微生物操作指导书.doc

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1、睢县中医院检验科微生物实验室操作指导书（第一版） 编制： 冯海珍 审核： 邱艳杰 韩露 批准： 周凤 生效日期：二零一六年十二月一日睢县中医院医院检验科微生物室1. 细菌室人员岗位职责.22. 细菌室工作人员管理规定及报告时间 .43. 标本采集及保存要求 74. 显微镜检查法操作规程 95. 细菌室标本操作流程116. 细菌室形态检查操作规程137. 细菌生化反应鉴定及其他实验操作规程188. 细菌的接种与培养方法操作规程239. 支原体培养、鉴定、计数及药敏操作规程2510. 血液感染病原体检验操作规程2711. 中枢神经系统感染病原体检验操作规程2912. 创伤和外科感染病原体检验操作规

2、程3113. 下呼吸道感染病原体检验操作规程3214. 消化道感染病原体检验操作规程3415. 尿路感染病原体检验操作规程3516. 脓汁及病灶分泌物细菌检验操作规程3617. 生殖系统标本的处理3818. 超广谱内酰胺酶（ESBLs）检测 4019. 消毒灭菌效果监测.4120. 环境卫生学监测.4221. 采样及检查原则 .4322. 各部位的消毒.48文件编码JYK-SOP001文件名称细菌室人员岗位职责执行时间（第一版）2016.12.01细菌室人员岗位职责1、上班后先搞好室内卫生、核查各个培养箱、冰箱的工作温度是否在设定的范围内，并做好记录。2、检查各种培养基及试剂的库存量，做好需配

3、制培养基或购买试剂的交班工作。3、接收样本：核对各样本号与申请单联号是否一致，如不一致马上与病房联系以便作出相应的处理，如退单或重送样本等，并做好联系情况的记录。核查各送检样本是否符合要求。 痰液样本：先看外观、再直接涂片镜检，低倍镜下见白细胞25个，10上皮细胞25个，上皮细胞 10 每个视野，为合格痰液。 无菌体液样本：检查各种无菌体液样本的盛放器皿是否符合要求。 容易干燥的样本：对一些容易干燥的样本如大便、咽拭子、脓液拭子、泌尿生殖道 拭子等是否已经干燥。对不符合要求的样本必需与临床联系，以便作出相应处理，方法如联号不符的样本。做好记录。对符合的样本进行原始单的登记。7、样本编号：对符合

4、的样本作出编号，普通细菌培养：痰液、咽拭子、血液增菌培养、尿液、胸、腹水、脑脊液、胆汁、脓液、泌尿生殖道拭子、大便致病菌培养。在各种培养基上及申请单上编号的同时均需明确标明接种日期。样本接种： 血液、骨髓、腹水、关节液等：血平板、Mac 痰液、咽拭子、脑脊液分别接种：血平板、巧克力平板、麦康凯平板； 尿液接种：血平板、巧克力平板、Mac；各种无菌体液、脓液、泌尿生殖道分泌物接种：血平板；巧克力平板；大便致病菌：接种SS平板、麦康凯平板；分泌物的淋球菌培养接种：巧克力平板；支原体培养+药敏，按说明书接种支原体专用培养瓶；对以上接种样本的当前编号应记录于登记本上。此外对痰液在接种的同时应对其沉渣进

5、行革兰染色，如有细菌和或何种细菌为主即刻的向临床发出第一级初级报告，并做好记录。8、对一些不适合用仪器检测药敏的细菌，改用标准的K.B法进行检测。碰到异常的耐药模式应及时上报组长，如碰到耐万古霉素的葡萄球菌、粪肠球菌，耐泰能的大肠埃希菌、克雷伯菌属、肠杆菌属等。并加做特殊的药敏纸片，并改用纸片法加以比较。9、对一些特殊细菌，如嗜血杆菌、棒状杆菌、李斯特菌属等用相应的鉴定条进行鉴定，用相应的手工实验进行耐药性检测，操作严格参照说明书。10、对所完成的各种发向临床的微生物学报告单，要认真检查，并给上行政班的人员核查，确认一切无错后，方能发出。11、做好菌种的保存，对一些难得的菌株、标准菌株等要定期

