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1、-DNA提取和PCR-第 16 页DNA提取和PCR课题1 DNA的粗提取与鉴定一、基础知识（一）提取DNA的方法提取生物大分子的基本思路是选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。对于DNA的粗提取而言，就是要利用DNA与RNA、蛋白质和脂质等在物理和化学性质方面的差异，提取DNA，去除其他成分。（1）DNA的溶解性：l DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度的NaCl溶液中溶解度不同，利用这一特点，选择适当的盐浓度就能使DNA充分溶解，而使杂质沉淀，或者相反，以达到分离目的。l 此外，DNA不溶于酒精溶液，但是细胞中的某些蛋白质则溶于酒精。利用这一原理，可以将DNA与蛋白
2、质进一步的分离。（2）DNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性：蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响。大多数蛋白质不能忍受6080oC的高温，而DNA在80以上才会变性。洗涤剂能够瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。（二）DNA的鉴定在沸水裕条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色，因此二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。二、实验设计（一）实验材料的选取 凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，但是使用DNA含量相对较高的生物组织，成功的可能性更大。（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液 动物细胞的破碎比较容易，以鸡血细胞为例，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。如果实验材料是植物细
3、胞，需要先用洗涤剂溶解细胞膜。例如，提取洋葱的DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液。注意：不能用哺乳动物的成熟红细胞提取DNA。（三）去除滤液中的杂质 方案一 利用DNA在不同浓度的NaCl溶液中溶解度的不同，通过控制NaCl溶液的浓度去除杂质。方案二 直接在滤液中加入嫩肉粉，反应1015min，嫩肉粉中的木瓜蛋白酶能够分解蛋白质。方案三 将滤液放在6075的恒温水浴箱保温1015min，注意严格控制温度范围。（四）DNA的析出与鉴定 1、将处理后的溶液过滤，加入与滤液体积相等的、冷却的酒精溶液（体积分数为95%），静置23min，溶液中会出现
4、白色丝状物，这就是粗提取的DNA。用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，并用滤纸吸取上面的水分。2、取两支20ml的试管，各加入物质的量浓度为2mol/L的NaCl溶液5ml，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4ml的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，待试管冷却后，比较两支试管溶液颜色的变化，看看溶解有DNA的溶液是否变蓝。实例：用鸡血细胞液粗提取DNA并鉴定步骤操作图示1、提取鸡血细胞的细胞核物质将制备好的鸡血细胞液（已在课前配好）510mL，注入到50ml烧杯中。向烧杯中加入蒸馏水20mL，同时用玻璃棒沿一个方向快速搅拌5mi
5、n，然后，用放有纱布的漏斗将血细胞过滤至1000mL的烧杯中，取其滤液，滤液中含有核DNA和其它杂质。2、溶解细胞核内的DNA将物质的量浓度为2molL的NaCl溶液40 mL加入到滤液中，并作玻璃棒沿一个方向搅拌1min，使其混合均匀，这时DNA在溶液中充分溶解，其它一些杂质析出，过滤取其滤液。3、析出含DNA的粘稠物沿烧杯内壁缓缓加入蒸馏水，同时用玻璃棒沿一个方向不停地轻轻搅拌，这时烧杯中有丝状物出现。继续加入蒸馏水，溶液中出现的黏稠物会越来越多。当黏稠物不再增加时停止加入蒸馏水。4、滤取含DNA的粘稠物用放多层纱布的漏斗，过滤溶液至1000 mL的烧杯中。取纱布上的黏稠物。5、将DNA的
