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1、一、实验名称小鼠染色体标本的制备、观察二、实验目的1、熟悉动物生殖细胞减数分裂过程及各个时期特点。2、掌握小鼠睾丸减数分裂标本的制作方法。3、学习染色体的染色和观察过程。三、实验原理1、染色体 染色体是细胞内具有遗传性质的遗传物质深度压缩形成的聚合体，易被碱性染料染成深色，所以叫染色体（染色质）。染色体的分析往往是选择细胞处于活跃增殖状态，或者经过各种处理后细胞进入分裂的动物组织。2、细胞分裂及其观察 细胞的有丝分裂可以大体分为五个阶段：前期、前中期、中期、后期、末期，每一个时期都有它特定的形态和行为特征。 分裂前期：染色体凝集，间期细长、弥散分布的线性染色质，经过进一步螺旋化、折叠和包装等过
2、程，逐渐变短变粗，形成光镜下可辨的早期染色体结构。随着染色质的凝集，核仁缩小消失。分裂极确立: 复制了的中心体分离，向两极移动。纺锤体装配：从中心体形成星体微管和极微管。 前中期：核膜崩解；纺锤体完成装配，前期星体的形成和向两极的运动标志着纺锤体组装的开始。随着核膜的解体，由纺锤体两极发出的一些星体微管可进入“核”内，通过其正极端捕获染色体，形成动粒微管。至此，纺锤体基本完成组装；染色体整列，在动粒微管的作用下，染色体列队到赤道板。 中期：染色体排列在赤道板上，也是该实验的重点观察时期。 后期：姐妹染色单体分离并向细胞两极移动。后期A，动粒微管变短，牵动染色体向两极运动；后期B，极微管长度增加
3、，两极之间的距离逐渐拉长。 末期：两子细胞核形成，染色体去浓缩，核膜重建，核仁重现。 在正常动物体内，骨髓和睾丸是处于不断分裂的组织。给动物注射一定剂量的秋水仙素即可使许多处于分裂的细胞停滞于中期，然后采用常规空气干燥法制备染色体，即可得到大量可分析的染色体标本。在动物实验时，可在取材前经腹腔注射有丝分裂抑制剂，一般常用秋水仙素，这此方法对于动物的核型分析是非常有用的。本方法简便、可靠，不需要经体外培养和无菌操作，易于推广。因此睾丸和骨髓细胞是用于动物细胞遗传学研究很好的材料。3、睾丸睾丸是雄性生殖细胞发育和成熟的部位，是产生精子的器官。睾丸内的曲细精管从外到内一次分布有精原细胞、初级精母细胞
4、、次级精母细胞、精子细胞以及形态渐变中的精子。取睾丸将曲细精管内的细胞冲出后固定，然后制片染色，可以观察到动物生殖细胞减数分裂染色体的不同时相。如果提前给动物腹腔注射秋水仙素溶液，可以抑制生殖细胞的正常分裂，增加中期分裂相细胞的数目，此方法可用来进行减数分裂过程中染色体的计数及观察。睾丸染色体标本的制备，可用来检测雄性个体生殖细胞是否受到周围环境污染或是否发生病变，是小型动物生殖学常规实验。4、倒置染色法在玻璃板上用废旧玻璃板作支架，使得标本载玻片的正面朝下放置到支架上，在玻璃板和标本载玻片之间滴加Giemsa染液，这样，一可以节省染料，二可以防止染料快速挥发，三可以防止染色颗粒沉淀影响观察。
5、在操作时应注意，多个样品同时染色应摆放紧密，不要有间隙。滴染液时应尽量慢，不要有气泡，以免部分染色体不着色，影响观察。三、实验材料1、材料 68周龄，2030g的雄性小鼠2、试剂（1）0.85%氯化钠溶液（2）0.02%秋水仙素溶液，4保存（3）0.4%KCl溶液（4）卡诺氏固定液 无水乙醇：无水乙酸=3:1（5）1/15 mol/L的磷酸缓冲液（pH=6.8）（6）Giemsa 染液3、器材离心机、镊子、解剖盘、载玻片、玻璃板、小烧杯、普通光学显微镜、解剖剪、铜网、滴管、离心管等。四、实验步骤染色体标本的制备：1、取雄性小鼠以每克体重4注射秋水仙素，经1416小时后，断头法杀死小鼠，取出睾丸
