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1、-RNA提取准备工作及注意事项-第 6 页一、枪头和EP管等的消毒灭菌1、用去离子水配制0.1%（千分之一）的DEPC（剧毒物），须在通风橱中小心使用，避光，密闭4保存;DEPC水是用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)处理过并经高温高压消毒的MiliQ纯水。经检测不含 RNase、DNase和proteinase。2、将枪头和EP管放入0.1%的DEPC内，保证枪头和EP管内都充满0.1%的DEP,3、避光、静置、过夜（12-24 h）4、装枪头和EP管的盒子不需要用DEPC浸泡，将枪头或者EP管内的DEPC水大致去除干后，装起，包好5、121摄氏度，30min6
2、、180摄氏度，干燥数个钟头（至少3小时以上）。注意：a、处理DEPC时需要戴乳胶手套、口罩！ b、或者不用DEPC消毒，130，90min高压灭菌（许多实验室高温灭菌两次）二、RNA提取注意事项1、组织 RNA 抽提失败的两大现象是： RNA 降解和组织内杂质的残留。关于降解问题，首先看一下为什么从培养细胞中抽提 RNA 不容易降解。现有的 RNA 抽提试剂，都含有快速抑制 Rnase 的成分。在培养细胞中加入裂解液，简单的混匀，即可使所有的细胞与裂解液充分混匀，细胞被彻底裂解。细胞被裂解后，裂解液中的有效成分立即抑制住细胞内的 Rnase，所以 RNA 得以保持完整。也就是说，培养细胞由于
3、很容易迅速与裂解液充分接触，所以其 RNA 不容易被降解；反过来讲，组织中的 RNA 之所以容易被降解，是因为组织中的细胞不容易迅速与裂解液充分接触所致。因此，假定有一种办法，在抑制 RNA 活性的同时能使组织变成单个细胞，降解问题也就可以彻底解决了。液氮碾磨就是最有效的这样一种办法。但是，液氮碾磨方法非常麻烦，如果碰到样品数比较多的时候更加会有此感觉。这样就产生了退而求其次的方法：匀浆器。匀浆器方法没有考虑细胞与裂解液接触前如何抑制 Rnase 活性这个问题，而是祈祷破碎组织的速度比细胞内的 Rnase 降解 RNA 的速度快。电动匀浆器效果较好，玻璃匀浆器效果较差，但总的来说，匀浆器方法是
4、不能杜绝降解现象的。因此，如果抽提出现降解，原来用电动匀浆器的，改用液氮碾磨；原来用玻璃匀浆器的，改用电动匀浆器或者直接用液氮碾磨，问题几乎 100% 能获得解决。影响后续实验的杂质残留问题，其原因比降解更多样，解决方法相应也不同。总之，如果出现降解现象或者组织内杂质残留现象，则必须对具体实验材料的抽提方法/试剂进行优化。优化大可不必使用您的宝贵样品：可以从市场上购买一些鱼/鸡之类的小动物，取相应部分的材料用于 RNA 抽提，其它部分用于抽提蛋白质 用嘴碾磨，肠胃抽提。2、抽提 RNA 的目的RNA 用于不同的后续实验，其质量要求不尽相同。cDNA 文库构建要求 RNA 完整而无酶反应抑制物残
5、留；Northern 对 RNA 完整性要求较高，对酶反应抑制物残留要求较低；RT-PCR 对 RNA 完整性要求不太高，但对酶反应抑制物残留要求严格。投入决定产出；每次都以获得最高纯度的 RNA 为目的，劳民伤财。3、样品的收集/保存 影响降解的因素样品离开活体/或者原来的生长环境后，样品中的内源酶即会开始降解 RNA，降解速度与内源酶含量及温度有关。传统上，只有两个办法可以彻底抑制内源酶活性：立即加入裂解液并且彻底而迅速地匀浆；切成小块后立即投入液氮冷冻。这两个办法都要求操作快速。后者适合所有的样品，而前者只适合细胞及内源酶含量较低的并且较容易匀浆的组织。具体地讲，植物组织，肝脏，胸腺，胰