6、粘稠物再溶解取一个50 mL烧杯，向烧杯内注入物质的量浓度为2molL的NaCl溶液20 mL。用钝头镊子将纱布上的黏稠物夹至NaCl溶液中，用玻璃棒沿一个方向不停地搅拌3min，使黏稠物尽可能多地溶解于溶液中。6、过滤含DNA的氯化钠溶液取一个100 mL烧杯，用放有两层纱布的漏斗过滤以上溶液。取其滤液（DNA溶于滤液中）。7、提取含杂质较少的DNA在上述滤过的溶液中，加入冷却的、体积分数为95的酒精溶液50 mL（加入时动作要慢），并作用玻璃棒沿一个方向搅拌，溶液中会出现含杂质较少的丝状物。当玻璃棒上出现丝状物缠绕时，继续慢慢搅拌，至不再增加时，用玻璃棒将丝状物卷起，并用滤纸吸取上面的水分
7、。8、DNA的鉴定取两支20 mL的试管，各加入物质的量浓度为2molL的NaCl溶液5mL，将丝状物放入其中一支试管中，用玻璃棒搅拌，使丝状物溶解。然后，向两支试管中各加入4 mL的二苯胺试剂。混合均匀后，将试管置于沸水中加热5min，等试管冷却后，观察并且比较两支试管中溶液颜色的变化。三、操作提示1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤地操作。加入酒精和用玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的
8、效果。四、课题成果评价1、是否提取出了DNA观察你提取的DNA颜色，如果不是白色丝状物，说明DNA中的杂质较多；二苯胺鉴定出现蓝色说明实验基本成功，如果不呈现蓝色，可能所提取的DNA含量低，或是实验操作中出现错误，需要重新制备。2、分析DNA中的杂质本实验提取的DNA粗制品有可能仍然含有核蛋白、多糖、RNA等杂质。3、不同实验方法的比较对于不同的实验方法，本课题可以采用分组的方法进行研究。首先选取不同的实验材料，其次同种材料还可以采用不同方法，从多方面比较实验结果，如DNA的多少、颜色，二苯胺显色的深浅等，看看哪种实验材料、哪种提取方法的效果更好。五、课题延伸本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物
9、，在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的DNA时，通常使用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）、十二烷基硫酸钠（SDS）或吐温等化学试剂。【教材答案】（一）旁栏思考题1为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。2加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。3如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放
10、不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。4此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质。5为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？答：用高盐浓度的溶液溶解DNA，能除去在高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。6方案二与方案三的原理有什么不同？答：方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开；方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。例题1下列关
11、于高中生物学实验的叙述，正确的是 A在制备果酒和果醋的实验过程中都要持续通入氧气 B分离土壤中不同种类的微生物需采用相同的稀释度 C将DNA粗提取后用二苯胺进行鉴定时需要进行水浴加热 D选择过氧化氢酶作为探究温度对酶活性影响实验的理想材科答案C例题2、下列实验材料、用具的改变，对实验结果影响最小的是用二苯胺试剂代替甲基绿染色观察的分布大蒜根尖代替洋葱根尖观察植物细胞有丝分裂D蒸馏水代替层析液进行叶绿体色素的分离答案.BDNA、RNA和蛋白质相关术语拓展顺式作用元件(cis-acting element)是指存在于基因旁侧序列中能影响基因表达的序列。顺式作用元件包括启动子、增强子、调控序列和可诱
12、导元件等，它们的作用是参与基因表达的调控。顺式作用元件本身不编码任何蛋白质，仅仅提供一个作用位点，要与反式作用因子相互作用而起作用。反式作用因子是指能直接或间接地识别或结合在各类顺式作用元件核心序列上参与调控靶基因转录效率的蛋白质，有时也称转录因子。大多数真核转录调节因子由某一基因表达后，可通过另一基因的特异的顺式作用元件相互作用，从而激活另一基因的转录。这种调节蛋白称为反式作用因子。反义脱氧核苷酸就是和mRNA链互补的脱氧核苷酸链。可以诱导mRNA的降解，导致基因的沉默。反义RNA是指与靶RNA(多为mRNA)具有互补序列的RNA分子，通过与靶RNA进行碱基配对结合的方式，参与基因的表达调控
