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1、自噬性程序性细胞死亡研究进展博士生资格考试综述（2005年10月24日）自噬性程序性细胞死亡研究进展陈丽娜北京大学基础医学院免疫学系分子免疫实验室北京大学人类疾病基因研究中心前言程序性细胞死亡（Programmed Cell Death, PCD）是有机体在漫长的进化过程中发展起来的细胞自杀机制，在清除无用的、多余的或癌变的细胞，维持机体内环境稳态方面发挥重要作用。程序性细胞死亡调控机制的失调与多种疾病的发生发展相关，如神经变性性疾病、自身免疫病、恶性肿瘤、衰老、病原微生物感染、肌细胞功能失调等。多数学者将细胞的死亡形式分为凋亡性程序性细胞死亡(Apoptosis)、自噬性程序性细胞死亡(Au
2、tophagy)和细胞坏死(Necrosis)三种类型1。凋亡性程序性细胞死亡也称为型程序性细胞死亡。对细胞凋亡的形态学、参与分子和调控机制的研究由来已久。凋亡细胞的典型形态学特点表现为：细胞皱缩、体积缩小；部分细胞器、核糖体和核碎片被细胞膜包裹形成凋亡小体，从细胞表面出芽脱落，最后被具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬；磷脂酰丝氨酸外翻；细胞核染色质浓缩、边缘化、染色质DNA断裂。凋亡过程重要的参与分子有：凋亡促进分子半胱-天冬氨酸蛋白酶（Caspases）家族、Bax/Bak、细胞色素C等；凋亡抑制分子IAP2、Bcl-2家族分子等。凋亡信号通过细胞膜受体途径（Fas/FasL、T
3、NF/TNFR等）或线粒体途径传导，依次激活起始Caspases (Caspase-8或Caspase-9) 和下游信号转导通路的关键分子执行Caspase (Caspase-3), 启动凋亡3,4。另外，凋亡形式的程序性细胞死亡也可以Caspases非依赖的方式进行。细胞坏死是细胞对外界损伤刺激的一种非程序性死亡方式，其形态学特点明显异于凋亡，常伴随炎症的发生。近年来，一种新的程序性细胞死亡方式-自噬性程序性细胞死亡吸引了越来越多细胞生物学家的注意。人们将Autophagy称为型程序性细胞死亡，这种形式的细胞死亡表现为细胞浆中出现大量包裹着细胞浆和细胞器的空泡结构和溶酶体对空泡内成分的降解。
4、自噬在细胞的生长、发育和疾病发生中起着重要的作用。随着参与自噬性程序性细胞死亡途径的关键分子的鉴定成功，我们对其分子机制、生理功能和在病理过程中的作用有了进一步的了解。2004年12月出版的科学杂志预测对自噬性程序性细胞死亡的研究会成为2005年科技领域的六大热点之一，且排在第一位。一份全新的国际性杂志Autophagy已在2005年4月份出版，有关自噬研究的第一次国际性会议也已于2005年4月在意大利召开。估计正如当年对细胞凋亡的研究一样，对自噬的关注很快会在生命科学领域形成一个新的研究热点。本综述将就哺乳动物细胞自噬（Autophagy）与自噬性程序性细胞死亡的形态学特点、关键分子加工机制
5、、信号转导、与细胞凋亡的关系、在病理生理过程中的作用和其研究方法展开讨论。一、Autophagy 的形态学特点和分类Autophagy 是凋亡之外的第二种程序性细胞死亡方式，在进化过程中高度保守，从酵母、果蝇到脊椎动物和人都可以找到参与autophagy 的同源基因。相对于主要降解短半衰期蛋白质的泛素-蛋白酶体系统，细胞的自噬被认为是参与绝大多数长半衰期蛋白质的降解5,6。在形态学上，即将发生autophagy 的细胞胞浆中出现大量游离的膜性结构，称为前自噬泡（Preautophagosome）。前自噬泡逐渐发展，成为由双层膜结构形成的空泡，其中包裹着变性坏死的细胞器和部分细胞浆，这种双层膜被
6、称为自噬泡（Autophagosome）。自噬体双层膜的起源尚不清楚，有人认为其来源于粗面内质网，也有观点认为来源于晚期高尔基体和其膜囊泡体，也有可能是重新合成的。自噬泡的外膜与溶酶体膜融合，内膜和其包裹的物质进入溶酶体腔，被溶酶体中的酶水解。此过程使进入溶酶体中的物质分解为其组成成分（如蛋白质分解为氨基酸，核酸分解为核苷酸），并被细胞再利用，这种吞噬了细胞内成分的溶酶体被称为自噬溶酶体（Autophagolysosome or Autolysosome）。尽管在进化过程中，底物运送到溶酶体的机制发生了变化，autophagy 本身却是一个进化保守的过程。与其他蛋白水解系统相似，溶酶体参与了细
