片段和酶切处理的pEGFP/C2质粒在T4 DAN连接酶的作用下连接, 构建重组质粒pEGFP/ANG, 并转化Ecoli JM103感受态细胞8。用质粒抽提试剂盒提取重组质粒pEGFP/ANG, 在Lipofectamine2000介导下转染HUVEC。继续培养转染的细胞, 在荧光显微镜下观察转染细胞中荧光的表达。收集转染的HUVEC, 固定、 石蜡包埋切片后, 进行SP法免疫组化染色。