13、。反义核酸是指能与特定mRNA精确互补、特异阻断其翻译的RNA或DNA分子。利用反义核酸特异地封闭某些基因表达，使之低表达或不表达，这种技术即为反义核酸技术。例题1基因转录出的初始RNA，经不同方式的剪切可被加工成翻译不同蛋白质的mRNA。某些剪切过程不需要蛋白质性质的酶参与。大多数真核细胞mRNA只在个体发育的某一阶段合成，不同的mRNA合成后以不同的速度被降解。下列判断不正确的是 A某些初始RNA的剪切加工可由RNA催化完成 B一个基因可能参与控制生物体的多种性状 CmRNA的产生与降解与个体发育阶段有关 D初始RNA的剪切、加工在核糖体内完成答案D例题2单细胞生物四膜虫转录形成的一种前体
14、RNA，在仅含核苷酸和纯化的前体RNA的溶液中，发生了RNA内部部分序列的有序切除。下列相关叙述不正确的是A该RNA的基本单位是核糖核苷酸 B该RNA的剪切可能是由自身催化的C该RNA剪切所需的酶是由自身翻译形成 D该RNA的剪切过程会受到温度、pH的影响答案C例题3.(18分)RNA具有多种功能，请回答下列与RNA有关的问题：(1) 在细胞生物中，DNA是遗传物质，RNA帮助其实现功能。其中，RNA能够帮助_酶合成子代DNA分子，实现DNA_的功能。另外，在遗传信息表达过程中，mRNA的功能是_,在翻译过程中，_也发挥了关键作用。(2) RNA 一般是单链分子，但也可遵循_原则形成部分双链,
15、再折叠产生复杂的空间结构。同时，与DNA相比，RNA中的五碳糖是_，其分子含有游离的羟基，这两个特点使RNA具有催化潜能。(3) 四膜虫体内存在具有剪切底物分子能力的某种RNA分子（核酶）。正常情况下，核酶需要Mg2+的辅助，在实验条件下让核酶处于Ca2 +环境中，进行RNA分子群体的选择实验，实验结果如图21所示。该结果表明四膜虫产生了在Ca2+环境中_的核酶，其原因是某些碱基被替换，发生了_,通过_适应环境的个体逐渐增多。答案（18分）（1）DNA聚合 传递遗传信息（携带遗传信息） 将遗传信息从DNA传递给蛋白质 tRNA和rRNA（转运RNA和核糖体RNA；tRNA；转运RNA） （2）
16、碱基互补配对 核糖 （3）催化活性更高（剪切能力更强） 基因突变 选择作用（人工选择；自然选择）例题4.（18分）凋亡抑制蛋白与肿瘤的发生、发展有关，科学家利用先天无胸腺的裸鼠，探究凋亡抑制蛋白基因的反义脱氧核苷酸链对肠癌肿瘤的抑制作用。请分析回答下列问题：（1）人工合成部分序列为5GGCAACACCCAT3反义脱氧核苷酸链，能够与凋亡抑制蛋白基因的_配对结合，使其分子构象发生改变，不能与_结合，抑制翻译。请写出凋亡抑制蛋白基因的部分序列：_。另外，人工合成的序列不应与人类其他基因的碱基序列相同，以避免该序列_。（2）将肠癌细胞置于含5%_的恒温培养箱中培养，对培养细胞用0.4%台盼蓝染料染色
17、，拒染率95%，说明绝大部分培养细胞为活细胞，其细胞膜具有_性。将拒染的细胞制成单细胞悬液，每只实验裸鼠接种等量的单细胞悬液于背部皮下，2周左右成瘤，成瘤率为100%。成瘤率为100%的原因是裸鼠_。（3）将若干只生长状况相同的裸鼠等分为两组，对皮下瘤体分别注射适量含_的生理盐水和等量的生理盐水，检测_，计算抑制率，抑制率=（1治疗组瘤重量/对照组瘤重量）100%。若抑制率_，则说明反义脱氧核苷酸链能够明显抑制裸鼠肠癌移植瘤的生长。答案. （除注明外，每空2分，共18分）（1）mRNA 核糖体 （见右图）干扰人类其他基因的表达（2）CO2（1分） 选择透过（1分） 无胸腺，失去特异性免疫，对接
18、种的肠癌细胞没有排斥反应（3）反义脱氧核苷酸链 瘤体重量 （更加）接近100%例题5（18分）为确定遗传信息从DNA传递给蛋白质的中间载体，科学家们做了如下研究。（1） 依据真核细胞中_位于细胞核内，而蛋白质合成在核糖体上这一事实，科学家推测存在某种“信使”分子，能将遗传信息从细胞核携带到细胞质中。（2） 对于“信使”有两种不同假说。假说一：核糖体RNA可能就是信息的载体；假说二：另有一种RNA（称为mRNA）作为遗传信息传递的信使。若假说一成立，则细胞内应该有许多_（填“相同”或“不同”）的核糖体。若假说二成立，则mRNA应该与细胞内原有的_结合，并指导蛋白质合成。（3） 研究发现噬菌体侵染
19、细菌后，细菌的蛋白质合成立即停止，转而合成噬菌体的蛋白质，在此过程中，细菌细胞内合成了新的噬菌体RNA。为确定新合成的噬菌体RNA是否为“信使”，科学家们进一步实验。 15NH4Cl和13C-葡萄糖作为培养基中的_和碳源来培养细菌，细菌利用它们合成_等生物大分子。经过若干代培养后，获得具有“重”核糖体的“重”细菌 将这些“重”细菌转移到含14NH4Cl和12C-葡萄糖的培养基上培养，用噬菌体侵染这些细菌，该培养基中加入32P标记的_核糖核苷酸为作为原料，以标记所有新合成的噬菌体RNA。 将上述被侵染后裂解的细菌进行密度梯度离心，结果如下图所示。由图可知，大肠杆菌被侵染后_（填“合成了”或“没有
