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1、海 南 大 学本 科 生 毕 业 论 文（设计）题 目：水律蛇病原菌的药敏实验 摘 要 水律蛇（ ）也叫滑鼠蛇，是一种无毒且经济、药用价值都很高的蛇种，养殖水律蛇的效益很高，所以越来越多的人选择饲养水律蛇与研究水律蛇，本实验以能与时控制与治疗水律蛇间一种高度传染的细菌性急病、减少该疾病引起的危害为目的，研究该疾病，对引起该疾病的致病菌做一组药物敏感试验，以便准确、针对性地用药，从而能与时控制与治疗该疾病，减少损失，本实验从病蛇体内抽取心脏血获取致病菌，通过分离与纯化得到三种致病菌（鲁氏耶而森氏菌的两种不同形态菌；木糖氧化产碱杆菌），实验通过纸片法用多种抗菌药物分别对这三种致病菌进行药物敏感实验
2、（ ）与最小抑菌浓度（ ）测试，实验结果表明这三种致病菌皆对氟啶酸、丙环派酸、丁胺卡那霉素、氟苯尼考等药为极敏，对乙酰螺旋霉素为高敏，对痢特灵、利福平、先锋耐药。木糖氧化产碱杆菌对氟苯尼的最低抑菌浓度（）为 ，对卡那霉素的最低抑菌浓度（）为 ，对庆大霉素的最低抑菌浓度（）为 ，鲁氏耶而森氏菌形态菌对氟苯尼考的最低抑菌浓度（）为，对卡那霉素的最低抑菌浓度（）为 ，对庆大霉素的最低抑菌浓度（）为 ，鲁氏耶而森氏菌形态菌对氟苯尼考的最低抑菌浓度（）为 ，对卡那霉素的最低抑菌浓度（）为 ，对庆大霉素的最低抑菌浓度（）为 。关键词：水律蛇；致病菌；药敏实验；最小抑菌浓度目 录摘要目录前言 实验材料与实验
3、方法实验材料1.1.1病料获取1.1.2培养基1.1.3实验药品与试剂准备1.1.4实验主要仪器实验设计与方法1.2.1病菌的分离与纯化1.2.2药敏实验1.2.2实验准备1.2.2试验步骤 1.2.3最小抑菌浓度试验1.2.3实验准备. 1.2.3试验步骤2. 结果与分析药敏试验结果与分析最小抑菌浓度试验结果与分析3. 讨论兽医临床中的用药现状. 药敏试验的意义 水律蛇养殖的注意事项. 本实验所研究疾病的治疗建议. 4. 结论致谢参考文献附件前 言 水律蛇是一种非常常见的无毒蛇，是蛇酒的首选代表蛇之一，其肉具有祛风除湿、舒筋活络的药用功效，养殖水律蛇会带来很高的经济效益，所以养殖水律蛇的养殖
4、户也越来越多，特别是广西广东福建一带，水律蛇不仅用于药用，也是广西广东福建一带主要的食用蛇之一。但是，很多的疾病也会严重影响着水律蛇的存活率，给养殖户带来很大的损失，其中，有一种在水律蛇之间高度传染的疾病，该病传播速度快，发病急，可致使水律蛇心、肝、肺等重要器官发生严重的炎性反应，应急情况下给蛇用常用的抗生素治疗没有效果，很多养殖户此时会选择大量使用抗生素，一种抗生素不行就换另外一种，此方法不但导致抗生素大量滥用，还延误疫情的控制与治疗，加剧经济损失，要想与时控制疾病减少损失就必须要针对性的准确用药，抗生素是最常见也是最有效的抗菌药物，为了防止无目的滥用抗生素，我们对引起此病的致病菌用纸片法做
5、药物敏感试验从而确定用药方案，针对性的治疗疾病达到控制疫情的作用，同时，再针对敏感药物做一组最小抑菌浓度（）试验，确定致病菌的最小抑菌浓度，可为用药方案提供参考值。药敏试验目的在于检出细菌的耐药性，确定细菌的耐药药物与敏感药物，根据细菌的敏感药物有针对性地选择治疗药物，测出最小抑菌浓度便于给临床用药做指导。试验材料与方法试验材料1.1.1病料的获取 解剖患病的水律蛇，用注射器刺进心包之内，从其心脏抽取一点心血液分离培养所得的分离纯化后的菌落，注意解剖的手术用具包括试验台都必须要进行消毒灭菌。1.1.2培养基 普通肉汤培养基 普通琼脂培养基 肉汤培养基 琼脂平板培养基1.1.3实验药品与药液准备