6、移种，一般二周一次，并做好移种记录。定期做好本室所用各种鉴定药敏试条的质控，一周一次(或每个批号一次)，做好记录。12、检查本岗位各种培养基及试剂的库存量，做好需配制培养基或购买试剂的交班工作。对需购买的试剂、平板、培养基、染色液以及需配置的培养基应及时交班。13、工作完成后注意对工作台面进行消毒、室内进行消毒。离开科室前交好班。二、行政上班人员1、上班后首先搞好室内卫生。2、将临床室的培养标本拿回。3、对有新到岗的实习或进修人员时，应认真交代本岗位的一切事宜并且认真作好带教工作。4、涂片染色：抗酸染色严格按照操作规程，漂浮法涂片痰液样本，胸腹水、尿液、脑脊液等取沉淀涂厚片，自然干燥后固定，按

7、说明书染色后镜检。5、临床标本细菌或门诊标本G-双球菌涂片，应用滚动式涂片法从波片一端涂向另一端，反复几次，火焰固定后进行革兰染色。6、每天必须消毒平板、基础培养基等用于常规医院感染监测或K.B药敏试验；另外根据具体情况即时准备好各种中和剂、无菌瓶等，对48小时的空气培养出报告，同时注意是否有致病菌、菌落数是否超标。7、检查本岗位各种培养基及试剂的库存量，做好需配制培养基或购买试剂的交班工作。对需购买的试剂、平板、培养基、染色液以及需配置的培养基应及时交班。8、工作完成后注意对工作台面进行消毒、室内进行消毒。文件编码JYK-SOP003文件名称标本采集及保存要求执行时间（第一版）2016.12

8、.01标本采集及保存要求1、总则：用于细菌培养的标本在收集时应注意严格无菌操作和及时送检，检测后标本应妥善保存。2、临床标本的采集2.1、下呼吸道分泌物(痰液)令患者早上起床后用清水濑口，不要刷牙，立即从下部呼吸道咳出第一口痰，吐在无菌塑料痰盒中，及时送检。2.2、尿液(中段尿)护理人员协助采取中段尿约3ml入无菌塑料盒中，及时送检。2.3、粪便：取有粘液、脓血部分的粪便置无菌塑料盒中及时送检。2.4、眼、耳、鼻、喉拭子：将棉拭子沾取少许无菌生理盐水(如沾取的太多，可在无菌生理盐水瓶壁上挤去多余的水份)，然后采取可疑部位的分泌物，倒悬于无菌塑料盒中，及时送检。2.5、脓液：用沾有生理盐水的棉拭

9、子沾取脓液，要尽量多取一些，然后将棉拭置于无菌塑料盒中，及时送检。2.6、血液：2.6.1、凡怀疑菌血症和败血病的患者，采血培养时，应尽量在未使用抗菌素前采血，如已使用抗菌素，应尽量选择抗菌素在体内浓度最低时采血，应在病人第二次使用抗菌素之前采集血培养标本。当然在病人发热或寒颤时采集也可。2.6.2、成人每次采血510m1，小儿采血23ml；2.6.3、严格消毒病人采血部位和血培养瓶口，抽一定量血液后，无菌注入血培养瓶内，轻轻摇匀，2.6.4、从抽血到接种入瓶，动作要快，防止血液凝固，同时要及时送检。2.7、穿刺液：胸腹水、心包液、关节腔液、鞘膜积液，严格无菌抽取后，注入含肝素抗凝的无菌试管中

10、，轻轻颠倒试管10余次，使肝素与穿刺液混匀达到抗凝的目的，或直接无菌注入血培养瓶内及时送检。2.8、胆汁：由专科医生以无菌方法取引流液10m1注入无菌塑料盒内。2.9、脑脊液：以无菌方法取脑脊液35ml，置无菌试管内，常温保存送检，如只做培养可直接无菌注入血培养瓶内，及时送检。2.10、生殖器官标本：阴道、子宫颈及前列腺等分泌物应由医师采集，收集于无菌塑料盒内送检。如疑为淋病奈瑟菌感染，做培养检查时，采集的标本应床旁接种并及时放入孵箱培养。2.11、烧伤标本：以无菌棉拭子直接采取多个部位创面的脓汁分泌物放入无菌塑料盒中。2.12、支原体(解脲、人型)培养+药敏的标本采集2.12.1、支原体对干