20、合成”）新的核糖体，这一结果否定假说一。32P标记仅出现在离心管的_，说明_与“重”核糖体相结合，为假说二提供了证据。（4） 若要证明新合成的噬菌体RNA为“信使”，还需要进行两组实验，请选择下列序号填入表格。 新合成的噬菌体RNA与细菌DNA混合 将新合成的噬菌体RNA与噬菌体DNA混合 出现DNA-RNA杂交现象 出现DNA-RNA杂交现象 不出现DNA-RNA杂交现象组别实验处理预期结果12答案.（18分）（1）DNA（或“基因”）（1分）（2）不同（2分） 核糖体（2分）（3）氮源（1分） 蛋白质和核酸（2分） 尿嘧啶（2分） 没有合成（2分） 底部（1分） 新合成的噬菌体RNA（2分
21、）组别实验处理预期结果12 （4）如右表（3分）注：1组与2组可整组互换位置，但全部填写正确才可得分。例题6（18分）普通番茄细胞中含多聚半乳糖醛酸酶基因（用A表示），控制细胞产生多聚半乳糖醛酸酶，该酶能破坏细胞壁，使番茄易软化，不耐储藏。抗多聚半乳糖醛酸酶基因可以使番茄不再产生多聚半乳糖醛酸酶，从而使番茄长时间抗软化，容易储存和运输。下图是通过基因工程培育抗软化耐储藏番茄的过程及原理。请分析回答下列问题： （1）普通番茄（AA）也可以通过_育种的方法，最终获得基因型为aa（不能合成多聚半乳糖醛酸酶）的抗软化、耐储存的番茄。 （2）利用基因工程将目的基因导入植物细胞，目前采用最多的方法是_，该
22、方法中用到的目的基因载体是_，目的基因需插入到该基因载体的_上。 （3）将抗多聚半乳糖醛酸酶基因导入番茄细胞所需要的工具酶有_。 （4）图1中获得导入抗多聚半乳糖醛酸酶基因的番茄细胞，需要经过_技术获得转基因番茄，这个过程需要在 条件下进行，细胞先经脱分化形成_，再形成丛芽和根。 （5）根据图2分析抗多聚半乳糖醛酸酶基因能使番茄抗软化的原理是两个基因分别转录出的mRNA_，从而阻断了_过程。答案（除注明外，其余每空2分）（1）诱变 （2）农杆菌转化法 Ti质粒 T-DNA（3）限制酶和DNA连接酶（4）植物组织培养（1分） 无菌 愈伤组织（1分） （5）结合形成双链RNA 多聚半乳糖醛酸酶基因
23、的表达课题2 PCR扩增反应的操作第一节 PCR扩增反应的基本原理一、聚合酶链式反应（PCR）的基本构成PCR是聚合酶链式反应的简称，指在引物指导下由酶催化的对特定模板（克隆或基因组DNA）的扩增反应，是模拟体内DNA复制过程，在体外特异性扩增DNA片段的一种技术。PCR基本原理是以单链DNA为模板，4种dNTP为底物，在模板3末端有引物存在的情况下，用酶进行互补链的延伸，多次反复的循环能使微量的模板DNA得到极大程度的扩增。在微量离心管中，加入与待扩增的DNA片段两端已知序列分别互补的两个引物、适量的缓冲液、微量的DNA膜板、四种dNTP溶液、耐热Taq DNA聚合酶、Mg2+等。反应时先将
24、上述溶液加热，使模板DNA在高温下变性，双链解开为单链状态；然后降低溶液温度，使合成引物在低温下与其靶序列配对，形成部分双链，称为退火；再将温度升至合适温度，在Taq DNA聚合酶的催化下，以dNTP为原料，引物沿53方向延伸，形成新的DNA片段，该片段又可作为下一轮反应的模板，如此重复改变温度，由高温变性、低温复性和适温延伸组成一个周期，反复循环，使目的基因得以迅速扩增。因此PCR循环过程为三部分构成：模板变性、引物退火、热稳定DNA聚合酶在适当温度下催化DNA链延伸合成（见图）。1模板DNA的变性模板DNA加热到9095时，双螺旋结构的氢键断裂，双链解开成为单链，称为DNA的变性，以便它与
25、引物结合，为下轮反应作准备。变性温度与DNA中G-C含量有关，G-C间由三个氢键连接，而A-T间只有两个氢键相连，所以G-C含量较高的模板，其解链温度相对要高些。故PCR中DNA变性需要的温度和时间与模板DNA的二级结构的复杂性、G-C含量高低等均有关。对于高G-C含量的模板DNA在实验中需添加一定量二甲基亚砜（DMSO），并且在PCR循环中起始阶段热变性温度可以采用97，时间适当延长，即所谓的热启动。2模板DNA与引物的退火将反应混合物温度降低至3765时，寡核苷酸引物与单链模板杂交，形成DNA模板-引物复合物。退火所需要的温度和时间取决于引物与靶序列的同源性程度及寡核苷酸的碱基组成。一般要
26、求引物的浓度大大高于模板DNA的浓度，并由于引物的长度显著短于模板的长度，因此在退火时，引物与模板中的互补序列的配对速度比模板之间重新配对成双链的速度要快得多，退火时间一般为12min。3引物的延伸DNA模板-引物复合物在Taq DNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条与模板DNA链互补的新链。重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。延伸所需要的时间取决于模板DNA的长度。在72条件下，Taq DNA聚合酶催化的合成速度大约为4060个碱基/秒。经过一轮“变性-退火-延伸”循环，模