6、头孢唑啉钠、氟苯尼考、卡那霉素、庆大霉素、生理盐水、无菌水、麦氏比浊管、药敏纸片。1.1.4实验主要仪器 接种针、接种环、酒精灯、涂布棒、巴氏滴管、注射器、注射器、37恒温箱、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、分析天平等。实验设计与方法1.2.1病菌的分离与纯化 从病蛇体内抽取心血划线于普通琼脂平板培养基上，37培养小时，观察菌落，然后挑取平板上的纯培养菌落，再进行划线分离，直到染色镜检确定已无污染后，再将这些纯化的细菌做系列进行保种与做下一步实验。本步骤纯化获得三种不同的细菌（鲁氏耶而森氏菌的两种不同形态菌；木糖氧化产碱杆菌）。1.2.2药敏实验（纸片法）()实验准备 用接种环沾取一点纯化后的系列
7、细菌，接种于肉汤培养液中，37培养个小时，再用生理盐水将菌液调制为麦氏（相当于亿个细菌）备用。()试验步骤 用无菌巴氏滴管吸取一管备用菌液滴至滴到琼脂平板培养基上，弃掉剩余菌液，取灭菌过的涂布棒，经酒精灯灭菌，在琼脂平板上均匀涂布，待室温干燥后，将相应的抗生素纸片平贴于涂布好的培养基上，37培养小时，观察结果，注意一个平板贴至个纸片，且纸片之间要保持一定的距离，不能太过靠近，以免影响结果的记录。1.2.3最小抑菌浓度（）试验()实验准备 本实验有三种细菌，分别测试这三种细菌的最低抑菌浓度，先将这三种细菌接种到肉汤培养基中37培养小时，再分别将三种细菌用生理盐水或肉汤稀释成麦氏浊度备用，相当于亿
8、的细菌量，实验用药有卡那霉素、卡那霉素、氟苯尼考、庆大霉素和头孢唑啉钠四种药物，卡那霉素、氟苯尼考、庆大霉素都是根据前一步实验纸片法的结果选择的相应的敏感药物，此三样药物都是市面上容易买到的药物，头孢唑啉钠的选择是为了验证上一步实验纸片法中头孢纸片抑菌圈为是否合理，若两实验结果相符则可以排除头孢药敏纸片药效失效的可能。药物配制好后用高压蒸汽灭菌锅灭菌，再低温保存备用。本实验每种细菌做四种药，共有组，每组根试管，试管规格*，实验共用试管根。()试验步骤 本实验全部过程都在超净工作台操作，本实验的三种细菌分成菌组(鲁氏耶而森氏菌菌)菌组(鲁氏耶而森氏菌菌)，菌组(木糖氧化产碱杆菌)三大组实验，每大
9、组四种药物分别记为药药药药。组实验；将支试管排成行，每行各标上、记号，每行支试管，标上序号至号，在每一管中加入肉汤，塞上胶塞，在行号管中加入 的庆大霉素，混匀后吸取到行号管，混匀再吸到行号管，依次类推至行号管，从行号管吸弃掉，行号管不加药对照。再在行至号管中分别加入 麦氏浊度的菌菌液，塞上胶塞，做好标记。行、行、行依照行的方法相应加的的氟苯尼考、的卡那霉素、的头孢唑啉钠进行试验操作，加好后做好标记。组与组实验跟组实验做法一样，组用菌试验，组用菌试验，其他步骤都同组一样。全部加好后做好标记，37培养小时观察结果，如果结果试管变浑浊则说明长菌，该试管药物不能达到最低抑菌浓度，无法抑制细菌生长，如果
