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1、JIANGXI 本 科 毕 业 论 文（设 计）题目： 患腹水综合症肉鸡的肺动脉转录组学研究 学 院： 动物科学技术学院 姓 名： 学 号： 专 业： 动物医学 年 级： 二 年 月摘要 为了探讨肉鸡腹水综合症与肺动脉生物学变化的关系，从转录组生物信息的水平上对肉鸡肺动脉进行分析。本实验选取了羽日龄健康肉鸡随机分成对照组（羽）和造病组（羽），造病组（）饲喂含 的高盐水，对照组（）饮正常水。在饲养过程中肉鸡出现明显腹水综合症临床症状后颈静脉放血致死，并取的鸡肺动脉于液氮速冻，再放置保存，备用于转录组测序技术（）检测。结果表明：（）腹水鸡和正常鸡相比，发现了个差异表达基因。（）根据富集分析，个差异
2、表达基因主要参与， ， 等多个代谢通路以与可导致它们发生生物学变化。本实验结果揭示了患腹水综合症肉鸡的肺动脉与正常的肉鸡相比，基因转录水平现出了显著的差异。因此，其结果为肉鸡腹水综合症的发病机制提供了更新的信息，也为研发肉鸡腹水综合症新的药物靶点筛选提供一定依据和临床价值。关键词：肉鸡；肉鸡腹水综合症；目 录摘要前 言 实验材料与方法 试验动物和分组管理 试验日粮 样品收集与保存 主要仪器和试剂 实验耗材 检测样品的收集与准备 提取操作步骤 测序的实验室准备 序列分析 检测数据分析 结果 样品检测结果 电泳结果 样本间相关性 基因表达图 差异表达基因筛选 差异基因 分析 讨论 样品质量 样本选
3、择的可靠性 差异基因 富集分析 结论参考文献附录致谢前 言 肉鸡腹水综合症( ，）也称为肺动脉高压综合症(改为中文格式 ，），是由多种致病因子共同作用而引起的一种营养代谢病，在肉鸡养殖业中频繁发生，据统计，其发病率为，并且照成了巨大的经济损失要上标，所有参考文献。肉鸡腹水综合症的发病表现为呼吸困难，精神沉郁，并且很快死亡，解剖发现腹腔和心包有大量积液，并且右心室显著肿大.。 去掉对于肉鸡腹水综合症的发病原因，国内外一些研究发现，肉鸡腹水综合症发病的主要原因是肺动脉高压。由于肉鸡生长速度过快，在短时间内就可以达到一定的体重，尤其是快大型肉鸡，但是这时肉鸡的器官并没有发育完成，特别是心血管系统。为
4、了维持机体的活动以与对氧气的需求，心脏就会泵出足够的血液来维持，这时过多的血液流到有限的肺血管中，血液压力过大，肺动脉高压情况就出现。此时，血液流速过快，并没有携带足够的氧气，造成了体内氧气供求不平衡。为了缓解这一情况，右心室会代偿出更多的血液，出现了右心室壁显著增厚的情况。实际上，国内外很多报道已经证实缺氧，低温，高能量日粮等外界因素都会使肉鸡发生肉鸡腹水综合症。很多研究把肉鸡心脏指数超过和血容量升高当作指示肉鸡腹水综合症的重要指标, .研究报道通过限饲，长时间基因选育以与药物预防等方法来来缓解肉鸡腹水综合症对养鸡业造成的损失的效果并不显著，故对于肉鸡腹水综合症的研究值得众多科研工作者投更多
5、的精力。事实上，对于肉鸡腹水综合症的研究，目前国内外大多数都是停留在水平和生化水平上，对于基因水平研究少之又少，有基因方面的研究也是个别基因，并不全面。故下一步的研究应当从整个基因组水平来分析。随着科学的进步，高通量测序方法深受研究者的青睐，特别是在人医研究中，其优点是能鉴别组疾病发生过程中差异基因的表达以与差异基因参与的代谢通路，这就为后续的研究提供了非常好的铺垫。本实验的研究目的就是用的方法在整个基因水平来分析肉鸡腹水综合症的发病机理。据报道，肺动脉血管的变化与肉鸡腹水综合症的发生有关，已经证实发生肉鸡腹水综合症时肉鸡的肺动脉血管会发生重塑，而且肺动脉中的缺氧诱导因子表达会显著增高。故改为