7、胞内组成成分的持续性转运和翻新（尤其是长半衰期蛋白质的分解和再利用）。在autophagy 过程中，除可溶性胞浆蛋白之外，像线粒体、过氧化物酶体等细胞器或细胞器的一部分，如高尔基体和内质网的某些部分都可被溶酶体所降解；最近，有研究发现，酵母细胞核的某些区域也可通过autophagy 途径被清除7-10。根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞autophagy 可分为三种主要方式 11：大自噬（Macroautophagy）、小自噬（Microautophagy）和分子伴侣介导的自噬 (Chaperone-mediated autophagy)。在大自噬形式的autophagy中，
8、细胞浆中可溶性蛋白和变性坏死的细胞器被非溶酶体来源的双层膜结构所包裹，即前面提到的自噬泡（Autophagosome），并由自噬泡将其携带到溶酶体中降解加工；小自噬形式的autophagy与之不同，溶酶体膜自身变形，包裹吞噬细胞浆中的底物。在大自噬和小自噬两种形式的autophagy中，底物被其所包裹的膜性结构带至溶酶体后，均发生膜的迅速降解，进而释放出其中的底物，使溶酶体中水解酶对底物进行有效水解，保证了细胞对底物的再利用。分子伴侣介导的自噬首先由胞浆中的分子伴侣Hsc73识别底物蛋白分子的特定氨基酸序列 (如KFERQ-样模体) 并与之结合，分子伴侣-底物复合物与溶酶体膜上的受体Lamp2
9、a (Lysosome-associated membrane protein 2a) 结合后，底物去折叠；溶酶体腔中的另外一种分子伴侣介导底物在溶酶体膜的转位，进入溶酶体腔中的底物在水解酶作用下分解为其组成成分，被细胞再利用 12。因此，自噬可被认为是真核细胞中广泛存在的降解/再循环系统。哺乳动物细胞三种形式autophagy的比较参见图一和表一。二、Autophagy发生过程的分子机制目前至少已经鉴定出27种参与酵母autophagy的特异性基因，另外还有50多种相关基因。其命名从最初称为APG，AUT和CVT，现已被统一命名为酵母自噬相关基因ATG (AuTophaGy-related)
10、。哺乳动物自噬相关基因也已由最初的Atg/Apg/Aut/Cvt，统一命名为Atg。哺乳动物自噬基因的命名与酵母相似，但也有个别差异，如酵母的ATG8在哺乳动物称为LC3，酵母的ATG6在哺乳动物则称为Beclin 1（表二）。随着研究的深入，许多酵母中autophagy相关基因的同源物均已在哺乳动物中找到，并分离鉴定成功，这说明autophagy是一个进化保守的过程，其分子机制从酵母到哺乳动物十分相似。1. 参与自噬体形成的两个泛素样蛋白系统和其作用1.1. 参与自噬体形成的两个泛素样蛋白系统 在哺乳动物autophagy的自噬泡形成过程中，由Atg3, Atg5, Atg7, Atg10,
11、 Atg12 和LC3 （Microtubule-associated protein 1 light chain 3, MAP1-LC3）参与组成的两条泛素样蛋白加工修饰过程：Atg12-结合过程和LC3修饰过程起着至关重要的作用13（图二）。Atg12-结合过程与前自噬泡（Preautophagosome）的形成相关，而LC3修饰过程对自噬泡（Autophagosome）的形成必不可少。Atg12首先由E1样酶Atg7活化，之后转运至E2样酶Atg10，最后与Atg5结合，形成自噬体前体（Autophagosomal precursor）。LC3前体（ProLC3）形成后，首先加工成胞浆可
12、溶性形式LC3-I，并暴露出其羧基末端的甘氨酸残基。同样，LC3-I也被Atg7活化，转运至第二种E2样酶Atg3，并被修饰成膜结合形式LC3-II。LC3-II定位于前自噬体和自噬体，使之成为自噬体的标志分子。一旦自噬体与溶酶体融合，自噬体内的LC3-II即被溶酶体中的水解酶降解。LC3是酵母autophagy 相关基因ATG8的类似物。哺乳动物细胞内源性Atg5和Atg12主要以结合形式存在；而胞浆可溶性LC3-I和膜结合型LC3-II的比例在不同组织和细胞类型变化很大。哺乳动物细胞autophagy 过程中两条泛素样加工修饰过程可以互相调节，互相影响。Atg5 基因缺陷的鼠胚胎干细胞缺乏