10、试管依然清亮，则说明不长菌，该试管药物达到了最低抑菌浓度抑制了细菌的生长。 表 术式表管号药物浓度 肉汤庆大霉素木糖氧化产碱杆菌菌液 弃 肉汤氟苯尼考木糖氧化产碱杆菌菌液 弃 肉汤卡那霉素木糖氧化产碱杆菌菌液 弃 肉汤头孢唑啉木糖氧化产碱杆菌菌液 弃 肉汤庆大霉素鲁氏菌菌液 弃 肉汤氟苯尼考鲁氏菌菌液 弃 肉汤卡那霉素鲁氏菌菌液 弃 肉汤头孢唑啉鲁氏菌菌液 弃 肉汤庆大霉素鲁氏菌菌液 弃 肉汤氟苯尼考鲁氏菌菌液 弃 肉汤卡那霉素鲁氏菌菌液 弃 肉汤头孢唑啉鲁氏菌菌液 弃 结果与分析药敏试验结果与分析 根据中华人民共和国卫生行业标准纸片抗菌药物敏感试验标准 的规定标准，测药敏试验抑菌圈直径，所得
11、实验数据如下： 表 肠杆菌科药敏试验判定标准 抗菌药物与 纸片 抑菌环直径 相应的 所测细菌名称 含量（） （最接近的完整数） （临界点，） 耐药 中介 敏感 耐药 敏感 氨基糖苷类 丁胺卡那 测其他细菌 卡那霉素 测其他细菌 表药敏试验判断结果 青霉素敏感标准其他抗菌药物敏感标准抑菌环直径敏感性抑菌环直径敏感性耐药耐药中度敏感中度敏感高度敏感高度敏感极敏表三种细菌对种抗菌药物敏感性的抑菌环直径与敏感性 药菌木糖氧化产碱杆菌鲁氏耶而森氏菌形态菌鲁氏耶而森氏菌形态菌抑菌圈直径敏感性抑菌圈直径敏感性抑菌圈直径敏感性卡那霉素中敏极敏极敏氟啶酸极敏极敏极敏痢特灵耐药中耐药丙环派酸极敏极敏极敏乙酰螺旋霉
12、素高敏极敏极敏利福平耐药耐药耐药先锋中敏耐药耐药丁胺卡那霉素极敏极敏极敏氟苯尼考极敏极敏极敏结果分析： 根据中华人民共和国卫生行业标准纸片抗菌药物敏感试验标准 的规定标准，分析结果如下：木糖氧化产碱杆菌对氟啶酸、环丙派酸、丁胺卡那霉素、氟苯尼考等抗药性为极敏，其中对丙环派酸、丁胺卡那霉素最敏，对乙酰螺旋霉素、氟啶酸为高度敏感，对先锋、卡那霉素为中度敏感，对痢特灵、利福平为耐药，对利福平耐药最强。鲁氏耶而森氏菌形态菌对卡那霉素、氟啶酸、丙环派酸、乙酰螺旋霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考为极敏，其中对丙环派酸最为敏感，对痢特灵为中敏，对利福平、先锋为耐药，对先锋耐药最强。鲁氏耶而森氏菌形态菌对卡那霉素
13、、氟啶酸、丙环派酸、乙酰螺旋霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考为极敏，其中对丙环派酸最为敏感，对痢特灵、利福平、先锋为耐药，其中对先锋耐药性最强。最小抑菌浓度（）试验结果与分析 表氟苯尼考药物结果菌管号木糖氧化产碱杆菌清亮清亮清亮浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊鲁氏耶而森氏菌形态菌清亮清亮清亮清亮浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊鲁氏耶而森氏菌形态菌清亮清亮清亮清亮浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊药物浓度 表卡那霉素药物结果菌管号木糖氧化产碱杆菌浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊鲁氏耶而森氏菌形态菌清亮清亮清亮清亮浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊鲁氏耶而森氏菌形态菌清亮清亮清亮清亮清亮浑浊浑浊浑浊浑浊药物浓度 表卡那霉素药物结果菌管号木糖氧化