11、、热抵抗力差，标本采集后应尽快接种支原体运送培养基送检。2.12.2、男性：用细的无菌棉拭子沾取无菌盐水少许深入尿道口内22.53、临床标本的保存3.1、细菌室标本原则上要求及时送检、及时处理，不得保存。文件编码JYK-SOP004文件名称显微镜检查法操作规程执行时间（第一版）2016.12.01显微镜检查法操作规程显微镜检查是细菌鉴定工作中的一重要手段，有助于细菌的初步鉴别，同时对下一步鉴定工作起着重要的指导作用。有时通过形态学检查可得到初步诊断，如痰中的抗酸杆菌和泌尿生殖道分泌物中的淋病奈瑟菌等。显微镜检查有不染色标本检查法和染色标本检查法两种。1、不染色标本的检查：不染色标本主要用于检查

12、细菌的动力及运动状况。1.1、压滴法：用接种环取细菌悬液2环，置于清洁载玻片中央，覆上盖玻片，于高倍镜下观察。制片时菌液要适量，不可有气泡，不可外溢。1.2、悬滴法：取洁净的凹窝载玻片及盖玻片各1块，将凹孔四周的平面上涂上一层凡士林，取一环菌液置盖玻片中央，将凹窝载玻片的凹面向下，对准于盖玻片的液滴上，然后迅速翻转玻片，用小镊子轻压盖玻片使之与凹孔边缘粘紧。镜下观察时先低倍后高倍，不可压碎盖玻片。有动力的细菌可见细菌从一处移到另一处，无动力的细菌呈布朗运动而无位置的改变。螺旋体由于菌体纤细、透明，需用暗视野显微镜观察其形态、活动。2、染色标本检查法；通过对标本的制片及染色，能观察细菌的形态、大

13、小、排列、染色特性以及荚膜、芽胞、异染颗粒等结构，有助于细菌的初步鉴定。2.1、快速革兰染色法2.1.1、操作见试剂说明书2.1.2、结果：革兰氏阳性菌呈紫色，革兰氏阴性菌呈红色。2.1.3、注意事项：染色关健在于涂片和脱色，涂片不宜过厚，固定不宜过热，脱色不宜过度，菌龄为1824小时为佳。2.2、抗酸染色法2.2.1、操作见试剂说明书2.2.2、结果：抗酸杆菌呈红色。2.2.3、注意事项：每一张玻片只能涂一份标本且不能在染色缸中染色，以免造成不同标本间的交互污染从而导致阴阳性结果混淆，脱色时间宁长勿短，至无红色液体流下为止。2.3、阿尔培异染颗粒染色法：2.3.1、初染：涂片上滴加第一液染剂

14、(甲苯胺蓝和孔雀绿的乙醇溶液)，染35分钟，水洗。2.3.2、复染：第二液染剂(碘化钾溶液)染1分钟，水洗。自然干燥后镜检。2.3.3、结果：菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色。2.3.4、注意事项：玻片要清洁，染料需新鲜配制，无沉淀物。注意与标本中的其他杂质相区别。3、压片镜检，主要观察细菌在组织中的分布。4、墨汁负染镜检：背景着色而菌体不着色的染色法，用以观察新型隐球菌的宽厚荚膜等。5、鞭毛染色镜检，观察细菌有否鞭毛、鞭毛的位置、鞭毛的数量，在非发酵菌的鉴定中是一项重要的指标。6、暗视野镜检：观察一些较微小且有一定结构的微生物，如钩端螺旋体的钩状及螺旋的形态等。7、制动试验的直接镜检，在标本加入