27、板拷贝数增加了一倍。在以后的循环中，新合成的DNA都可以起模板作用，因此每一轮循环以后，DNA拷贝数就增加一倍。每完成一个循环需24min，一次PCR经过3040次循环，约23h。扩增初期，扩增的量呈直线上升，但是当引物、模板、聚合酶达到一定比值时，酶的催化反应趋于饱和，便出现所谓的“平台效应”，即靶DNA产物的浓度不再增加。PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y（1X）n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示（Y）平均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。反应初期，靶序列DNA片
28、段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数。PCR扩增效率、DNA聚合酶的种类和活性、非特异性产物的竟争等因素都会影响平台期数。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。二、PCR反应的五个元素参与PCR反应的物质主要为五种：引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。1引物引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。引物设计有3条基本原则：首先引物
29、与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。引物的选择将决定PCR产物的大小、位置、以及扩增区域的Tm值。好的引物设计可以避免背景和非特异产物的产生，甚至在RNA-PCR中也能识别cDNA或基因组模板。引物设计也极大的影响扩增产量：若使用设计粗糙的引物，产物将很少甚至没有；而使用正确设计的引物得到的产物量可接近于反应指数期的产量理论值。当然，即使有了好的引物，依然需要进行反应条件的优化，比如调整Mg2+浓度，使用特殊的共溶剂如二甲基亚砜、甲酰胺和甘油。对引物的设计不可能有一种包罗万象的规则确保PCR的成功
30、，但遵循某些原则，则有助于引物的设计。（1）引物长度PCR特异性一般通过引物长度和退火温度来控制。引物的长度一般为15-30bp，常用的是1827bp，但不应大于38bp。引物过短时会造成Tm值过低，在酶反应温度时不能与模板很好的配对；引物过长时又会造成Tm值过高，超过酶反应的最适温度，还会导致其延伸温度大于74，不适于Taq DNA聚合酶进行反应，而且合成长引物还会大大增加合成费用。（2）引物碱基构成引物的G+C含量以4060%为宜，过高或过低都不利于引发反应，上下游引物的GC含量不能相差太大。其Tm值是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度，有效启动温度，一
31、般高于Tm值510。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为5580，其Tm值最好接近72以使复性条件最佳。引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在G+C富集序列区错误引发。（3）引物二级结构引物二级结构 kcal/mol或少于三个连续的碱基互补，因为此种情形的引物二聚体有进一步形成更稳定结构的可能性，引物中间或5端的要求可适当放宽。引物自身形成的发卡结构，也以3端或近3端对引物-模板结合影响更大；影响发卡结构的稳定性的因素除了碱基互补配对的键能之外，与茎环结构形式亦有很大的关系。应尽量
32、避免3末端有发卡结构的引物。（4）引物3端序列引物3末端和模板的碱基完全配对对于获得好的结果是非常重要的，而引物3末端最后5到6个核苷酸的错配应尽可能的少。如果3末端的错配过多，通过降低反应的退火温度来补偿这种错配不会有什么效果，反应几乎注定要失败。引物3末端的另一个问题是防止一对引物内的同源性。应特别注意引物不能互补，尤其是在3末端。引物间的互补将导致不想要的引物双链体的出现，这样获得的PCR产物其实是引物自身的扩增。这将会在引物双链体产物和天然模板之间产生竞争PCR状态，从而影响扩增成功。引物3末端的稳定性由引物3末端的碱基组成决定，一般考虑末端5个碱基的G。G值是指DNA双链形成所需的自
33、由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性，此值的大小对扩增有较大的影响。应当选用3端G值较低（绝对值不超过9），负值大，则3末端稳定性高，扩增效率更高。引物的3端的G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。需要注意的是，如扩增编码区域，引物3端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增特异性与效率。另外末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3端使用碱基A。（5）引物的5端引物的5端限定着PCR产物的长度，它对扩增特异性影响不大。因此，可以被修饰而不影响扩增的特异性。引物5端修饰包括：加酶切位点；标记生物素、荧光、地高辛、Eu