14、产碱杆菌清亮清亮清亮清亮清亮清亮清亮清亮浑浊药物浓度 表庆大霉素药物结果菌管号木糖氧化产碱杆菌清亮清亮清亮清亮清亮浑浊浑浊浑浊浑浊鲁氏耶而森氏菌形态菌清亮清亮清亮清亮清亮清亮浑浊浑浊浑浊鲁氏耶而森氏菌形态菌清亮清亮清亮清亮清亮清亮清亮浑浊浑浊药物浓度 表头孢唑啉钠药物结果菌管号木糖氧化产碱杆菌浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊鲁氏耶而森氏菌形态菌浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊鲁氏耶而森氏菌形态菌浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊浑浊药物浓度 结果分析：在木糖氧化产碱杆菌试验中，氟苯尼考号管清亮号管浑浊可知木糖氧化产碱杆菌对氟苯尼考的最低抑菌浓度为号管的 ，同理对卡那霉素的最低抑菌浓度为号
15、管的 ，对庆大霉素的最低抑菌浓度为号管的 ，鲁氏耶而森氏菌形态菌实验中，号管澄清号管浑浊可知鲁氏耶而森氏菌形态菌对氟苯尼考的最低抑菌浓度为号管的，同理对卡那霉素的最低抑菌浓度为号管的 ，对庆大霉素的最低抑菌浓度为号管的 ，鲁氏耶而森氏菌形态菌实验中，号管澄清号管浑浊可知鲁氏耶而森氏菌形态菌对氟苯尼考的最低抑菌浓度为号管的，同理对卡那霉素的最低抑菌浓度为号管的 ，对庆大霉素的最低抑菌浓度为号管的 。3. 讨论兽医临床中的用药现状目前由各种细菌所引起的疾病给畜禽养殖业带来严重经济损失，阻碍了养殖业的快速发展，所以使用抗菌药预防和治疗细菌性疾病成了畜禽养殖过程中的一项重要工作。但由于养殖过程中不科学
16、的、盲目的滥用抗菌药，细菌的耐药性问题正变得越来越突出，不少耐药菌株可耐受多种抗生素。由此而造成的危害十分严重，它不仅使抗菌药的疗效降低，疗程延长，死亡率升高和治疗费用增加。这不仅给养殖业带来巨大的经济损失，而且耐药菌株可能会将耐药性基因由动物转移给人类，对人类健康也造成潜在威胁。药敏试验的意义 可以相对快速有效地检测病原菌对各种抗菌药的敏感性，指导临床合理用药 。因为实验是在体外对已经分离的细菌进行药敏，不需要生物载体，不需要实验动物，操作相对简单，成本相对降低。是一种既经济又有效的方法。 可以对流行病学调查进行监控，控制和预防耐药菌株的流行。因为随着新型致病菌的不断出现，各种致病菌对不同的
17、抗菌药的敏感性不同，同一细菌的不同菌株对不同抗菌药的敏感性也有差异，进行有效的药敏试验可以与时掌握各种新型菌种和菌株的耐药性，对流行病学调查建立监控，同时采取相应的措施也就可以控制和预防耐药菌株的流行。为临床用药提供参考依据，因为一个正确的药敏试验结果，可作为临床兽医和畜禽养殖者选用有效抗菌药的参考。长期以来，由于各种致病菌耐药性的产生使各种常用抗菌药药效下降或消失。不能很好的掌握药物对细菌的敏感程度，不但造成药物浪费，而且还延误病情，给养殖户造成了很大的经济损失。近十几年，在养殖生产中，为了控制大肠杆菌与某些细菌感染，一些抗菌药物的盲目使用，导致耐药菌株越来越多。根据已进行的大量药敏试验结果
18、，大肠杆菌、沙门氏菌对曾经敏感的氨基糖苷类、氟喹诺酮类等，均产生了不同程度的耐药性，经常发现对十几种常用抗菌药都不敏感的菌株 ，这是一个非常危险的信号。所以在临床疾病防治工作中，要取得较好的治疗效果，应扩大常规抗菌药种类进行药敏试验，根据药敏试验结果，选择敏感药物，且应注意交替用药，按疗程投药，这样才能收到较好的治疗效果。水律蛇养殖的注意事项 水律蛇养殖过程中，主要以疾病的预防为主，平时注意蛇舍的卫生与清洁，定时消毒与清理水律蛇排泄物，发现有传染病发生时，要与时隔离病蛇，进行隔离治疗，水律蛇患病时一般会不进食，所以用药很不方便，很多的养殖员会直接采取口灌的方式进行用药，这种用药方式虽然有效但是
