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1、姓名 系年级 学号 日期 科目 遗传学实验 题目 模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定摘要： 农杆菌Ti质粒转化植物细胞后，在获得的后代分离群体中，有T-DNA插入的纯合突变体，杂合突变体，和野生型。在突变体研究中，需要的材料是纯合突变体。本次实验意在对模式植物拟南芥T-DNA插入突变体进行鉴定。实验中用到的主要实验方法有：CTAB法提取拟南芥基因组DNA、PCR扩增目的基因片段、琼脂糖凝胶电泳分离核酸。PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程。PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成。每完成一个循环需24分钟，23小时就能将待扩增目的基因
2、扩增放大几百万倍。琼脂糖凝胶电泳是用琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。它兼有“分子筛”和“电泳”的双重作用。带电颗粒的分离不仅取决于净电荷的性质和数量，而且还取决于分子大小，这就大大提高了分辨能力。DNA经EB染色，EB可与核酸结合，在紫外光激发下产生荧光。现广泛应用于核酸的研究中。引言Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒，该质粒上有一段特殊的DNA区段，当农杆菌侵染植物细胞时，该DNA区段能自发转移进植物细胞，并插入植物染色体DNA中。所以Ti质粒上的这一段能转移的DNA被叫做T-DNA。将Ti质粒进行改造，将感兴趣的基因放进T-DNA区段中，通过农杆菌侵染植物细胞，实现外源基因对植物的遗传转化。T
3、-DNA插入基因内部导致基因突变：T-DNA插入到植物染色体上的位置是随机的。如果T-DNA插入进某个功能基因的内部，特别是插入到外显子区，将造成基因功能的丧失。所以利用农杆菌Ti质粒转化植物细胞，是获得植物突变体的一种重要方法。农杆菌能在自然条件下感染双子叶植物和裸子植物，而对大多数单子叶植物没有感染能力。这使农杆菌Ti 质粒转化系统的应用范围受到了一定的限制。反向遗传学研究的首要条件是获得基因敲出突变体，建立可靠、有效、方便的T-DNA插入突变体的鉴定方法。其中，“三引物法”是主要鉴定方法之一。“三引物法”即采用三个引物（LP、RP、BP）进行PCR扩增。野生型植株目的基因的两条染色体上均
4、未发生T-DNA插入，所以其PCR扩增产物仅有1种，电泳结果为一条大带（由LP+RP这一对引物扩增出来）；纯合突变体植株目的基因的两条染色体上均发生T-DNA插入，也只能得到1种PCR扩增产物，电泳结果为一条小带（由BP+RP这一对引物扩增出来）；杂合突变体植株只在目的基因的一条染色体上发生了T-DNA插入，所以PCR扩增产物有2种，电泳结果为一条大带由（LP+RP这一对引物扩增出来）和一条小带（由BP+RP这一对引物扩增出来）。电泳结果差异明显，能有效区插入突变体的类型。此法优点是可同时鉴定出纯合突变体并确证T-DNA的插入情况。本方法操作简单，成功率高，结果可靠，适用于从大量拟南芥TDNA
5、插入突变体中快速鉴定出突变体。【实验材料】1.试剂： 液氮，2*CTAB提取液，氯仿-异戊醇（24：1），无水乙醇，70%乙醇，TE，PCR反应体系（DNA模板（基因组DNA），引物LP、RP、BP，缓冲液，MgCl2，dNTP mixture，ddH2O，Taq酶），琼脂糖凝胶电泳（琼脂糖，1TAE缓冲液，Loading buffer，DL 2,000 DNA Marker，-Hind DNA digest Marker，溴化乙锭。2.器具： 1.5ml离心管，水浴锅，微量移液器，离心机，PCR仪，微波炉，电泳仪，电泳槽，梳子，三角瓶，微量天平，手套，染色盘，凝胶成像仪。3.材料：拟南芥T-