6、：因此，本实验选取的是发生肉鸡腹水综合症的肉鸡肺动脉做转录组分析，找出与肉鸡腹水综合症相关的所有差异表达基因和这些基因参与的生物过程，从而为更好的治疗和预防肉鸡腹水综合症做出铺垫。 实验材料与方法 试验动物和分组管理本实验选取的是肉鸡（ ）羽。所有肉鸡按常规免疫程序进行免疫。所有肉鸡人工笼养至日龄，然后随机分为，造病组羽和对照组羽。在日龄前均正常饲喂和饮水，第日龄，其中造病组饲喂含的水，对照组正常饮水。对照组和造病组都给予相同饲料，自由采食。所有肉鸡均按规定免疫程序进行免疫，驱虫。对照组、造病组隔离笼养。试验持续周。 试验日粮本试验中肉鸡基础日粮来源于南昌某公司肉仔鸡饲料。字体不一样 样品收集
7、与保存 在造病组出现精神沉郁，呼吸困难，采食和饮水废绝的肉鸡时采样，每次采样挑选健康状况最差的造病组鸡只，随机挑选照组鸡只，剩余肉鸡在第日龄一次采完。采样前一夜禁水禁料，采样当天空腹称重，颈静脉放血致死，观察组织病理变化。迅速取每羽鸡肺动脉，用水清洗多次后，放于水处理过的管中，迅速放入液氮中速冻，然后转移到超低温冰箱冷冻保存，用于检测。段前空格多了，只要两个汉字空格就可以了，字体大小不一致 主要仪器和试剂型座式自动电热压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）；海尔立式超低温冷冻冰箱（青岛海尔特种电器有限公司）；电热恒温水浴箱（上海医疗器械七厂）；自动双重纯水蒸馏器（上海亚荣科学仪器有限公司）；全自
8、动生化分析仪检测（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）；各种规格微量移液枪（芬兰公司）电热鼓风干燥箱（北京医疗设备二厂）普通冰箱（南昌齐洛瓦电器集团）；分析电子天平（ ，）；万单位链霉素，万单位青霉素，肝素钠、去掉等均为市售。字体不一 实验耗材 各种规格托盘，手术剪，眼科剪，眼科镊，组织镊，手术刀片，手套，封口膜，一次性口罩，保鲜膜，无脂纱布，自封袋，牛皮纸，滤纸，脱脂棉，称量纸，擦镜纸，盖玻片，载玻片，玻片架，中性树胶等。、和注射器，和管，和枪头，与烧杯，量筒和量筒，液氮罐；。与上同样的问题 检测样品的收集与准备 建库测序的流程一般包括以下步骤（图）：总样品的检测，的富集，双链的合成，末端的修
9、复、加和接头，片段的选择和富集，文库质量的检测，上机测序。从样品的提取到最终获得数据，每一个环节（样品检测、建立文库、测序）都会对最终数据的好坏产生巨大影响，而后续信息分析又直接受到数据的好坏的影响。因此要对每一个生产步骤严格把控，产生高质量的数据，从而从源头上确保结果的准确可靠。与上同样的问题图 主要技术流程要加点. .6.1 提取操作步骤 （）取用液氮研磨后样本 左右加入 中，震荡，室温静置，离心，然后将上清转移至新管。 （）按照：氯仿 的比例加入氯仿，盖紧管盖，漩涡振荡器上振荡混匀，室温静置，自然分相。 （）， 离心，混合物会分成三层。 （）将上层水相转入一新管，加入等体积氯仿，振荡混匀
10、，室温静置，自然分相， 离心。 （）将上层水相转入新的 管（约），加入等体积的异丙醇，混匀后，放置。 （）， 离心，弃掉上清。 （） 沉淀用 乙醇漂洗， 离心。 （）重复步骤。 （）将沉淀置于超净工作台吹干，用适量 处理水溶解 沉淀。的定值与定量，琼脂糖凝胶电泳分析降解程度以与是否有污染，检测的纯度（比值），对浓度进行精确定量， 精确检测的完整性。 .6.2 测序的实验室准备 每个样品输入。按照 （, ）使用说明书建立序列库，并在每个样品的属性序列中加入索引编码。方法是用多聚微链接磁珠将 从总中纯化出来。将碎片用二价离子在高温首链合成反应液（）中提取出来。首链 用随机六聚体引物和 反转录酶（
