《光动力学疗法影响变形链球菌生长和形态的体外研究.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《光动力学疗法影响变形链球菌生长和形态的体外研究.docx（7页珍藏版）》请在taowenge.com淘文阁网|工程机械CAD图纸|机械工程制图|CAD装配图下载|SolidWorks_CaTia_CAD_UG_PROE_设计图分享下载上搜索。
1、光动力学疗法影响变形链球菌生长和形态的体外研究【基金项目】重庆市卫生局科研课题基金资助（2008-2-243)【作者简介】林居红，电话：（023）88860090，E-mail : 许小辉，蒋 琳，林居红，刘明方（重庆，重庆医科大学附属口腔医院儿童牙病中心与口腔预防科；重庆，重庆医科大学实验教学中心）摘要 目的 研究甲苯胺蓝为光敏剂介导的光动力学疗法对变形链球菌体外生长与表面形态的影响，探讨光动力学疗法影响致龋菌生长代谢的作用机制。方法 在不同光剂量和不同光敏剂浓度下，通过体外活菌菌落计数法测定光动力学疗法对变形链球菌的生长抑制作用，扫描电镜观察光动力学疗法处理前后菌体表面形态的改变，实验分空
2、白对照组、光敏剂对照组、光对照组和实验组，各组间活菌菌落取对数值后采用析因设计方差分析。结果 光动力学疗法能显著抑制变形链球菌的体外生长，随着光照时间和光敏剂浓度的增加，其灭菌效果逐渐增强。当光敏剂浓度为 ，光照时间为、 时，细菌菌落对数值分别为、，与空白对照组（）相比差异有显著性（）， 与 两实验组之间差异有显著性（）。光敏剂浓度和光剂量二因素之间存在交互作用（, ）。扫描电镜观察结果显示实验组变形链球菌与对照组相比菌体表面粗糙不平，有水泡状凸起。结论 甲苯胺蓝为光敏剂介导的光动力学疗法能显著抑制变形链球菌体外生长并改变其表面形态。关键词 光动力学疗法；变形链球菌；龋病中图法分类号 文献标志
3、码 . . , , . , 、 : 、 , () . （, ）; , . .光动力学疗法( ，)是一种联合利用光、光敏剂和氧分子产生光化学效应选择性杀伤病原微生物的新方法，当感染部位局限时，其治疗效果更具优势。近年来，逐渐应用于口腔医学。作为继癌症、心血管疾病之后的第三大慢性非传染性疾病，龋病形成和发展的主要因素是细菌与其代谢产物。目前国外已有学者研究不同光敏剂介导的对主要致龋菌的影响，以探索其应用于控制菌斑和预防龋病的可能性；国内关于在龋病防治领域的研究报道甚少。变形链球菌是公认的主要致龋菌之一，其在口腔中存在的数量与比例，可以作为龋患风险评估的一个重要指标。本实验通过体外实验研究在不同光剂
4、量和不同光敏剂浓度下对变形链球菌的生长抑制作用，并用扫描电镜观察处理前后变形链球菌菌体形态的改变，初步探讨影响致龋细菌生长代谢的机制，为其作为一种预防龋病的新方法应用于临床提供初步理论依据。材料与方法 实验菌株与培养基变形链球菌 。实验菌株由四川大学口腔生物医学工程教育部重点实验室提供。培养基：培养基，由友康基业生物科技（北京）有限公司提供。光敏剂和光源光敏剂：甲苯胺蓝（ ）粉剂（, . , ），用生理盐水分别配制成浓度为、的溶液，微孔滤器过滤除菌，4下避光保存，备用。光源：欧美娜窄谱红光光动力治疗仪( ，)，由重庆医科大学第一附属医院提供。具体参数如下：波长（），输出功率（）,功率密度为，光
