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1、实验十 50L发酵罐的使用发酵过程与控制生物工程132 1314200109 邓信任一、 实验目的认识全自动生物反响器的安装和准备，反响后的拆卸和清洗等；了解pH电极和溶氧电极DO的构造及根本原理；掌握pH电极和溶氧电极的校正方法；认识发酵罐培养基的灭菌，认识反响器在位高压灭菌的方法和规程，学会反响器培养液灭菌过程中的升温、保压、降温和培养温度的设定等操作；掌握接种的方法及操作，确保发酵液无杂菌污染；掌握pH调节剂、消泡剂及补料的连接方法；学会从反响器中定时取出样液的方法；学会如何进展参数控制并掌握正确使用先进反响器发酵生产的方法，从而可对中试级中试以上的发酵生产研究有一个初步的概念和感性认识
2、。二、 实验原理反响器为碟形，上盖可以自动起降，与罐体通过橡皮垫圈和螺栓密封。盖上设有搅拌电机、搅拌轴、机械密封及多个接口接种口、空气进口、尾气出口、各种检测仪表的插孔、消泡剂和酸碱液注入口、补料口、备用口、压力表等；罐体设有夹套层，用以加热或冷却；罐内有搅拌桨叶、挡板、空气分布器；中部侧面装有温度传感器、溶氧电极和pH电极插口及取样口；与罐体连接的局部布有无菌空气系统，并配备一台自动调控装置。整个装置处于工作状态时，必须保持无菌，而操作完毕后，必须移走培养液并清洗罐体等。待校正的pH电极是由氯化银参比电极和玻璃电极组合在一起的复合玻璃电极。复合电极的内层玻璃管与玻璃球泡相通，内充以恒定pH的
3、标准缓冲溶液，从中引出氯化银电极导线，组成玻璃电极即指示电极。在外层玻璃管引入银丝，其外表覆盖一层氯化银薄膜。从上部扩大局部边上的注液口参加饱和氯化钾溶液，即形成氯化银电极，在外玻璃管的下部开有一小口，装有多孔陶瓷芯，使氯化钾溶液可稍往外溶液渗漏，即所谓的液络部。复合电极的根本性能参数有电极转换系数也称Nernst斜率、电极零电位、电极内阻、参比电阻、电极响应时间、耐高温冲击的次数等，它们都有一定的要求和测试方法。新使用的电极或已经发酵运行一段时间的电极，其性能参数会发生变化，对某些性能参数要进展测定，决定是否可投入使用。3. 溶氧电极的校正电解型电极是由一个阴极贵重金属如铂或金、一个阳极Ag
4、/AgCl和一种电解质如中性NaCl溶液组成的图1。在某一荣溶氧浓度一定的溶液系统中，通过电极之间0.60.8V的电压，使溶解氧在阴极上被复原，从电极的电流电压极谱图图2a中可以看出，OA为极谱剩余电流；A点为氧的分解电压，当外加电压大于分解电压A时，电极输出电流I随着外加电压而增加，当到达B点后，电极电流就不再随着外加电压增大而增加，即电极电压进入恒定区，此时称为饱和电流或扩散电流。当外加电压继续增至C点时，电极输出电流迅速增加，这是由水被复原成氧造成的。从图2b中也可以看出，饱和电流与溶氧浓度呈正比关系。因此，只要把外加电压固定在电流电压图中的平坦局部，电极输出电流就可以校正测量溶解氧，这
5、个固定电压常选为0.60.8V。 反响式为： 阴极：O2+2H20+2e-H2O+2OH-H2O2+2e-2OH-阳极：Ag+Cl-AgCl+e- 总反响：4Ag+O2+2H2O+4Cl-4AgCl+4OH-用NaCl或KCl作为电解质，在使用过程中电解质被消耗，必须在一段时间后补充。4. 反响器培养液的灭菌与接种培养生物反响器的灭菌时采用夹套层蒸汽预热后直接或间接通入饱和蒸汽灭菌的方式进展的，可将反响器内培养液的温度升至121，以到达灭菌的效果。灭菌后的培养基冷却至培养温度后，即可接种培养。接种时，严格按照无菌操作进展，防止杂菌污染。5. 补料、取样生物反响器的补料酸碱、消泡剂及其他营养液可
6、通过蠕动泵进展，可自动也可手动；取样时了解发酵过程的重要手段，取样时，严格按照无菌操作进展，防止杂菌污染。三、 实验步骤1. 准备工作首先拧下螺栓，启动自动升降机，翻开上盖，检查培养罐内部是否清洗干净。插入校正完毕的pH电极和氧电极与罐侧面相关位置，并与控制连接。参加配置好的培养液，加盖并对称地拧紧螺母，直至上盖被密封固定。安装平安阀、泡沫传感器、观察灯、压力计、取样管及空气过滤器等，剩余的孔洞需用硅胶塞拧紧备用。使用完毕后拆卸时与以上步骤相反，并彻底清洗罐体及零件。2. pH校正此步骤必须于发酵罐灭菌前先校正，再将电极插入罐内。（1） 将电极置入标准液里7.00，看pH之量测值是否显示正确。
7、（2） 如尚有误差，请重复1、2步骤。注意：用于发酵过程中经取样量测。如发现与显示值有偏差，请调整使显示值正确。此数值乃将取样量测值减显示值之误差量输入。3. DO校正此步骤必须于发酵罐灭菌后罐内温度稳定时才能进展。（1） 将电极讯号线接头拆开，看DO之量测值稳定后按0键ZERO下方。DO显示值会显示0.0。（2） 将电极讯号线接头街上，槽内通气至饱和。看DO之量测值稳定后按100键SPAN下方。此时DO显示值会显示99.9。（3） 将电极讯号线接头拆开，看DO量测值是否显示正确。（4） 如尚有误差，请重复1、2步骤。注意：用于发酵过程中经取样量测。如发现与显示值有偏差，请调整使显示值正确。此