34、3+等；引入蛋白质结合DNA序列；引入突变位点、插入与缺失突变序列和引入一启动子序列等。对于引入一至两个酶切位点，应在后续方案设计完毕后确定，便于后期的克隆实验，特别是在用于表达研究的目的基因的克隆工作中。（6）引物的特异性引物与非特异扩增序列的同源性不要超过70%或有连续8个互补碱基同源，特别是与待扩增的模板DNA之间要没有明显的相似序列。2酶及其浓度Taq DNA多聚酶是耐热DNA聚合酶，是从水生栖热菌（Thermus aquaticus）中分离的。Taq DNA聚合酶是一个单亚基，分子量为94 000 Da。具有5-3的聚合酶活力，5-3的外切核酸酶活力，无3-5的外切核酸酶活力，会在3
35、末端不依赖模板加入1个脱氧核苷酸（通常为A，故PCR产物克隆中有与之匹配的T载体），在体外实验中，Taq DNA聚合酶的出错率为10-410-5。此酶的发现使PCR广泛的被应用。此酶具有以下特点：（1）耐高温，在70下反应2小时后其残留活性在90%以上，在93下反应2小时后其残留活性是仍能保持60%，而在95下反应2小时后为原来的40%。（2）在热变性时不会被钝化，故不必在扩增反应的每轮循环完成后再加新酶。（3）一般扩增的PCR产物长度可达2.0 kb，且特异性也较高。PCR的广泛应用得益于此酶，目前各试剂公司中开发了多种类型的Taq酶，有用于长片段扩增的酶，扩增长度极端可达40kb；有在常温
36、条件下即可应用的常温PCR聚合酶；还有针对不同实验对象的酶等。一典型的PCR反应约需的酶量为（总反应体积为50ml时），浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。3dNTP的质量与浓度dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以1M NaOH或1M Tris。HCl的缓冲液将其pH调节到，小量分装，-20冰冻保存。多次冻融会使dNTP降解。在PCR反应中，dNTP应为50200mmol/l，尤其是注意4种dNTP的浓度要相等（等摩尔配制），如其中任何一种浓度不同于其它几种时（偏高或偏
37、低），就会引起错配。浓度过低又会降低PCR产物的产量。dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。4模板（靶基因）核酸模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。SDS的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶K能水解消化蛋白质，特别是与DNA结合的组蛋白，再用有机溶剂（酚与氯仿抽）抽提除去蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸，该核酸即可作为模板用于PCR反应。一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消
38、化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于PCR扩增。模板DNA投入量对于细菌基因组DNA一般在110ng/ml，实验中模板浓度常常需要优化，一般可选择几个浓度梯度（浓度差以10倍为一个梯度）。在PCR反应中，过高的模板投入量往往会导致PCR实验的失败。5Mg2+浓度Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200mmol/l时，Mg2+浓度为l为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。一般厂商提供的Taq DNA聚合酶均有相应的缓冲液，而Mg2+也已添加，如果特殊实验应采用无
39、Mg2+的缓冲液，在PCR反应体系中添加一定量的Mg2+。三、PCR反应特点PCR反应具有以下特点：1强特异性PCR反应的特异性决定因素为：（1）引物与模板DNA特异性的结合；（2）碱基配对原则；（3）Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；（4）靶基因的特异性与保守性。其中引物与模板的正确结合是关键，引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。2高灵敏度PC