15、抗血清，观察动力是否被抑制，如霍乱弧菌的制动试验等。8、荧光镜检，用标有荧光素的物质与检材中的微生物特异结合产生荧光的特点而对微生物作出鉴定。文件编码JYK-SOP005文件名称细菌室标本操作流程执行时间（第一版）2016.12.01细菌室标本操作流程1、标本的接受1.1、标本接受的时间：原则上全天任何时间均可。1.2、标本的接受：接受标本者要认真核对标本的数量、标本与检验单要求是否相符以及标本的质量等。1.3、把接受的标本编号。2、临床标本的接种2.1、检验目的为细菌培养+药敏试验的各临床标本的培养基选择2.1.1 标本类型 培养基 血 血培养瓶 中段尿 血平板、麦康凯平板、巧克力平板 脑脊

16、液 血培养瓶、血平板、巧克力平板 穿刺液 血培养瓶、血平板、麦康凯平板、巧克力平板 胆汁 血平板、巧克力平板、麦康凯平板 呼吸道标本 血平板、麦康凯平板、巧克力平板 粪便标本 SS平板、MAC平板和血平板 病灶分泌物 血平板、巧克力平板、麦康凯平板2.1.2、生殖器标本根据临床医生所写的检验项目接种相应的平板及操作：淋球菌培养接种淋球 菌平板；念珠菌培养接种沙保罗培养基：支原体培养则按支原体培养的操作规程操作；作普通细菌培养，则接种血平板和巧克力平板；衣原体抗原检测的按衣原体抗原检 测的操作规程进行检验。2.2、接种的方法：中段尿标本无菌取10ul，在血平板的中间做垂直划线，然后分离划线。其他

17、际本做分区划线。2.3、检验目的为找抗酸杆菌的按找抗酸杆菌的操作规程进行检验。3、所接种的平板必须写上标本的编号和接种的日期，然后根据要求进行培养。4、标本的培养条件、温度、时间 平板 培养条件、温度、C02浓度、时间 血平板 孵箱、3537、1824小时巧克力平板 孵箱、3537、1824小时 淋球菌平板 孵箱、3537、1824小时 沙保罗平板 孵箱、2831、2436小时 其他的平板 孵箱、3537、1824小时5、根据生长在平板上的细菌菌落形态、菌落涂片、染色、镜检等来综合判断细菌形态和染色性质，按各属鉴定的作业指导书进行各菌属的常规鉴定及药敏试验。6、结果的报告6.1、确认细菌鉴定及

18、药敏试验结果后，进行检验验单结果报告的存盘、打印。7、对各类细菌培养标本除特殊要求外，我室一般操作完后按要求进行无害化处理。文件编码JYK-SOP006文件名称细菌的形态检查操作规程执行时间（第一版）2016.12.01细菌的形态检查操作规程一、不染色标本的检查压滴法和悬滴法。主要用于检查生活状态下的细菌的动力及运动状况。将特制好的标本置于显微镜载物台中央，先以低倍镜观察，再用高倍镜观察。结果：有鞭毛的细菌呈穿梭似流星状运动(有明显的方向性)：无鞭毛的细菌呈布朗运动(只在原地颤动而无位置的改变)。二、细菌染色标本的检查染色的第一步是制作涂片。菌液涂片时，用接种环沾取菌液点在载玻片上，标本可直接

19、在玻片上涂布。菌落涂片时，先取生理盐水l滴，置玻片上，用接种针挑取菌落，在盐水中涂布。涂片时必须注意应轻轻操作。猛烈的动作会改变菌细胞原有的排列形式，或造成细菌鞭毛脱落，影响结果的准确性。制备的涂片应自然干燥，并经火焰固定，固定温度不宜过高，以玻片背面接触手背不烫为准，否则可能使细胞形态改变。将固定后的涂片进行染色。2.1、革兰染色本染色是最基本的染色法，可用于标本涂片或菌落涂片。染色结果将细菌分为革兰阳性(紫色)和革兰阴性(红色)两类。2.1.1、试剂(1) 结晶紫溶液 A液： 结晶紫 29 95乙醇 20ml B液： 草酸铵 0.8g 蒸馏水 80ml需在用前24h将A液、B液混合，过滤后