5、源类型为二极管非相干光。 实验方法1.3.1 实验菌液的制备 将变形链球菌冻干菌种复苏，接种于血琼脂培养基，37下厌氧（ ， ）培养 ，经生化鉴定与形态学检查为纯培养物后，接种于液体培养基增菌 ，麦氏比浊法调整菌液浓度为（ ），稀释倍后备用。.3 的处理过程和实验分组 取标准孔板( )个，每孔分别滴加 甲苯胺蓝溶液和 菌液，使甲苯胺蓝最终浓度为、 ，菌液浓度为 。空白对照组分别滴加 培养基和 菌液。在涡旋振荡器上混匀后，黑暗中放置 ，然后按产品说明书用光源在距离板3 cm处照射，照射时间分别为、 ，相应的照射剂量为、 。为了避免光照时间的相互干扰，在处理组照射时，其他各组均用锡箔纸遮盖以隔绝光
6、源。.3.3 菌落计数 处理后，将孔板置于涡旋振荡器上震荡 以充分混匀菌液，取 菌液稀释于 无菌缓冲液（）中，吹打均匀后再取 菌液稀释于 缓冲液中，如此反复做倍递增连续稀释，使各管中的菌液稀释度分别为 ，取 稀释液各 滴注于琼脂平板培养基上，37下厌氧（ 、 ）培养 ，选择最合适的浓度段进行菌落计数。取每组个平行样，取均值，实验重复次。.3.4 扫描电镜观察 在无菌试管中放入大小为0.8 cm0.8 cm无菌盖玻片，加入 液体培养基，接种菌液 ,兼性厌氧条件下（ ， ）培养 后，涂片检查以确保样本无污染。小心弃去菌液，取出盖玻片，无菌缓冲液轻柔漂洗遍以去除疏松附着的游离菌，实验组盖玻片表面滴加
7、 浓度为 的甲苯胺蓝，黑暗中放置 后光照 ，相应的能量密度为 。对照组盖玻片不做处理，仅用无菌缓冲液轻柔漂洗遍，将实验组和对照组盖玻片立即放入戊二醛溶液中，下过夜，然后依次用、乙醇梯度脱水，干燥、喷金，扫描电镜下观察细菌形态。 统计学分析 用对实验结果进行处理，各组间进行析因设计方差分析。 结果光动力学疗法对变形链球菌体外生长的抑制作用 对变形链球菌的生长抑制作用实验结果见表、。单独的光和甲苯胺蓝对变形链球菌生长无明显影响，与空白对照组相比差异无统计学意义（）。二者同时作用产生的光动力学效应显著抑制变形链球菌的生长。实验组与空白对照组相比有显著性差异（）。随着光照时间和光敏剂浓度的增加，其灭菌
8、效果逐渐增强。当光敏剂浓度 时，同一浓度段不同光照时间段各组间无显著性差异（）。当光敏剂浓度为 时，光照时间与两实验组间有显著性差异（，）, 与两实验组间无显著性差异（，）；光敏剂浓度和光照时间二因素之间存在交互作用（，）。表 不同浓度甲苯胺蓝和不同光照时间下光动力作用前后菌落数对数值(，）浓度（）光照时间（） ,与空白对照组(,光照时间)比较； ,与实验组(,光照时间)比较表 甲苯胺蓝浓度和光照时间析因设计分析结果 * 光动力学疗法对变形链球菌形态的影响 扫描电镜图片结果显示：实验组变形链球菌形态与对照组相比有明显变化。在 倍扫描电镜图下，对照组变形链球菌菌体外形清晰，菌细胞表面光滑连续、无
9、缺损（图1A），实验组细菌虽然菌体外形清晰，但大部分菌细胞表面粗糙不平，有水泡状凸起，菌细胞周围有散在的不定形物质溢出（图）。1A：右下角为箭头对应处细菌放大图。:对照组：实验组图 扫描电镜观察实验组变形链球菌形态（ ）讨论的主要原理涉与光敏剂、光源和氧分子。光敏剂在适宜光的激发下由基态变成激发态并与与周围的氧分子结合，释放出单线态氧等多种活性氧物质。这些活性氧物质可以与微生物体内的重要生物大分子如蛋白质、核酸和脂质发生氧化还原反应，造成生物大分子活性物质丧失，导致微生物死亡。与传统抗菌疗法相比，不仅对各种革兰氏阳性菌和阴性菌都有显著的抑制作用，而且不会产生细菌耐药性。与单纯的激光治疗相比，