6、腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等最好都先用液氮冷冻起来，再往下做。4、样品的破碎及匀浆 影响降解和得率的因素样品的破碎是为了彻底匀浆，匀浆是为了使 RNA 彻底完整地释放出来。细胞无须破碎即可直接匀浆，组织需要破碎后才能匀浆，酵母菌和细菌需要先用相应的酶破壁后才能匀浆。内源酶含量较低并且较容易匀浆的组织可以在裂解液中通过匀浆器一次完成破碎和匀浆过程；植物组织，肝脏，胸腺，胰腺，脾脏，脑，脂肪，肌肉组织等样品，它们不是内源酶含量高，就是不容易匀浆，所以必须将组织的破碎和匀浆分开操作。最可靠而且得率最高的破碎方法是使用液氮的碾磨，最可靠的匀浆方法是使用电动匀浆器。使用液氮碾磨要特别注意一点：在整个碾
7、磨过程中，样品不得融化，因为冷冻后内源酶更容易起作用。5、裂解液的选择 影响操作方便程度，内源杂质残留的因素常用的裂解液几乎都能抑制 Rnase 活性，因此，选择裂解液的重点是要结合纯化方法一起考虑。只有一个例外：高内源酶含量的样品建议使用含苯酚的裂解液，以增加灭活内源酶的能力。6、纯化方法的选择 影响内源杂质残留，抽提速度的因素对于干净的样品，如细胞，手边的几乎任何纯化方法都可以获得满意的结果。但对于许多其它样品，尤其是植物，肝脏，细菌等杂质含量很高的样品，选择合适的纯化方法是至关重要的。柱离心式纯化方法抽提速度快，能有效去除影响 RNA 后续酶反应的杂质，但价格较贵；使用经济而经典的纯化方
8、法，如 LiCl 沉淀等，也可以获得满意的结果，但操作时间长。7、RNA 抽提的“三大纪律八项注意”纪律一：杜绝外源酶的污染。注意一：严格戴好口罩，手套。注意二：实验所涉及的离心管，Tip 头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。注意三：实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保 RNase-Free。纪律二：阻止内源酶的活性注意四：选择合适的匀浆方法。注意五：选择合适的裂解液。注意六：控制好样品的起始量。纪律三：明确自己的抽提目的注意七：任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，抽提成功率急剧下降。注意八：RNA 抽提成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。8、RNase 污染
9、的10大来源1）手指头，手指头是外源酶的第一来源，所以必需戴手套并且频繁更换。另外，口罩也必需戴，因为呼吸也是一个重要的酶来源。戴手套口罩的另外的好处是保护实验人员。2）枪头，离心管，移液器 单纯的灭菌是不能灭活 Rnase 的，所以枪头和离心管要用 DEPC 处理，即使是标明为 DEPC 处理过的。移液器最好是专用的，用前用 75% 的酒精棉球搽拭干净，尤其是杆子；另外，一定不要使用褪头器。3）水/缓冲液一定要确保无 Rnase 污染。4）实验台面最起码要用 75% 的酒精棉球搽拭干净。5）内源 Rnase所有组织均含内源酶，故组织用液氮速冻是降低降解的最好办法。液氮保存/碾磨方法的确不方便
10、，但对有一些内源酶含量很高的组织，却是唯一的办法。6）RNA 样品RNA 抽提产物可能都会含痕量的 Rnase 污染。7）质粒抽提质粒抽提往往用到 Rnase 降解 RNA，残留的 Rnase 要用 Proteinase K 消化，PCI 抽提。8）RNA 保存即使低温保存，痕量的 Rnase 亦会导致 RNA 降解。长期保存 RNA 的最好办法是盐/醇悬液，因为醇在低温时抑制所有的酶活性。9）阳离子 （Ca， Mg）在含这些离子时，80C 加热 5 分钟会导致 RNA 被剪切，故如果 RNA 需要被加热，保存液需要含螯合剂 （1mM Sodium Citrate， pH 6.4）。10）后续