20、装入试剂瓶内备用。 (2) 碘液 碘 lg 碘化钾 2g 蒸馏水 300ml碘与碘化钾混合并研磨，加入几毫升水，使其逐渐溶解，然后研磨，继续加入少量蒸馏水至完全溶解。最后补足水量。也可用少量蒸馏水，先将碘化钾完全溶解，再加入碘片，待完全溶解后，加水至300ml。(3) 脱色液：95乙醇。(4) 复染液 A 贮存液：沙黄 2.5g 95%乙醇 100ml B 应用液： A液 10ml 蒸馏水 90ml染色方法： (1)涂片经火焰固定，加结晶紫液染1 min，清水冲去染液。 (2)加碘液染I min，水洗。 (3)加脱色液，不时摇动约1030s，至无紫色脱落为止，水洗。 (4)加复染液，染30s，

21、水洗。 (5)干后镜检。2.2、抗酸染色抗酸染色直接用于痰标本时，可以适当增加标本涂片的厚度，以提高检出率。染厚涂片时，须掌握复染色时间。如果背景过深，影响镜检。奴卡菌及放线菌可呈弱抗酸性，取培养菌落涂片染色时，呈现两种现象，视野中有些菌细胞阳性，另外一些则阴性；有时同一个菌体上，红色的深浅亦有不同，观察时应予注意。抗酸染色有两种常用方法：口碱性复红法又称萋纳(ZiehlNeelsen)法。 口 荧光染料金胺O法(也称金胺O罗丹明B法)。2.2.1 碱性复红染色法试 剂 (1)萋纳石炭酸复红溶液 碱性复红乙醇饱和溶液 10ml 5石炭酸溶液 90ml (2)、脱色剂 * 浓盐酸 3ml 95%

22、乙醇 97ml (3)、复染液(吕弗勒美蓝液) 美蓝乙醇饱和溶液 30ml 10氢氧化钾 0.1m1 蒸馏水 100ml染色方法 (1)、涂片经火焰固定，加石炭酸复红溶液，徐徐加热至有蒸汽出现，切不可沸腾。染5 min(若染色奴卡菌需要加长时间)，水洗。(2)、加脱色剂，不时摇动玻片至无红色脱落为止，水洗。(3)、加复染液，染0.5l min，水洗。(4)、干后镜检。分枝杆菌呈红色，背景为蓝色。*：奴卡菌、放线菌标本染色时，脱色剂改用2硫酸水溶液。2.2.2、金胺0一罗丹明B染色法染剂1、罗丹明B液：罗丹明B 0.1g加蒸馏水100ml：2、0.1金胺O液：金胺0 0.1g加蒸馏水95ml，再

23、加入纯石炭酸5ml，混匀：3、 3盐酸酒精；4、稀释美蓝液：吕弗勒美蓝液10ml，加蒸馏水90ml，混匀。方法1、涂片固定后加第1液3090s。2、弃去第l液后加第2液染15min。3、用第3液脱色l2min，水洗。4、滴加第4液染30s，水洗，待干，荧光抗酸菌在暗背景中呈现金黄色荧光。2.3、鞭毛染色用于观察菌体上有无鞭毛、鞭毛在菌体上的位置以及鞭毛的数量。在细菌鉴定中，特别是非发酵菌的鉴定中很重要。鞭毛染色可以直接从平板上挑选菌落，或从斜面上刮菌苔涂片即可，但必须注意动作尽量轻，以免鞭毛从菌体上脱落。菌落应是生长在营养较好的琼脂平板(如血平板、营养琼脂)上的过夜培养物。不可采用有抑制剂的选