6、用生理盐水（0.9%的NaCl）洗去血污。2、放入装有1ml 0.3%KCl液的小烧杯中剪碎，至溶液呈乳白色，使细胞分散。用铜网过滤到刻度离心管中，再加0.3%KCl液至4ml。3、37静置30分钟，进行低渗处理。（整个过程控制在50分钟内）1000 r/min 离心8分钟。弃上清液，加入2ml甲醇冰醋酸固定液（3：1），并用吸管至管底吹气，轻轻打散细胞，固定8分钟。4、再以8001000 r/min离心8分钟。弃上清液，加1ml固定液，再制成细胞悬液，固定5分钟。5、取洁净的低温预冷载玻片，距载片1015cm高度滴下23滴细胞悬液（使细胞分散），从载玻片一边向另一边轻轻吹气，并同时轻轻敲打载
7、片，以使细胞均匀分布和促使染色体展开。6、将玻片放置在标本盒中空气干燥。染色体标本的观察：1、染色：倒置染色法用 Giemsa液染色20 30分钟，细水冲洗玻片背面，擦去多余染液，干燥。2、镜检：低倍镜下寻找分散良好、染色适中的位于分裂中期的分裂相，高倍镜下观察染色体形态并计数。五、实验结果31个38个40个 40个六、结果分析本次实验，结果极为模糊，较为失败。1、在自己制片中，没有明显的呈现出“V”或“U”形的染色体集合，有的是蓝色背景上模糊的染色体棒状，大多数细胞已经成为碎片。分析原因可能有：（1）离心过程中，离心速度过快，导致细胞紧密的黏在一起，很难吹散。（2）在吹散细胞的过程中，力度太
8、大，导致细胞破裂，染色体流出。（3）在摔碎细胞时，滴加高度太小，细胞没有摔碎。（4）在桌面上敲打细胞时，力度太小，仍有细胞没有破裂。2、在观察师兄师姐的装片时，发现有的染色体数目多于40条，有的少于40条，分析其原因可能是： （1）染色体数目多于40 不同的细胞具体太近，染色体混合，导致数目过多； 细胞分布太密集，导致染色体及其他细胞的染色体上下重合，在显微镜下无法分辨清晰；（2）染色体数目少于40 吹打过程中，细胞轻微破裂，部分染色体流失； 摔打过程中，细胞也有可能发生部分染色体被摔离的现象； 在倒置染色、清洗染液的过程中，部分染色体被洗掉； 染色过程中，有的染色体没有着色，无法观察到。七、
9、注意事项1、自加入0.3%KCl始，至离心，整个过程应注意控制时间，尽量保持在45-50min之内。低渗处理是为了使细胞变大易于观察，但低渗时间过长会使细胞破裂。2、破碎睾丸时，可先加入少量KCl，方便剪碎。破碎差不多后再加入剩下的KCl，先加入的KCL量一定要少，否则不易剪碎。3、操作过程中应注意动作不可过大，因为低渗处理的细胞体积变大，更易破碎。4、滴片前应尽量轻轻混匀悬液，使细胞分开。5、滴片时，应保证玻片在低温状态下。6、采用倒置染色法，可以防止染液蒸发，同时使染色更加均匀。八、讨论1、固定的目的是什么？（1）迅速防止细胞死亡后的变化，如自溶、腐败等，尽量保持生长状态结构。（2）使细胞
10、中的蛋白质、脂肪等成分转变为不溶性物质，以保持生前的形态； （3）使组织内各种物质成分产生不同的折光率，便于观察和鉴定；（4）使不同组织成分对燃料有不同的亲和力。便于染色；（5）防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。2、秋水仙素抑制细胞分裂的原理是什么？纺锤丝的作用是将分裂的染色体拉向细胞两极，然后细胞中间自动形成细胞板，最后变成两个细胞。使用秋水仙素后，纺锤丝的合成被抑制，尤其是动粒微管被破坏。在后期染色单体分裂后，没有纺锤丝，不能被拉向细胞两极，细胞就不分裂，停留在分裂中期阶段。 九、拓展1、染色体相关疾病 （1）21三体综合征（又称先天愚型或唐氏综合征）患者核型多数为47。主要临床
11、特征是智力低下，发育迟缓，宽眼距，外眦上斜，内眦赘皮，上腭弓高耸，常张口弄舌，掌纹呈通贯手和轴三叉夹角大于65，拇趾球区胫侧弓状纹，某些患者伴有先天性心脏病。（2）特纳氏综合症（Turner）常见的女性性染色体异常疾病。常见的核型是45+X，少数是嵌合体，出生率1/25001/5000。身材矮小，原发性闭经，性幼稚，蹼颈，后发际低，宽乳距，肘外翻是本病的主要临床特征。（3）克氏综合征（Klinefelter Syndrome）常见的男性性染色体异常疾病，典型的核型为47+XXY。表型特征有睾丸发育不全。身材修长，乃足跟至趾骨间的距离增长所致。男子乳腺发育、阴毛呈女性型分布，阴茎及睾丸均小。严重