19、花费的人力物力较多，相对来说不是最经济最合适的方法，对于蛇类的用药，除了口灌以外还可以采用药物浸泡的方法进行用药，此方法不需要花费很多的人力物力，而且效果也很好，浸泡的药物通过蛇的皮肤渗入体内从而达到治疗效果。 本实验所研究疾病的治疗建议 因为感染水律蛇引起水律蛇不食，腐皮，死亡且是混合感染的鲁氏耶而森氏菌两种形态菌和木糖氧化产碱杆菌都对氟啶酸、丙环派酸、丁胺卡那霉素、氟苯尼考等药为极敏，对乙酰螺旋霉素为高敏，对痢特灵、利福平、先锋耐药，所以建议在该疾病的治疗中，可以优先考虑用氟啶酸、丙环派酸、丁胺卡那霉素、氟苯尼考等这些抗生素进行治疗，用极敏药物治疗见效快，效果好，同时还可以避免过多的使用抗
20、生素或是滥用抗生素，导致筛选出超级耐药细菌，不仅缩短了治疗的时间、与时控制疾病传染，还节省了很多的成本与人力物力。.结论 木糖氧化产碱杆菌对氟啶酸、环丙派酸、丁胺卡那霉素、氟苯尼考等抗药性为极敏，其中对丙环派酸、丁胺卡那霉素最敏，对乙酰螺旋霉素、氟啶酸为高度敏感，对先锋、卡那霉素为中度敏感，对痢特灵、利福平为耐药，对利福平耐药最强。其中对氟苯尼的最低抑菌浓度（）为 ，对卡那霉素的最低抑菌浓度（）为 ，对庆大霉素的最低抑菌浓度（）为 。鲁氏耶而森氏菌形态菌对卡那霉素、氟啶酸、丙环派酸、乙酰螺旋霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考为极敏，其中对丙环派酸最为敏感，对痢特灵为中敏，对利福平、先锋为耐药，对先锋
21、耐药最强。其中对氟苯尼考的最低抑菌浓度（）为，对卡那霉素的最低抑菌浓度（）为 ，对庆大霉素的最低抑菌浓度（）为 。鲁氏耶而森氏菌形态菌对卡那霉素、氟啶酸、丙环派酸、乙酰螺旋霉素、丁胺卡那霉素、氟苯尼考为极敏，其中对丙环派酸最为敏感，对痢特灵、利福平、先锋为耐药，其中对先锋耐药性最强。其中对氟苯尼考的最低抑菌浓度（）为 ，对卡那霉素的最低抑菌浓度（）为 ，对庆大霉素的最低抑菌浓度（）为 。致谢本论文是在曾纪锋老师的悉心指导下完成的，老师治学严谨，对科研一丝不苟，这种敬业的精神潜移默化的影响并且激励着我，在老师的细心指导下，我学到了很多光靠书本是学不会的知识与技能，让我懂得学以致用，借此机会我向曾
22、老师表示衷心的感谢！同时，也感谢在完成实验的过程中给我很多帮助的马能凤、陈跃午、唐惠鹏同学和试验室的其他老师、师兄师姐。 参考文献陆承平.兽医微生物学.北京：中国农业出版社，：.李顺鹏. 微生物学实验指导. 北京市：中国农业出版社, .曹澍泽，董国雄.兽医微生物学与免疫学实验技术. 北京：北京农业大学出版社，. 倪语星，王金良，徐英春. 抗微生物药物敏感性试验规范.上海市：上海科学技术出版社, , .姚火春.兽医微生物学实验指导第二版.北京:中国农业出版社, .桂炳东. 细菌药物敏感性试验测定手册. 南昌市：江西科学技术出版社, .黄青云.畜牧微生物学第四版.北京:中国农业出版社：. 冯羡菊.微生物实验技术与临床.郑州大学出版社. . 李增光.细菌的耐药性.中国家禽.().白庆余，金梅. 蛇类养殖与蛇产品加工. 北京市：中国农业大学出版社, .白庆余，白秀娟. 蛇类养殖. 北京市：中国农业科技出版社, .附件图 划线分离得到的单个菌落 图 纸片法试验产生的抑菌圈图 纸片法实验前对照 图 纸片法实验后对照图 最小抑菌浓度试验前对照 图最小抑菌浓度试验后对照