13、Atg12-Atg5复合物，其LC3-I到LC3-II的修饰同时受到影响 14。在哺乳动物细胞HEK293中，Atg3除作用于其底物LC3, GATE-16 (Golgi-associated ATPase enhancer of 16 kDa, 分子量为16kDa的高尔基体相关ATP酶增强子) 和GABARAP（-amminobutyric acid receptor associated protein, -氨基丁酸受体相关蛋白）外，还与Atg12和Atg12-Atg5复合物相互作用 15,16。虽然HEK293细胞中单独超表达游离的Atg12促进了LC3-I到LC3-II的修饰，过多At
14、g12-Atg5复合物的存在却可抑制上述修饰过程 15。在Atg7存在的情况下，HEK293细胞超表达哺乳动物Atg3可促进Atg12-Atg5复合物的形成16。这些研究结果提示Atg3与Atg12和Atg12-Atg5复合物的相互作用在Atg12结合和LC3修饰两条泛素化修饰过程中起重要作用。哺乳动物Atg10除结合Atg12外，还与LC3相互作用17。Atg10与Atg12形成E2样底物中间物，但不与LC3结合。在Atg7存在下，超表达Atg10还可促进LC3-I到LC3-II的修饰 17。酵母和哺乳动物的Atg7以同源二聚体形式存在 18,19。这些结果说明Atg12-结合和LC3-修饰
15、两条泛素样修饰过程相互偶联，Atg10和Atg3两种E2样酶在调控autophagy上述两条泛素样修饰过程中发挥重要作用。1.2. 泛素化修饰在自噬泡形成过程中的作用哺乳动物细胞autophagy自噬泡的形成过程与Atg12-结合和LC3修饰两条泛素样修饰过程息息相关。如图三所示20：在自噬泡形成的早期阶段（Preautophagosome），由Atg12-Atg5-Atg16L形成的复合物即与其外膜结合，这种结合一方面促进了自噬泡的伸展扩张，使之由开始的小囊泡样、杯样结构逐渐发展为半环状、环状结构；另一方面，Atg5复合物与自噬泡膜的结合还促进了LC3向自噬泡的募集。Atg5复合物在膜上的定
16、位决定膜的弯曲方向，膜向着背对Atg5复合物的方向延伸。当双层膜结构的自噬泡即将形成环状闭合结构或刚刚闭合时，Atg5复合物便从膜上脱离下来，只留下膜结合形式的LC3-II定位于自噬泡膜上。因此，LC3-II含量的多少与自噬泡数量的多少成正比。当哺乳动物细胞发生autophagy时，细胞内LC3的含量和LC3-I向LC3-II的转化均明显增加。因此，通过检测细胞内LC3-II的含量变化，可以方便地判断细胞状态，判断其autophagy是被诱导还是被抑制。Atg5复合物对自噬泡的形成至关重要，有报道称破坏小鼠胚胎干细胞Atg5基因导致自噬泡形成缺陷 14；基因突变的Atg5丧失了与Atg12结合
17、的能力，同时也导致自噬泡延伸障碍。Atg5-Atg12-Atg16L复合物为同源四聚体组成的大蛋白复合物，分子量约为800kDa。正常哺乳动物细胞中绝大多数Atg5、Atg12和Atg16L以复合物形式存在，说明Atg5-Atg12-Atg16L复合物的存在并不会导致自噬泡的形成和活化。哺乳动物绝大多数Atg5-Atg12-Atg16L复合物存在于胞浆中，在autophagy自噬泡膜的延伸过程中，一部分Atg5-Atg12-Atg16L复合物定位于膜表面，自噬体的双层膜结构形成后，此复合物便从膜上解离下来。因此，Atg5-Atg12-Atg16L复合物的存在是autophagy过程中膜的延伸所
18、必需的。同样，哺乳动物中酵母Atg8的同源物LC3也要首先经历泛素样翻译后修饰过程，然后定位于autophagy自噬泡膜表面。哺乳动物LC3合成之后，在Atg4同源物的催化下，其C末端5个氨基酸残基被切割下来，暴露出C端的甘氨酸残基。这种经过加工的LC3称为LC3-I，定位于胞浆中。之后，LC3-I在哺乳动物E1泛素样酶Atg7和E2泛素样酶Atg3的催化下，与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺（PE）结合，称为LC3-II。电泳过程中，LC3-II的迁移速率要快于LC3-I。因此，在LC3的免疫印记中，通常出现两条带：LC3-I的表观分子量为18kD，LC3-II的表观分子量为16kD。LC3-II