12、者伴有智力迟钝、隐睾及尿道下裂等。本病发生率较高，在新生活婴中的发生率是1.42.9%，是男性不育症中常见的一种。（4）爱德华综合征Edwards染色体异常为18三体。表型特征有智力低下、小头、前额窄、枕部突、小颌且张口范围小，腭弓高窄、低位耳、肾畸形、肌张力增高及手紧握等。（5）帕陶综合征染色体异常为13三体。表型特征中有中枢神经系统发育缺陷，呈前脑无裂畸形。前额小呈斜坡样，头皮后顶部常有缺损。视网膜发育不良，切片镜下观察可见菊形团形成。严重智力低下，唇裂及腭裂、多指等。中性粒细胞核上有过多的突起。（6）猫叫综合征（5P-综合征）染色体异常为5号染色体短臂部分或全部缺失。表型特征有：婴儿时期
13、哭声似猫叫，因而得名，可有喉器小和会厌小等喉部发育异常。严重智力低下，小头、圆形脸、眼距宽、眼裂下斜、耳位低、内眦赘皮，贯手等多种畸形，约一半患者有先天性心脏病，智力低下，生活能力差，常早亡。4P-综合征类似5P-综合征，但常常更为加重，还可呈尿道下裂，腭裂、严重的精神以及运动障碍，癫痫发作等，属少见病例。（7）费城染色体（Ph）因首见于美国费城（Philadelphia）而命名。系其22号染色体部分长臂接到9号染色体长臂的一种易位。为慢性粒细胞白血病可见到的特殊的染色体异常，但在其他少数急性白血病中偶可见到。这也是恶性细胞染色体变异中唯一已被公认确实具有恒定变化的染色体变异。目前，针对多种染
14、色体疾病的医疗手段还不完善，但是染色体疾病作为一种明显的遗传性疾病，可以通过优生手段进行预防。比如：对娩出过染色体病患儿的经产妇及反复发生自然流产和死产的孕妇施行宫内诊断；注意环境保护，加强职业性防护监测；开展遗传咨询、积极推行优生法，做好婚姻和生育的医药遗传指导，避免，提倡适龄生育和计划生育等。2、植物细胞染色体观察方法 （1）实验植物和试剂 大蒜根尖、 0.02%秋水仙素；改良苯酚品红染液；卡诺氏固定液，1N盐酸；70%酒精；95乙醇；85乙醇；蒸馏水 （2）实验方法和步骤 取材 先将大蒜浸泡若干小时，然后转入一个垫有湿润滤纸的培养皿中，置25恒温培养箱中萌发，待幼根长至12cm时，于上午
15、911时剪下根尖。 预处理 将剪下的根尖放进装有0.02%秋水仙素溶液的烧杯中，浸泡处理34小时。固定 将经过预处理或没有预处理的材料，放到卡诺氏固定液中固定 （固定液的量约为材料的10倍，要求一个容器中所装的材料不能太多，温度不能太高）。固定224h后分别在95 和85乙醇中各30min ，再转入70%酒精中，于4冰箱内保存，保存时间最好不超过二个月。 去壁解离 取固定好的各种植物根尖，倒去固定液，用蒸馏水漂洗23次，放入1N HCl溶液中60水解812min，再用蒸馏水洗净。适度的水解分离使材料呈白色微透明，状似豆腐，以解剖针能轻轻压碎为好。 后低渗 用吸管小心吸去解离液，用蒸馏水慢慢冲洗
16、35次，最后停留在蒸馏水中浸泡2030min左右。 染色 将根尖放在载玻片中央，用刀片将根冠和伸长区切除，只留乳白色的分生区，用镊子或解剖针将材料轻轻捣碎。滴上一滴改良苯酚品红染液，染色815min后，盖上盖玻片。 压片 在盖玻片上面铺上吸水纸，固定好盖玻片，用拇指垂直压片，然后用铅笔的橡皮头轻轻均匀地同一个方向敲打盖片，至肉眼见材料呈雾状即可。敲打时，铅笔应垂直于玻片，勿使盖片移动。 镜检观察 先在低倍镜下观察染色和细胞分散的情况，后用油镜（滴加香柏油）找到染色体轮廓清晰、染色适中、分散而不重叠的分裂中期。仔细观察染色形态和计数，对典型分裂相细胞进行显微摄影。 对照组：不经过秋水仙素进行预处理这一步，其他的步骤相同。观察大蒜根尖细胞的染色体。