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1、水质五日生化需氧量（BOD5）的测定稀释与接种法 HJ505-20091. 适用范围1.1 本方法适用于地表水、工业废水和生活污水中五日生化需氧量（BOD5）的测定。1.2 本方法的检出限为0.5mg/L，方法的测定下限为2 mg/L，非稀释法和非稀释接种法的测定上限为6mg/L，稀释与接种法的测定上限为6000mg/L。2. 术语和定义五日生化需氧量是指在规定条件下，微生物分解存在水中的某些可氧化物质，特别是分解有机物所进行的生物化学过程中消耗溶解氧的量。条件为（201）培养5天，分别测定样品培养前后的溶解氧，两者之差即为BOD5值，以氧的毫克/升表示。3. 方法原理将水样充满完全密闭的溶解
2、氧瓶中，在（201）的暗处培养5d4h或（2+5）d4 先在04的暗处培养2d，接着在（201）的暗处培养5d，即培养（2+5）d，分别测定培养前后水样中溶解氧的质量浓度，由培养前后溶解氧的质量浓度之差，计算每升样品消耗的溶解氧量。若样品中的有机物含量较多，BOD5的质量浓度大于6mg/L，样品需适当稀释后测定；对不含或含微生物少的工业废水，如酸性废水、碱性废水、高温废水、冷冻保存的废水或经过氯化出力等的废水，在测定BOD5时应进行接种，以引进能分解废水中有机物的微生物。当废水中存在难以被一般生活污水中的微生物以正常的速度降解的有机物或含有剧毒物质是，应将驯化后的微生物引入水样中进行接种。4.
3、 试剂和材料分析时，只采用公认的分析纯试剂和蒸馏水或同等纯度的水（在全玻璃装置中蒸馏的水或去离子水），水中含铜不应高于0.01mg/L，并不应有氯、氯胺、苛性碱、有机物和酸类。4.1 接种液取POLYSEED 胶囊1 粒溶于装有250ml稀释水的烧杯中。将烧杯置于磁力搅拌器上搅拌曝气1h。曝气结束，放置0.5h后倾出全部清液，将该清液置于磁力搅拌器上搅拌，此接种液最多能放置二天。其它获得接种液的途径见如下。4.1.1 未受工业废水污染的生活污水：化学需氧量不大于300mg/L，总有机碳不大于100 mg/L；4.1.2 含有城镇污水的河水或湖水；4.1.3 污水处理厂的出水；4.1.4 分析含
4、有难降解物质的工业废水时，在其排污口下游适当处取水样作为废水的驯化接种液。也可取中和或经适当稀释后的废水进行连续曝气，每天加入少量该种废水，同时加入少量生活污水，使适应该种废水的微生物大量繁殖。当水中出现大量的絮状物时，表明微生物已繁殖，可用作接种液。一般驯化过程需38天。4.2 盐溶液4.2.1 磷酸盐缓冲溶液将 8.5g磷酸二氢钾（KH2PO4）、16.6g磷酸氢二钾（K2HPO43H2O）、17.7g七水合磷酸氢二钠（Na2HPO4）和1.7g氯化铵（NH4Cl）溶于约500ml水中，稀释至1000ml 并混合均匀。此缓冲溶液的pH 应为7.2。4.2.2 七水合硫酸镁将 22.5g的七
5、水合硫酸镁（MgSO47H2O）溶于水中，稀释至1000ml 并混合均匀。4.2.3 氯化钙将27.5g的无水氯化钙（CaCl2）溶于水，稀释至1000ml 并混合均匀。4.2.4 六水合氯化铁将 0.25g六水合氯化铁（FeCl36H2O）溶解于水中，稀释至1000ml 并混合均匀。以上四种盐溶液在04可稳定保存6 个月。如有沉淀应弃去。4.3 稀释水取上述四种盐溶液（4.2.1、4.2.2、4.2.3和4.2.4）各1 ml，加入约1L水中，然后曝气2 小时以上，混合均匀，将此溶液置于20下恒温，确保溶解氧浓度不低于8mg/L。稀释水的BOD5值不得超过0.5mg/L。4.4 接种稀释水：