24、择性培养基，如中国蓝、麦康凯、SS琼脂等。观察鞭毛时，应耐心寻找整个涂片上的菌细胞，因为并不是涂片上每个细菌细胞上的鞭毛特性及数量都一样，应以鞭毛数量最多的菌细胞为准。 鞭毛染色(改良Ryu法) 试剂 A液： 5石炭酸 10ml 鞣酸 2g 饱和硫酸铝钾液 10ml B液： 结晶紫酒精饱和液 应用液：A液10份，B液l份，混合，室温存放。 染色方法(1)、玻片的处理：要求用新的载玻片。用前须在95酒精中浸泡24小时以上。用时从酒精中取出，以干净纱布擦干后使用。(2)、在玻片上滴蒸馏水两滴。一张玻片上可同时制2个涂片。(3)、用接种环挑取血平板上菌落少许，将细菌点在玻片上的蒸馏水滴的顶部。一般只

25、需点一下，仅允许极少量细菌进入水滴，不可搅动，以免鞭毛脱落。(4)、玻片置室温自然干燥。(5)、滴加染液于玻片上，染色。(6)、约1015min后，用蒸馏水缓慢冲去染液。冲洗时应避免使染液表面的金属光泽液膜滞留在玻片上，影响镜检。(7)、玻片自然干燥后，镜检时应从涂片的边缘开始，逐渐移向中心。寻找细菌较少的视野，鞭毛容易观察。细菌密集的地方，鞭毛被菌体挡住，不易观察。2.4、异染颗粒染色用于白喉棒状杆菌染色，异染颗粒可明显地被显示出来。标本直接涂片或细菌涂片均可用改良阿伯特(A1bert)法染色来观察异染颗粒。试 剂甲液： 甲苯胺蓝 0.15g 孔雀绿 0.2g 冰醋酸 lml 95乙醇 2m

26、l 蒸馏水 100ml将各染料先溶于乙醇，然后加入水与冰醋酸的混合液中，充分混匀。静置24h后过滤备用。乙液： 碘 2g碘化钾 3g 蒸馏水 300ml先将碘化钾加少许蒸馏水(约2m1)，充分振摇，待完全溶解，再加入碘，使完全溶解后， 加蒸馏水至300ral。染色方法(1)、涂片经火焰固定，加甲液，染35 min。水洗。(2)、滴加乙液，染l min。水洗。(3)、干后镜检，菌体呈绿色，异染颗粒呈蓝黑色。2.5、墨汁荚膜染色用于观察菌体有无荚膜结构，借此鉴定某些菌，如新型隐球菌。传统的方法是用印度墨汁，但目前国内无售。常规工作可以用墨汁或墨水代替，但应注意颗粒不能太粗，否则影响观察结果。有人用

27、5黑色素(nigrosin)水溶液做染料，效果较好。试 剂印度墨汁或5黑色素水溶液。染色方法将标本与1滴染色液在载玻片上混合，加上盖玻片，轻轻压一下，使标本混合液变薄。在低倍镜下寻找有荚膜的菌细胞。找到后，转换高倍镜确认。文件编码JYK-SOP007文件名称细菌生化反应鉴定及其它试验操作规程执行时间（第一版）2016.12.01细菌生化反应鉴定及其它试验操作规程1、氧化一发酵试验(OF试验)原理：细菌在分解葡萄糖的过程中，必须有分子氧参加的，称为氧化型。可以进行无氧降解的，称为发酵型(发酵型细菌在有氧无氧的条件下均能分解葡萄糖)。不分解葡萄糖的细菌称为产碱型。方法：将待检细菌同时穿刺接种两支H

28、L培养基，其中一支培养基滴加无菌石蜡(或其它矿物油)，高度不少于lcm。35，48小时或更长。结果：两支培养基均无变化为产碱型或不分解糖型；两支培养基均均产酸为发酵型。若仅不加石蜡的培养基产酸为氧化型。应用：主要用于肠杆菌科细菌与非发酵细菌的鉴别，前者均为发酵型，而后者均为氧化型或产碱型。也可用于葡萄球菌与微球菌问的鉴别。2、半乳糖苷酶(ONPG)试验原理：细菌产生半乳糖苷酶分解邻-硝基酚D半乳糖苷(无色)邻硝基酚(黄色)结果：菌悬液呈现黄色为阳性反应，一般在20-30分钟内显色。应用：主要用于迟缓发酵乳糖菌株的快速鉴定。3、七叶苷分解试验原理：有的细菌可将七叶苷分解成葡萄糖和七叶素，七叶素与