11、）合成。随后，次链用聚合酶和酶合成。末端通过核酸外切酶聚合酶活性转换成钝端。碎片末端腺苷酰化作用后，绑结上带发夹结构的 为杂交做准备。用 （ , ，）纯化库碎片，以选择 长度 碎片。在大小适当，并加入适配器的中加入 应是，全文要统一 （，）， ，分钟，分钟，然后在 聚合酶，通引和指引下进行，最后，用 系统纯化产物，并用 系统评定建库质量。 获得 后，在有相关物种参考序列或基因组的情况下，进行生物信息分析，其流程如图。富集分析蛋白互作网络分析蛋白互作网络分析原始测序数据参考序列比对分析基因表达水平分析整体质量评估基因差异表达分析测序数据质量评估图 生物信息分析流程. .6.3 序列分析空格按照使
12、用说明书，在 集群生成系统上使用 （）进行引物编码样本的聚类，集群生成后，在 平台上进行库准备工作和并制定 单端磁珠。.6.4 检测数据分析.6.4 质量检测项目质量检测项目如表。表 检测项目 样品类型备注检测项目初步检测琼脂糖凝胶电泳定量；初步检测是必检环节，合格后才可以进行浓度、完整性、纯度的检测。浓度完整性 纯度.6.4 质量控制 形式的数据首先通过原始数据内部脚本编程，去掉带接头的，包含多聚的，以与低质量的得到 。同时，计算 的，和 含量。所有的后续分析都基于高质量的 。.6.4 比对参考基因 基因组和基因模型注释文件直接从基因组站点下载。参考基因组索引用 2.0.6建造和单端 用 匹
13、配参考基因组。选择 作为比对工具，对于 ，单端 用 匹配 序列。.6.4 基因表达水平的定量分析 用 0.6.1计算比对到每个基因的数。然后基于基因的长度比对到这个基因的数计算每个基因的。对于 ，用 计算比对到每个的数。.6.4 差异表达分析 对于有生物重复的，两种条件两组（每种条件下两个个生物重复）的差异表达分析用 包（1.10.1）进行。结果用 和 方法调整以控制错误率。中调整后 的基因被认为是差异基因。.6.4 差异表达基因的分析 差异表达基因的富集分析通过 包进行，同时纠正基因长度的偏差，修正后值小于的 被认为显著富集差异表达基因。 结果 样品检测结果2.1.1 电泳结果从图可以看出和
14、条带的亮度差不多，无杂带。样品的浓度分别达到：，：，：，：，均为以上，样品质量均达到级（表）。图 肺动脉总 电泳结果：（ ）；，：造病组；，：正常组表 两组（）的总检测结果 ()样品编号浓度（）值检测结果:样品质量满足建库测序要求，且总量满足次或者次以上建库需要2.1.2 测序数据质量与与参考基因组比对情况样品测序产出数据质量评估情况：从图、可以看出四个样本都只有前个碱基错误率偏高，之后的碱基错误率均在以下。从表也说明单个碱基位置的测序错误率均为，值分别得到，以上，含量均在左右。图 对照组测序错误率分布 . 图 造病组测序错误率分布 . 表 测序数据质量情况 ()()() ()注： : 样品名
15、； : 统计原始序列数据，以四行为一个单位，统计每个文件的测序序列的个数； : 的个数乘以长度，并转化为以为单位； : 通过公式： () 计算得到；，：分别计算数值大于、的碱基占总体碱基的百分比； : 计算碱基和的数量总和占总的碱基数量的百分比。 与参考基因组比对情况：如果参考基因组选择合适并且相关实验不存在污染的情况下，实验所产生的测序序列的定位的百分比正常情况下会高于，其中具有多个定位的测序序列占总体的百分比通常不会超过。在本实验中， 与参考基因组的比对均达到以上， 均在以下（表）。表 与参考基因组比对情况 ()()()() ()()()() ()()()() ()()()() ()()(