6、根据接种液的来源不同，每升稀释水（4.3）中加入适量接种液（4.1）：城市污水和污水处理厂出水加110ml，河水或湖水加10100ml，将接种液稀释水存放在（201）的环境中，当天配置当天使用。接种的稀释水pH值为7.2，BOD5应小于1.5mg/L。4.5 盐酸溶液，c(HCL)=0.5mg/L：将40ml 浓盐酸溶于水中，稀释至1000ml。4.6 氢氧化钠溶液，c(NaOH)=0.5mol/L：将20克氢氧化钠溶于水中，稀释至1000ml。4.7 亚硫酸钠溶液(0.025mol/L)：将1.575g亚硫酸钠溶于水中，稀释至1000ml。此溶液需现用现配。4.8 葡萄糖-谷氨酸标准溶液：将
7、葡萄糖（C6H12O6）和谷氨酸（HOOCH-CH2-CH2-CHNH2-COOH，优级纯）在130干燥1h，各称取150mg溶于水中，在1000ml容量瓶中稀释至标线。此溶液的BOD5为（21020）mg/L，现用现配。该溶液也可少量冷冻保存，融化后立即使用。4.9 丙烯基硫脲硝化抑制剂（1.0g/L）溶解 0.2g丙烯基硫脲于200ml水中，4保存，可稳定保存14 天。4.10 乙酸溶液，1+14.11 碘化钾溶液（100g/L），将10g碘化钾溶于水中，稀释至100ml。4.12 淀粉溶液（5g/L）：将0.5g淀粉溶于水中，稀释至100ml。5. 仪器和设备5.1 培养瓶细口瓶的容量在
8、200ml 之间，带有磨口玻璃塞，并具有供水封用的钟形口，最好是直肩的。5.2 培养箱：控制201 。5. 3 溶解氧测定仪：YSI-58。6. 干扰6.1 水样的 pH 若超出6.57.5 范围时，可用盐酸或氢氧化钠稀溶液调节pH 近于7，但不要超过水样体积的0.5。若水样的酸度或碱度很高，可改用高浓度的酸或碱进行中和。6.2 水样中含有重金属等有毒物质时，可使用经驯化的微生物接种液的稀释水进行稀释，或提高稀释倍数以减少毒物的浓度。6.3 含有少量游离氯的水样，一般放置12h，游离氯即可消失。对在短时间内不能消失的余氯，可加入适量亚硫酸钠溶液去除样品中存在的余氯和结合氯，加入的亚硫酸钠溶液的
9、量由下述方法确定。取已中和的水样100ml，加入乙酸溶液10ml、碘化钾溶液1ml，混匀，暗处静置5分钟。用亚硫酸钠溶液滴定析出的碘至淡黄色，加入1ml 淀粉溶液呈蓝色。再继续滴定至蓝色刚刚褪去，即为终点，记录所用亚硫酸钠溶液体积，由亚硫酸钠溶液消耗的体积，计算出水样中应加亚硫酸钠溶液的体积。6.4 一般污水处理厂的水样，应经过硝化池，含有大量硝化菌，可在每升稀释样品中加入2ml浓度为1.0g/L的烯丙基硫脲（ATU）（C4H8N2S）溶液以去除。6.5 从水温较低的水域或富营养的湖泊忠采集的水样，可遇到含有过饱和溶解氧，此时应将水样迅速升温至20左右，在不使满瓶的情况下，充分振摇，并时时开塞
10、放气，以赶出过饱和的溶解氧。从水温较高的水域或废水排放口取得的水样，则应迅速使其冷却至20左右，并充分振摇，使与空气中氧分压近平衡。6.6 一些气体和蒸汽如氯、二氧化硫、硫化氢、氨、氟、溴、碘能影响氧电极的测定，从而使测定含该类物质的水样的BOD 会形成五天前、后溶解氧倒大，此类干扰无法克服。7. 样品7.1 采集与保存样品需充满并密封于瓶中，置于25保存到进行分析时。一般应在采样后6h 之内进行检验。若需远距离转运，在任何情况下贮存皆不得超过24h。7.2 试样的制备7.2.1 pH 值调节若样品或稀释后样品pH 值不在6-8 范围内，应用盐酸溶液或氢氧化钠溶液调节其pH 值至6-8。7.2