29、培养基中的枸橼酸铁的二价铁离子反应，生成黑色的化合物。结果：培养基变黑为阳性，不变色为阴性。应用：主要用于D群链球菌与其它链球菌的鉴别。前者为阳性，后者为阴性。也可用于革兰阴性菌与厌氧菌的鉴别。4甲基红试验原理：糖代谢分解葡萄糖丙酮酸甲酸、乙酸、乳酸等，加入甲基红。 红色结果：呈现红色为阳性，橘红色为弱阳性。黄色为阴性。应用：主要用于鉴别大肠杆菌与产气杆菌，前者阳性，后者阴性。此外肠杆菌科中变形杆菌属、沙门菌属、枸橼酸杆菌属和志贺菌属等阳性，而肠杆菌属、哈夫尼亚菌属则为阴性。5、VP试验原理：分解葡萄糖丙酮酸，脱羧乙酰甲基甲醇，在碱性环境中，氧化二乙酰，与精氨酸中的胍基红色化合物。结果：在数分

30、钟内出现红色为阳性，如无红色出现且于35C4h后仍如故者即为阴性。应用：本试验与甲基红试验一起使用，因为前者阳性的细菌，后者通常为阴性。6、吲哚(靛基质)试验原理：细菌分解蛋白胨中的色氨酸吲哚(靛基质)吲，加入对位二甲基苯甲醛红色玫瑰吲哚。结果：于两者液面接触处出现红色为阳性，无色为阴性。应用：主要用于肠杆菌科的鉴定。6、尿素分解试验原理：尿素酶(尿酶)，分解尿素产生大量的氨，培养基变碱。结果：培养基呈碱性，使酚红指示剂变红为阳性，不变色为阴性。应用：主要用于肠杆菌科中变形杆菌属细菌的鉴定，奇异变形杆菌、普通变形杆菌为阳性，克雷伯菌属、枸椽酸菌属、雷氏普罗威登菌和摩根摩根菌为阳性。7、苯丙氨酸

31、脱氨酶试验原理：苯丙氨酸脱氨酶使脱去氨基苯丙酮酸，加入Fecl3绿色.结果：出现绿色为阳性，应立即观察结果，延长会引起退色。应用：主要用于肠杆菌科的鉴定，变形杆菌属、普罗威登斯菌和摩根摩根菌均为阳性。肠杆菌科其它菌均为阴性。8、氨基酸脱羧酶试验原理：氨基酸脱羧一胺，CO2培养基变碱，黄色紫色。结果：对照管应呈黄色，测定管呈紫色(指示剂为溴甲酚紫)为阳性。应用：主要用于肠杆菌科细菌的鉴定。9、氧化酶试验原理：氧化酶是细胞色素呼吸酶系统的最终呼吸酶。首先使细胞色素C氧化一氧化对苯二氨氧化。粉红色深红色紫黑色结果：细菌在与试剂接触10秒内呈紫色为阳性。为保证结果准确性，应作阴、阳性对照。应用：主要用

32、于肠杆菌科与假单胞菌的鉴别，前者为阴性。后者为阳性。10、过氧化氢酶试验(触酶试验)原理：具有过氧化氢酶的细菌，能催化过氧化氢生成水和新生态氧，继而形成分子氧出现气泡。试剂：3过氧化氢溶液方法：取菌置于洁净的试管或玻片上，然后滴加3过氧化氢数滴；或直接滴加3过氧化氢于不含血液的细菌培养基中，立即观察结果。结果：有大量气泡产生为阳性。不产生气泡为阴性。应用：革兰阳性球菌中，葡萄球菌和微球菌均阳性。而链球菌均阴性。1l、硝酸盐还原试验原理：包括两个过程：一是在合成过程中，硝酸盐还原为亚哨酸盐和氨。再由氨转化为氨基酸和细菌内其它含氮化合物。二是在分解代谢过程中，硝酸盐或亚硝酸盐代替氧作为呼吸酶系统中