11、实验所用的酶酶均有可能被 Rnase 污染。9、RNA 抽提的10大窍门1：快速阻止 Rnase 活性样品收集后快速冷冻，裂解时快速操作灭活 Rnase。2：选择合适的抽提方法高核酶含量的组织，脂肪组织最好用含苯酚的方法。3：预判质量要求Northern，cDNA 文库构建对完整性要求高，RT-PCR， RPA （Ribonuclease protection assay） 对完整性要求不是很高。RT-PCR 对纯度 （酶抑制物残留） 要求很高。4：彻底匀浆是提高得率和降低降解的关键。5：检查 RNA 的完整性电泳检测，28S：18S =2：1 是完整的标志，1：1 对大部分实验也是可以接受的
12、。6：去除 DNA用于 RT-PCR， array analysis 最好用 Dnase I 去除 DNA。7：降低外源酶的污染 不能从外面又导入酶。8：低浓度的核酸浓缩时，要加入助沉淀试剂。但要防止助沉淀剂含酶及 DNA 污染。9：彻底溶解 RNA，必要时可以 65C 加热 5 分钟。10：合适的保存方法 短时间可以 20C 保存，长期请保存于 80C。提高 RNA 得率首先要意识到不同得样品其 RNA 含量差别很大。高丰度 （2-4ug/mg） 的如肝脏，胰腺，心脏，中丰度 （0.05-2ug/mg） 的如脑，胚胎，肾脏，肺，胸腺，卵巢，低丰度 （ 1，该完整性可以满足绝大部分后续实验要求
13、了。A260/A280 是一个给大家带来许多困惑的指标。首先要明确该指标用于核酸的原始含义是：纯的 RNA，其 A260/280 = 2.0 左右。纯 RNA 是因，A260/A280 = 2 是果。现在大家却在拿 A260/A280 当因用，认为“如果 A260/A280 = 2，所以 RNA 是纯的”，自然会产生困惑。有兴趣的话，可以在您的 RNA 样品中加入一点抽提中经常使用的试剂，如苯酚，异硫氰酸胍，PEG 等，再测 A260/A280 比值。现实是，许多抽提 RNA 时使用的试剂，以及样品中的许多杂质都在 A260 和 A280 处附近有吸收，对 A260/A280 产生影响。目前最
14、具有指导性的做法是：对 RNA 样品在 200-300 nm 范围扫描。纯 RNA 的曲线具有如下特点：曲线平滑，A230 和 A260 是两个拐点，A300 接近 0，A260/A280 = 2.0 左右，A260/A230 = 2.0 左右。如果没有扫描数据，也一定要测定 A260/A230 比值，因为该比值对所有影响酶反应的杂质的残留更敏感。要考虑设备的线形范围 （A260 要处于 0.1 0.5 之间）。另外有两个有用的现象：在水中测定 A260/A280，比值将变低 0.3 左右；而在 10mM EDTA 中测定的比值比在 1mM EDTA 中测定的高 0.2 左右。RNAguard
15、：抑制组织/细胞内源酶的试剂综上所述，确保 RNA 不降解的传统做法是：在取组织前将含液氮的容器放在手边，一旦取出所需组织，立即切割小后投入液氮中。抽提前先在碾钵中加入适量的液氮，再将组织从液氮中取出迅速放入已加入液氮的碾钵中碾磨。碾磨过程中要及时补充液氮以防止组织融化。待组织彻底碾磨碎后，等待剩余液氮恰好挥发完时，立即将碾磨碎的组织移入裂解液中快速匀浆.安全的称重几乎不可能。这么严格的操作，是没有多少实验人员去认真执行的。RNAguard 能快速抑制样品中的内源酶活性，确保动物组织/细胞中的 RNA 在 37C 一天不降解，25C 一周不降解，4C 一个月不降解，-20C 一年以上不降解。RNAguard适用的样品包括：动物组织，培养细胞，昆虫，及部分植物组织。经过 RNAguard 处理的样品可以用几乎所有常用的 RNA 方法/试剂抽提 RNA，所有的操作与用新鲜组织没有什么不同。使用 RNAguard 的操作非常简单：在取组织前预先估计组织的重量，在一个容器中加入 5-10 倍体积的 RNAguard，放在手边。取出所需组织后，立即切割成厚度小于 0.5 厘米，放入含 RNAguard 的容器中即可。抽提前先用镊子将组织从 RNAguard 中取出，在室温进行切割和称重后，移入裂解液中快速匀浆。