11、.2 余氯和结合氯的去除若样品中含有少量余氯，一般在采样后放置1-2h，游离氯即可消失。对在短时间内不能消失的余氯，可加入适量亚硫酸钠溶液去除样品中存在的余氯和结合氯。7.2.3 样品均质化含有大量颗粒物、需要较大稀释信数的样品或经冷冻保存的样品，测定前均需将样品搅拌均匀。7.2.4 样品中有藻类若样品中有大量藻类存在，BOD:的测定结果会偏高。当分析结果精度要求较高时，测定前应用滤孔为1.6m的滤膜过滤，检测报告中注明滤膜滤孔的大小。6.2.5 含盐量低的样品若样品含盐量低，非稀释样品的电导率小于125S/cm时，需加入适量相同体积的四种盐溶液，使样品的电导率大于125S/cm。8. 分析步
12、骤8.1 样品的测定8.1.1 取样8.1.1.1 不经稀释水样（不接种）如遇到溶解氧含量较高，有机物含量较少的地表水时，可直接将其装满于培养瓶中待测。取样时注意不可摇动水样，取上层清液。8.1.1.2 稀释水样稀释倍数的确定：根据实践经验，提出下述计算方法，供稀释时参考。地表水（不接种）：由测得的高锰酸盐指数与一定的系数相乘，即求得稀释倍数，见下表。高锰酸盐指数（mg/L）系数200.5，0.7，1.0工业废水：由重铬酸钾法测得的COD 值来确定。稀释倍数见下表。当不能正确的选择稀释倍数时，一个样品做23 个不同的稀释倍数。BOD5的预估值mg/L稀释倍数612210305206010401
13、202010030050200600100400120020010003000500200060001000若试样中有微生物毒性物质，应配制几个不同稀释倍数的试样，选择与稀释倍数无关的结果，并取其平均值。试样测定结果与稀释倍数的关系确定如下：当分析结果精度要求较高或存在微生物毒性物质时，一个样品要做2 个以上不同的稀释倍数，每个试样每个稀释倍数做平行双样同时进行培养。测定培养过程中每瓶试样氧的消耗量，并画出氧消耗量对每一稀释倍数试样中原样品的体积曲线。若此曲线呈线性，则此试样中不含有任何抑制微生物的物质，即样品的测定结果与稀释倍数无关；若曲线仅在低浓度内呈线性，取线性范围内稀释比的试样测定结果
14、计算平均BOD5值。将水样振摇均匀，根据稀释倍数确定取样体积。每个样品中加入2ml 接种液，用虹吸法加稀释水至瓶颈处待测。8.1.2 测定（待测样品应尽快测定）将电极置于加满稀释水的培养瓶中。开启电极上的搅拌开关，即可测定水样中溶解氧。测定顺序为：空白标准样品样品。待显示的读数稳定后，该读数为水样中的溶解氧值。测定完毕，旋紧培养瓶塞，确保瓶口有封瓶水，盖上瓶盖。8.1.3 培养将培养瓶放于培养箱中，并在暗中放置5 天。达到需要培养的5天时间时，取出培养瓶。8.1.4 5天后溶解氧测定测定剩余溶解氧值，测定顺序同8.1.28.2 空白试验在培养瓶中加入2ml 接种液，加稀释水满瓶后待测。本试验同