40、R产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克（pg=10-12g）量级的起始待测模板扩增到微克（mg = 10-6g）水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU（空斑形成单位）；在细菌学中最小检出率为3个细菌。3快速简便PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在PCR仪上进行变性退火延伸反应，反应一般在24小时完成。扩增产物常用电泳分析，操作简单易推广，如采用特殊PCR仪（荧光时时定量PCR仪）则可全程监测PCR反应的结果，故耗时将更短。4低纯度模板不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA粗制品及总RNA等均可作为扩增模板。可
41、直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等粗制的DNA扩增检测。例题1下列过程不属于克隆的是 A单个大肠杆菌形成单菌落 B壁虎断尾后长出新尾巴CPCR扩增抗除草剂基因 D利用柳树枝条繁殖植株答案B第二节 PCR扩增反应的实施一、PCR反应的条件PCR反应条件为温度、时间和循环次数。1温度与时间的设置基于PCR原理三步骤而设置变性-退火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链DNA在9095变性，再迅速冷却至4060，引物退火并结合到靶序列上，然后快速升温至7075，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物链沿模板延伸。对于较短靶基因（长度为100300bp时）可采用二
42、温度点法，除变性温度外、退火与延伸温度可合二为一，一般采用94变性，65左右退火与延伸（此温度Taq DNA酶仍有较高的催化活性）。（1）变性温度与时间：变性温度低，解链不完全是导致PCR失败的最主要原因。一般情况下，9394 lmin足以使模板DNA变性，若低于93则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。（2）退火（复性）温度与时间：退火温度是影响PCR特异性的较重要因素。变性后温度快速冷却至4060，可使引物和模板发生结合。由于模板DNA比引物复杂得多，引物和模板之间的碰撞结合机会远远高于模板互补链之间的碰
43、撞。退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。对于20个核苷酸，G+C含量约50%的引物，55为选择最适退火温度的起点较为理想。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值（解链温度）=4(G+C)2(A+T)复性温度=Tm值-(510)在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为3060sec，足以使引物与模板之间完全结合。（3）延伸温度与时间：Taq DNA聚合酶的生物学活性：7080，150核苷酸/S/酶分子；70，60核苷酸/S/酶分子；55，24核苷酸/S/酶分子；高于90时
44、，DNA合成几乎不能进行。（4）PCR反应的延伸温度一般选择在7075之间，常用温度为72，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定，一般1kb以内的DNA片段，延伸时间1min是足够的。34kb的靶序列需34min；扩增10kb需延伸至15min。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。2循环次数循环次数决定PCR扩增程度。PCR循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般的循环次数选在3040次之间，循环次数越多，非特异性产物的量亦随之增多。二、PCR扩增产物分析PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠，
45、必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。1凝胶电泳分析：PCR产物电泳，EB溴乙锭染色紫外仪下观察，初步判断产物的特异性。PCR产物片段的大小应与预计的一致，特别是多重PCR，应用多对引物，其产物片断都应符合预计的大小，这是起码条件。（1）琼脂糖凝胶电泳：通常应用12%的琼脂糖凝胶，供检测用。（2）聚丙烯酰胺凝胶电泳：610%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离效果比琼脂糖好，条带比较集中，可用于科研及检测分析。琼脂糖是从海藻中提取出来的一种多聚多糖，是由D-半乳糖和L-半乳糖以-1,3和-1,4糖苷键相连形成的线状高聚物。琼脂糖遇冷水膨胀，溶于热水成溶胶，冷却后成为孔径范围从50nm到大于200nm的凝胶。琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的标准方法。该技术操作简便快速，可以分辨用其它方法（如密度梯度离心法）所无法分离的DNA片段。当用低浓度的荧光嵌入染料溴化乙啶(E