16、)() ()()()() ()()()()注： : 测序序列经过测序数据过滤后的数量统计（ ）； : 能定位到基因组上的测序序列的数量的统计； ：在参考序列上有多个比对位置的测序序列的数量统计； : 在参考序列上有唯一比对位置的测序序列的数量统计； ， ：测序序列比对到基因组上正链和负链的统计； ：分段比对到两个外显子上的测序序列的统计， 为整段比对到外显子的测序序列的统计。 样本间相关性样本间皮尔逊关联显示：对照组和造病组各组内比较均大于，而两组组间比较则都小于（图）图样本间相关性检测 基因表达图图 样本差异基因表达图 从图可以看出对组和正常组的基因表达不能完全吻合，说明了腹水鸡和正常鸡基因
17、表达有差异。 差异表达基因筛选通过对基因表达进一步筛选出显著差异基因，从火山图可以看出造病组和正常组差异表达的基因共有个，其中上调基因有个，下调基因个（图）。图 差异表达基因筛选 差异基因 分析 差异基因 富集柱状图，直观的反映出在生物过程（ ）、细胞组分（ ）和分子功能（ ）富集的 上差异基因的个数分布情况。我们挑选了富集最显著的个 在图中展示，本实验结果表明：对照组与造病组之间所有差异基因富集柱状图中显著富集到个参与生物过程，个参与细胞组分，个参与分子功能的差异基因；显著富集到个生物过程，个细胞组分与个参与分子功能的下调差异基因；显著富集到个参与生物过程，个参与分子功能的上调差异基（图）。
18、图 富集柱状图，：分别表示下调基因与上调基因富集柱状图，纵坐标为富集的 ，横坐标为该中差异基因个数；不同颜色用来区分生物过程、细胞组分和分子功能；带“”的为显著富集的 讨论 样品质量 从电泳图可以看出和条带的亮度差不多一样，无杂带（图）。样品的浓度分别达到：，：，：，：，均为以上，样品质量均达到级（表），表明样品质量满足建库测序要求，且总量满足次或者次以上建库需要。数据质量与对比情况一般情况下，单个碱基位置的测序错误率应低于，前个碱基测序错误率较高的原因为随机引物和模版的不完全结合，最高在左右可以接受。的含量指标的警告阈值为的的含量偏离正态分的标准差。本实验中单个碱基位置的测序错误率均为，值分
19、别得到，以上，含量均在左右（表），因此，本实验的数据质量可靠。与参考基因组比对情况：如果参考基因组选择合适并且相关实验不存在污染的情况下，实验所产生的测序序列的定位的百分比正常情况下会高于，其中具有多个定位的测序序列占总体的百分比通常不会超过。在本实验中， 与参考基因组的比对均达到以上，有多个比对位置的测序序列的定位的百分均在以下（表），表明选择的参考基因组可靠。 样本选择的可靠性样品间基因表达水平相关性是检验实验可靠性和样本选择是否合理的重要指标，相关系数越接近，表明样品之间的表达模式相似度越高。从皮尔逊相关性可以看出在两个对照组和两个造病组之间相关性均大于，而在对照组和造病组之间的相关系数
20、则小于，表明本实验造病成功和样本选择合理；基因表达韦恩图表达了各组表达的基因个数，以与其重叠关系，本实验基因表达韦恩图显示对照组和造病组有明显的基因表达差异。火山图可以反应出筛选后的差异基因整体分布情况，从图也反应出造病组的基因表达和对照组有显著差异。 差异基因 富集分析 差异基因富集柱状图，直观反应出发病鸡和正常鸡在生物过程，细胞组分和分子功能方面的变化。下调差异基因富集柱状图中显示，显著富集到的与生物过程有关的下调 翻译，参与细胞组分的下调 核糖体，核糖核蛋白复合体，表明在腹水发生时机体的蛋白合成受到严重影响，这可能是由于机体缺氧，以与细胞损伤等造成的；显著富集到的 无膜界限的细胞器，胞内