33、的受氢体，能使硝酸盐还原的细菌从哨酸盐中获得氧而形成亚硝酸盐和其它还原性产物。结果：出现红色为阳性。若加入试剂后无颜色变化反应，可能是硝酸盐没有被还原，试验阴性。硝酸盐被还原为氨和氮等其它产物而导致假阴性，这时应加入少许锌粉，如出现红色则表明试验确实为阴性。若仍不产生红色，表明为试验为假阴性。应用：本试验在细菌鉴定中应用广泛。12、凝固酶试验原理：致病性葡萄球菌可产生两种凝固酶，一种是结合凝固酶，结合在细胞壁上，可用玻片法测出。另一种是分泌至菌体外的游离凝固酶，可用试管法测出。方法：玻片法：取人血浆和盐水各一滴，分别置于洁净的玻片上，挑取被检菌分别与血浆和盐水混合。试管法：取2支试管，各加05

34、m1人血浆，挑取被检菌和阳性对照菌分别加入人血浆中混匀。于37水浴3-4小时。结果：玻片法以血浆中有明显的颗粒出现而盐水中无自凝现象判为阳性；试管法以血浆凝固为阳性。应用：作为鉴定葡萄球菌致病性的重要指标，也是葡萄球菌鉴别时常用的一个试验。13、CAMP试验原理：B群链球菌能产生CAMP因子，可促进葡萄球菌的-溶血素溶解红细胞活性，因此在两菌的交界处溶血力增加。出现矢形(半月形)的溶血区。结果：在两划线交界处出现箭头样的溶血区为阳性应用：在链球菌中，只有B群链球菌CAMP试验阳性。14、O/129抑菌试验原理：O/129(二氨基喋啶)对弧菌属、邻单胞菌属细菌有抑制作用，而对气单胞菌无抑制作用。

35、方法：将待检菌均匀涂布于碱性琼脂平板上，镊取O/129纸片(含药40ug)贴于平板上，35，18-24h，观察结果。结果：出现抑菌环为敏感，无抑菌环为耐药应用：弧菌属、邻单胞菌属对O129敏感，而气单胞菌属耐药15、杆菌肽试验原理：A群链球菌对杆菌肽几乎全部敏感，而其它链球菌绝大多数对其耐药。16、奥普托欣试验原理：几乎所有的肺炎链球菌对Optochin敏感，而Optochin对其它链球菌则无抑制作用17、H2S试验原理：有些细菌能分解培养基中的含硫氨基酸(如胱胺酸、半胱胺酸)产生硫化氢，硫化氢遇到铅或亚铁离子，则生成黑色的硫化铅或硫化铁。结果：培养基变黑为阳性，不变为阴性。应用：主要用于肠杆

36、菌科属或种的鉴定。18、触酶试验(过氧化氢酶试验)试剂：3 oAH202溶液，置棕色瓶内于4阴暗处保存。方法：先挑取固体培养基上的菌落，置于洁净的玻片上，然后滴加3过氧化氢溶液12滴。静置之，lmin内产生大量气泡的为阳性，不产生气泡的为阴性。19、葡萄球菌凝固酶和凝聚因子试验葡萄球菌凝固酶试验被广泛地用于常规鉴定金黄色葡萄球菌与其他葡萄球菌。试管法凝固酶试验称为葡萄球菌凝固酶，玻片法为检测凝聚因子。1凝聚因子试验：取1滴蒸馏水于洁净的玻片上，用接种环挑取待检菌一环置于蒸馏水中，制成浓的菌悬液，无自凝现象。然后加一环家兔血浆混合，10s内观察结果，出现明显细菌凝块为阳性，否则为阴性。如超过10s可出现假阳性，有10一15金黄色葡萄球菌呈假阴性，因此必须用试管法验证凝聚因子试验。操作过程中的注意点： (1)10s内观察结果。 (2)必须制备浓厚的均匀菌悬液。 (3)用EDTA抗凝的兔血浆为最好。 (4)加血浆后不要再混搅，以免细菌凝块分散变小。 (5)生长在高盐培养基上的菌落可