10、属于冷光治疗，更为安全可靠。此外，光敏剂与细菌结合的能力远远强于与哺乳动物体内细胞的结合能力，因此表现出对组织表面或组织内细菌的选择性杀伤作用，而对正常组织细胞影响较小；当感染部位局限时治疗效果更具优势。而口腔疾病大多数是由于细菌引起的慢性局限性感染，由于其治疗优势，在口腔医学领域的应用前景被国内外学者看好。国外已有学者证实波长为的激光与甲苯胺蓝结合产生的光动力学效应能够破坏变形链球菌生物膜的稳定性，提出甲苯胺蓝和激光结合产生的光动力学效应可以用于治疗牙菌斑感染性疾病。然而国内类似研究却鲜有报道。细菌是影响龋病形成和发展的主要因素，它们以菌斑生物膜的形式在牙表面聚集，通过生长代谢活动，改变局部
11、微环境条件，造成牙体硬组织损伤。变形链球菌血清型、仍然是公认的与龋病密切相关的主要致病菌，其在口腔中存在的数量以与与其他细菌的比例，可以作为龋患风险评估的一个重要指标。因此本实验选取变形链球菌为研究对象。等用甲苯胺蓝与发光二级管激发光（波长为）结合作用于远缘链球菌和变形链球菌天的生物膜，发现当甲苯胺蓝浓度为，激发光能量密度为 时，产生的光敏作用能够减少生物膜内以上的细菌数量。本实验结果显示：甲苯胺蓝为光敏剂介导的可以显著抑制变形链球菌的生长，随着光照剂量和甲苯胺蓝浓度的增加其灭菌效果逐渐增强；当光敏剂浓度为 ，光照时间为时，的效果达到最优状态。这个结果与的结论非常接近，而 用甲基蓝作为光敏剂观
12、察其被红色激光激发后产生的光动力效应对变形链球菌的影响，在光敏剂浓度为 时取得了最佳的抗菌作用（灭菌率为）; 用波长白色激光激发光敏剂赤藓红作用于变形链球菌，发现的间断照射效果优于连续光照,推测原因是连续光照时光敏剂可能还未完全与细菌结合时便被光活化。本实验结果与国外相似实验的差异性说明的成功疗效依赖于适宜的光敏剂类型、剂量和照射光源类型、光剂量等具体治疗参数的精确优化。此外，本实验同时发现，即使增加光照时间至,其灭菌效果与实验组相比并无显著性差异。这表明光敏剂浓度和光照时间二因素之间的交互作用并不单纯是简单的线性关系，二者的具体剂量关联性有待于进一步深入研究。本实验选择的光敏剂甲苯胺蓝是第二
13、代光敏剂，与第一代光敏剂相比，能迅速与细菌结合并穿透细胞膜进入菌细胞内部，对病变区域、细菌有较好的选择性；在组织中有较好的穿透深度；与波长为左右的光结合能产生单态氧，在杀灭致病菌的同时对正常组织细胞无明显毒副作用；报道甲苯胺蓝吸收适宜波长的红色激光后多种细菌的生长，即使当致敏底物，如脱矿牙本质、胶原酶存在的情况下，仍然具有抗菌作用，并且产生光敏作用的过程中对人角化上皮细胞和成纤维细胞不会产生毒性作用。此外，其价格较低，便于推广普与。本实验扫描电镜图片结果显示：实验组变形链球菌形态与对照组相比有明显变化。对照组变形链球菌菌体外形清晰，菌细胞表面光滑连续、无缺损；实验组变形链球菌虽然菌体外形清晰，
14、但大部分菌细胞表面粗糙不平，有水泡状凸起，菌细胞周围有散在的不定形物质溢出，说明细胞壁和细胞膜接触结构被破坏，由于胞内物质的丧失而导致细菌包膜和体积的减少。参考文献：1 Biel MA. . . .2 彭志庆,林居红,刘明方,等. 国产水溶性蜂胶对主要致龋链球菌与其耐氟菌株致龋性的影响.第三军医大学学报().3 许小辉,林居红，刘明方.光动力学疗法影响人工菌斑生物膜形成的扫描电镜观察 第三军医大学学报().4 栾秀玲,秦艳利,白雪峰，等. 甲苯胺蓝为光敏剂的光动力疗法对龈上菌斑灭菌效果的研究.牙体牙髓牙周病学杂志, ().(收稿：2011-12-27；修回：2012-03-01)（编辑 吴培红）