6、DNA插入突变体植株。【实验步骤】提取拟南芥基因组DNA1. 在1.5ml离心管中放入2或3片拟南芥幼嫩叶片，用液氮将其研磨成细粉，向管中加入600ul预热至65的2CTAB提取液，轻摇混匀。2. 65水浴30 min，其间轻摇混匀。3. 向上清液加入等体积的氯仿/异戊醇（24：1），室温下轻轻混匀10 min，12000 rpm离心15 min，再转移上清入新管。4. 向上清液中2倍无水乙醇或等体积的异丙醇，小心混匀，-20 下30 min，12000 rpm离心15 min，弃上清。5. 用70%乙醇洗涤沉淀一次，12000 rpm稍离心，弃上清。6. 将沉淀晾干，加20-50ul TE
7、(pH 8.0)，65水浴30 min溶解DNA。PCR取3个PCR小管（一个为三引物体系，另外两个为双引物体系），按照如下反应体系向PCR小管内加入样品，设定如下反应程序，进行PCR。反应体系：三引物反应体系 25ul体系双引物反应体系25ul体系H2O15ulH2O16ul10xTaq buffer (MgCl2free)2.5ul10xTaq buffer（MgCl2free)2.5ulMgCl2 (25mM)2ulMgCl2 (25mM)2ul引物LP (10 uM)1ul引物LP或BP (10 uM)1ul引物RP (10 uM)1ul引物RP(10 uM)1ul引物BP (10 u
8、M)1uldNTP (各2.5mM)0.5uldNTP (各2.5mM)0.5ul模板DNA(30-50ng/l)2ul模板DNA(30-50ng/l)2ulTaq酶(5U/l )0.2ulTaq酶(5U/l )0.2ul反应程序预变性 94 5min 变性 94 40sec退火 53 50sec 延伸 72 80sec 循环35次 72 10min琼脂糖凝胶电泳注：电泳这一步骤，我与其余五名同学共同完成，共用同一块胶板。基因组DNA的电泳所用琼脂糖凝胶浓度为0.8%，PCR产物的电泳所用琼脂糖凝胶浓度为2% 。1. 制胶：称取0.24g琼脂糖，加入30mlTAE缓冲液（用于基因组DNA的电泳
9、）；另称取1.60g琼脂糖，加入80mlTAE缓冲液（用于PCR产物的电泳）。放入微波炉中加热溶化。2. 灌胶：待胶冷至50-60时，缓缓倒入胶板。约半个3040min后，胶已凝固，拔去梳子，将胶板放在电泳槽中，补充槽内TAE缓冲液，至约高出胶板1mm。3. 加样：将样品与Loading buffer在封口膜上混匀，用微量移液器将样品加入到点样孔内。（基因组DNA加样量为5ul，PCR产物加样量为20ul）4. 电泳：接通导线（加样端接负极），调节电压至5v/cm，当指示剂距胶板底部1-2cm时，停止电泳。5. 染色：将胶板放入含EB的染色盘中，染色约10min，再将胶板转移到清水中清洗。6.
10、 观察：将凝胶放入凝胶成像仪内观察、拍照。【实验结果】理论上，电泳结果图上会出现一条大带或一条小带或两条带同时出现，并且可以对T-DNA插入突变体的类型做出准确鉴定。各种可能的电泳结果对应插入突变的类型如下表：电泳条带的有无鉴定结果1000-1500bp间800-900bp间有无野生型有有插入杂合突变体无有插入纯合突变体但是由于多种可能，最终基因组DNA和PCR扩增产物的电泳结果都没有出现预期条带。对这一现象出现的原因分析如下：由于班里大多数同学出现了同样的情况，只有极少数同学的电泳结果图上出现了条带，基本可以断定并非由实验操作造成。【注意事项】1. 实验取材为植株叶片，而不要将植株连根拔起。否则的话即便检测出实验材料为插入纯合突变体，由于植株已经不存在，实验结果就没有了意义。2. 液氮研磨实验材料时，注意不要将液氮倒在手上，以免将皮肤冻伤。3. 配制PCR反应体系时由于各种试剂量较少，要靠壁滴加。4. 在用微波炉加热溶解琼脂糖的过程中，TBE缓冲液中的水分会蒸发掉一少部分，所以，最好在加热前在三角瓶内补充少量蒸馏水。5. 注意电泳方向，点样孔所在方向对准电泳槽的负极（DNA带负电荷，在电泳的过程中向正极移动）。6. EB为强诱变剂，染色时要佩戴手套，实验技术后认真清洗双手。参考文献1模式植物拟南芥T-DNA插入突变体的鉴定.ppt