15、样品同时进行，其BOD5不能大于1.5mg/L。9. 结果计算9.1 被测定溶液若满足以下条件，则能获得可靠的测定结果。培养 5 天后：剩余 DO2mg/L；消耗 DO2mg/L。若不能满足以上条件，一般应舍掉该组结果。9.2 计算9.2.1 不经稀释接种直接培养的水样BOD5（mg/L）=C1C2式中：C1-水样在培养前的溶解氧浓度，mg/L；C2-水样经5 天培养后，剩余溶解氧浓度，mg/L。9.2.2 经稀释接种后培养的水样BOD5mg/L=C1-C2-(B1-B2)f1f2式中：B1-稀释水在培养前的溶解氧，mg/L；B2-稀释水在培养后的溶解氧，mg/L；f1-稀释水在培养液中所占比
16、例；f2-水样在培养液中所占比例。若有几种稀释比所得数据皆符合9.1 所要求的条件，则几种稀释比所得结果皆有效，以其平均值表示检测结果。10. 质量保证和质量控制10.1 仪器设备测定要在仪器的有效鉴定周期内进行，以保证检出限、灵敏度、定量测定范围满足方法要求。定期进行期间核查报告，以保证测量结果的准确度、精密度等指标符合计量部门要求。10.2 实验环境以上过程须在恒温状态下完成，实验室室内温度应控制在201范围内。10.3 方法检出限在方法正式应用前要按照环境监测分析方法标准制订技术导则（HJ/T168）中8.2.1 的规定进行方法捡出限的测定，测定值不能大于方法给定的值。10.4 空白实验
17、空白样品分试剂空白和全程空白，全程空白样品的浓度测定值不能大于方法检出限，而且平行双份测定值的相对差值不应大于50，每批样品最少要有2个空白样。10.5 平行样每批样品要有10的平行样测定结果，其相对偏差的计算参照地表水和污水监测技术规范（HJ/T91-2002）10.5.2的公式，控制指标式样品含量和基体不同一般为1030。10.6 标准样品在两个取好标准样品的培养瓶中各加入2ml 接种液，加稀释水满瓶后测定。得到BOD5应在该标准样品批号范围之内，否则，应检查接种稀释水是否适用以及并应检查分析人员的技术。本试验空白与试验样品同时进行。10.7 数据处理数据的整理和修约及异常值的判断和处理等
18、按照水和废水监测分析方法（第四版）的相关内容进行。11. 精密度和准确度非稀释法实验室间的重现性标准偏差为0.100.22mg/L，再现性标准偏差为0.260.85mg/L。稀释法和稀释接种法的对比测定结果重现性标准偏差为11mg/L，再现性标准偏差为3.722mg/L。12. 注意事项12.1 水中有机物的生物氧化过程，可分为二个阶段。第一阶段为有机物中的碳和氢氧化生成二氧化碳和水，此阶段称为碳化阶段。第二阶段为含氮物质及部分氨氧化为亚硝酸盐及硝酸盐，称为硝化阶段。一般测定水样BOD5时，硝化作用很不显著或根本不发生硝化作用。12.2 玻璃器皿（培养瓶）应彻底洗净。先用自来水和蒸馏水清洗三遍
19、，再将其放入超声波清洗器中彻底清洗1h。12.3 在两个或三个稀释比的样品中，凡消耗溶解氧大于2mg/L 和剩余溶解氧大于2mg/L 时，计算结果时，应取其平均值。若剩余的溶解氧小于1 mg/L，甚至为零时，应加大稀释比。溶解氧消耗量小于2mg/L，有两种可能，一是稀释倍数过大；另一种可能是微生物菌种不适应，活性差，或含毒物质浓度过大。这时可能出现在几个稀释比中，稀释倍数大的消耗溶解氧反而较多的现象。12.4 水样稀释倍数超过100 倍时，应预先在容量瓶中用水初步稀释后，再取适量进行最后稀释培养。12.5 培养前的溶解氧值应在8.009.00mg/L之间。否则，采用充气或曝气法使初始溶解氧值处于在8.00mg/9.00mg/L之间。12.6 在加入稀释水的过程中，应将虹吸管紧挨培养瓶口内壁，使稀释水沿着瓶壁均匀注入瓶内，此过程中应避免产生气泡。流速不可过慢，以防止空气中的氧份进入水中影响测定。