21、无膜界限的细胞器，细胞质部分，细胞质，细胞外基质，核糖体的结构组分以与结构分子活性，胞外蛋白高分子配合物，表明发生腹水综合症时，机体的蛋白质含量大大减低，并且细胞核糖体等细胞器受到损伤，以与细胞基质发生变化，腹水综合症发生时细胞的结构受到破坏，富集到的和生物功能有关的上调基因 有免疫反应和免疫系统过程，表明机体发生腹水综合症时，肉鸡的免疫功能代偿性上调，而富集到的和分子功能有关的上调基因包括趋化因子活性，趋化因子结合受体，细胞因子活性，细胞因子结合受体与蛋白偶联受体，趋化因子是控制细胞定向迁移的一类细胞因子，趋化因子系统在清除病原体、炎症反应、等方面都起着重要的作用，其增多可能是腹水发生时，机
22、体的炎症细胞大量增加，大量迁移的原因。细胞因子具有多种生物学活性，在机体内发挥重要的功能，机体细胞因子有关的分子功能 上调，也显示机体内环境发生了严重的失调。 结论本实验通过高通量测序的方法在整个基因水平上研究了肉鸡腹水综合征发病过程中其肺动脉的变化，通过与正常鸡对比，腹水鸡出现了个显著差异表达基因，而根据 的富集发现显著下调的差异基因主要参与了核糖体，核糖体蛋白，转录，细胞外基质等生物过程，上调的差异基因主要富集到了免疫应答反应和趋化因子的活动等过程。根据结果可以推断，肉鸡在发生腹水综合征的过程中，肺动脉细胞受到损失，为了保护机体，其免疫功能代偿性上调。这些研究结果为肉鸡腹水综合症的发病机制
23、提供了更新的信息，也为研发肉鸡腹水综合症新的药物靶点筛选提供一定依据和临床价值。参考文献. 陈超基于技术的人转录组分析研究中南大学，. 丁云磊，孙英杰，王晓旭，胡跃，费荣梅，丁铲样受体信号通路与其调控研究进展中国动物传染病学报，()：. 董晓芳，乔健，王慧煜，高铭宇，利凯，王建琳，徐彤，田勇高盐对肉鸡肺小动脉中膜平滑肌细胞表型转化的影响畜牧兽医学报，()：. 凌育燊肉用仔鸡腹水综合症研究进展畜牧兽医科技信息，, ()：. 王立坤数据的处理与应用吉林大学，. 向瑞平，李德印，姚秀丽，石冬梅，张华，皇甫和平腹水综合症患鸡肺小动脉肌型化与维生素对其作用郑州牧业工程高等专科学校学报，()：. 徐兴凤，
24、钟业俊，夏文，刘成梅，刘伟，左艳娜，艾亦旻不同采收期籼米外观与米饭食味品质的相关性分析食品科学，()：. 赵琛基于高通量测序的大鼠转录组注释研究华东师范大学.附录缩略词表英文缩写英文全称中文注释 腹水综合症 丹参酮 肺动脉高压症 体重 右心室LV 左心室 全心室 核糖核酸 差异表达基因 基因功能国际标准分类体系 反转录酶聚合酶链锁反应 某基因的表达量致谢时光荏苒，转眼间四年的大学生活就要过去了，当我的论文接近尾声的时候真正感觉到了四年光阴的短暂，感到对一起生活学习四年同学室友的不舍，对辛苦教导我们给与我们帮组的老师们的不舍。回忆四年来的大学生活，不禁心潮澎湃，感激之情难于言表。首先感谢我的老师
25、们，当我对专业迷茫时，你们的关怀与指导给了我极大的帮助，是我四年来不断进步的动力。你们严谨的治学风范，渊博的知识积累，正直的作风都不断熏陶着我指引着我，在此，我要特别感谢我的论文指导老师，刘平博士，从动物实验到论文的写作，都给与了我耐心细心的讲解，到了后期，我的论文得以完善定稿，老师又给了精心指导，在此向刘平老师致以诚挚和崇高的谢意。我还要感谢一直带我毕业论文的邓广付师兄，在论文设计到完善的过程中师兄都给与了我很多帮助，解决了很多问题，再次感谢师兄。另外我还要感谢我的同学与朋友，是你们在大学四年的生活中给我帮助，让我的大学生活倍感温馨，感谢你们让我的大学记忆力的每一个角落充满阳光和色彩。最后感谢我的父母和家人，谢谢你们，永远是我不断拼搏的后盾再次感谢所有帮助过我的人，祝老师与同学身体健康！