8、数值乃将取样量测值减显示值之误差量输入。4. 反响器的灭菌和发酵1） 灭菌此系统在灭菌状态前需将灭菌的条件作业准备妥当，包括以下几个方面：（1） 罐体洗干净后将顶板降下并锁紧切记此步骤完成前方可将控制启动。（2） 再次确定顶板盖是否已完全严密，各接口是否已安装上并锁紧，空气过滤器是否已安装或确定可用。（3） pH先行校正完成并插入槽内，DO电极插入槽内DO灭完菌后温度至发酵温度后再校正。（4） 将培养基装入罐内，并确认容量足够高于各感测电极。（5） 加料液及管件是否已事先灭菌准备完成。（6） 顶板不用的接口是否已拴紧。（7） 检查电极孔及取样口是否已定位锁紧，各供给源是否已准备好空气、冷却水、
9、蒸汽。（8） 完成上述所有步骤后即可开场灭菌。确定所设定灭菌条件正确后，将搅拌、温度、流量控制开关启动，开启灭菌开关开场灭菌。灭菌完成后系统会自动冷却，待冷却程序完成后系统会警报警示。之后将系统切至发酵即可开场发酵。2） 接种与培养通入反响器的空气从空压机经空气过滤器而成无菌空气，再由空气分布管送入灭过菌的培养罐内。在控制台上，设定所需的搅拌转速、发酵温度、pH，并将空气流量计的流量调至确定值，DO校正。将事先培养好的培养液在三角瓶中进展摇床培养，处于对数生长期的细胞，以无菌操作方式倒入已灭菌的、带有插在保险管套筒内的注射针及软管的三角瓶内；或直接倒入三角瓶种子由接种口接入罐内。接种时，要在接
10、种口的隔膜周围放上浸有乙醇的棉花或用13ml乙醇覆盖，点燃，以产生上升的气流来防止杂菌污染。接种塞从无菌筒内取出，然后将接种针穿过火焰和隔膜，慢慢插入中心部位，拧紧连接螺帽，直至插入局部固定。接种量大体上是培养液的百分之几。5. 补料、取样当调节pH和泡沫时，可将酸液或碱液及消泡剂装入三角瓶，灭菌后，分别经蠕动泵与反响器连接，补料与之一样。这样，通过控制台的自动控制，就可以自动地连接流加。为了了解培养过程中反响物的变化，必须定时进展取样。取样前，要先Udine取样口进展灭菌后再取样；取样时关闭排气口，使罐内处于正压状态，翻开取样口，培养液即可自动流出。但是，在下次取样时，必须注意将残夜放干净后
11、再取样。四、思考题（1） 为什么pH电极在生物反响之前要进展校正？答：因为要对PH电极的零电位和斜率标定后测量才准确。校正其电极，保持其反响灵 敏度，之后的测量更加准确。pH 电极使用一段时间后，不对称电位将会发生很大改 变，故必须定期校准。在以下情况下，必须重新校准：a、长期使用的电极基新换的电极。b、测量浓酸pH 2以后，或测量浓碱pH12以后。c、测量含有氟化物的溶液或较浓的有机溶液后。d、被测溶液温度与标准溶液温度或室温相差过大时。 对新使用的电极或已经发酵运行一段时间的电极，其性能参数要发生变化，对某些性能参数要进展测定，决定是否可投入使用。因为在经过使用后，标准缓冲液的浓度会发生变
12、化等。每使用过一次，标准缓冲液也会发生细微变化，因为缓冲液和发酵液在测试时，会发生交换。缓冲液浓度，成分等会改变。因而，pH指示不是真正的标准值。因而，pH电极在生物反响之前要进展矫正，通常选取pH=4,pH=7进展矫正。而首次使用前需要给其进展电极通电，进展火化。（2） 在pH电极的校正操作过程中应注意哪些考前须知？地在发酵罐中安装好PH电极，安装过程时，切忌将电极薄膜碰撞到发罐管壁等。2、根据发酵液的pH确定电极矫正的pH矫正，一般是pH=4,pH=7。3、矫正前要确保标准液，如pH=4的标准液没有被污染，尽量混匀。4、在不同的标准液进展矫正前，先用纯水清洗一下，以免相互影响。5、pH电极
13、一般进展屡次矫正。（3） 为什么在生物反响之前要对DO电极进展校正？是否每次反响都必须校正？为什么？ 答：因为在测量发酵液的溶氧量时，也会发生电解液和发酵液的进展交换等，这样会导致电解液的变化，从而导致溶氧电极的测定也会出现误差。所以，在生物反响之前要对Do电极的矫正。 每次反响都要进展矫正，因为溶氧电极在不同罐内测定有不同的罐压，同时，发酵液，转速等条件的不同，在不同条件下测定不同。首先，溶氧电极的矫正必须在溶液中进展矫正，无论是0点还是100%点，在空气中矫正没有意义的。0点在饱和亚硫酸钠溶液中，100%点的矫正是发酵液灭菌，接种完后，通气，搅拌转速到达测定值后，等发酵体系稍微稳定一段时间后才能矫正的，其次，发酵过程中，溶氧值在理论上是不断的下降，在发酵尾期上升的，但也会出现高于100%的情况，比方罐内的压力上升导致DO上升。