19、的含量或LC3-II/LC3-I的比例与自噬泡的数量呈正相关 21。LC3-II的形成依赖于Atg12-Atg5复合物：在Atg5-/-的胚胎干细胞或表达结合缺陷型Atg5基因（Atg5K130R）突变株的胚胎干细胞中，LC3-II是检测不到的 14。2. 型磷脂酰肌醇3磷酸激酶 （Class PI3K）自噬体的形成也依赖于型磷脂酰肌醇三磷酸激酶(Class PI3K)的作用。Class PI3K可磷酸化磷脂酰肌醇（PtdIns），生成3-磷酸磷脂酰肌醇(PtdIns3P)。PtdIns3P募集胞浆中含FYVE或PX基序的蛋白质，用于自噬体膜的形成。Class PI3K 还可与Beclin 1
20、形成复合物参与自噬体的形成22 （图四）。PI3K抑制剂（3MA, Wortmannin）可干扰或阻断自噬体形成。 3.其它 Sec基因（Sec12、Sec16、Sec23/24）在Saccharomyces cerevisiae中参与了自噬体膜的形成。另外，中间丝、微管等细胞骨架成分也参与了自噬体形成晚期步骤的完成。表一：哺乳动物细胞三种主要形式autophagy 的比较特点 大自噬 小自噬 分子伴侣介导的自噬活化方式 压力与应激 组成性 压力与应激物种 哺乳动物 是 是 是非哺乳动物 是 是 ？机制内吞 是 是 否膜来源 非溶酶体 溶酶体 /受体介导 否 否 是参与成分ATP 是 是 是G
21、TP和GTPases 是 是 否细胞骨架 是 否 ？分子伴侣 ？ ？ 是囊泡酸性pH 是 是 否膜电位 ？ 是 是PI3激酶 是 ？ 否底物细胞器 各种类型 各种类型 无可溶性胞浆蛋白 各种类型 各种类型 KFERQ-标签靶信号 泛素样？葡萄糖去除？ ？ KFERQ样模体蛋白去折叠 否 否 是选择性 某些形式 某些形式 总是表二：哺乳动物自噬相关基因Gene Designation Yeast Human Mouse CommentATG1 ULK1 Unc-51-like kinase interacts with GATE-16 and GABARAPATG3 hATG3/hAPG3 mA
22、TG3/mAPG3 an E2-like enzyme for LC3,GABARAP, and GATE-16ATG4 hATG4A/HsATG4A/ Cysteine protease for GATE-16HsAPG4A/autophagin-2hATG4B/HsATG4B/ Cysteine protease for LC3, GABARAP, hAPG4B/autophagin-1 and GATE-16; Delipidating enzyme for LC3- and GABARAPhAtg4C/HsAUTL1/ Cysteine proteaseautophagin-3hATG
23、4D/autophagin-4ATG5 hATG5/hAPG5 target protein of Atg12ATG6 beclin 1 beclin 1 related to tumorigenesisATG7 hATG7/HsGSA7/ mATG7/mAPG7 an E1-like enzyme for Atg12 and Atg8hAPG7 homologues ATG8 LC3 modifier for autophagosomes GABARAP modifier GATE-16 modifier ATG8L/APG8L unknownATG10 mATG10/mAPG10 an E
24、2-like enzyme for Atg12ATG12 hATG12/hAPG12 mATG12/mAPG12 modifier for autophagosomeATG16 ATG16L/APG16L interacts with Atg5三、自噬过程的信号调控参与自噬过程的信号转导分子非常复杂，目前尚未完全被我们所了解。1. mTOR（Mammalian Target of Rapamycin）信号途径TOR激酶是氨基酸、ATP和激素的感受器，对细胞生长具有重要调节作用，抑制自噬的发生，是自噬的负调控分子，并发挥 “门卫（gatekeeper）”作用。哺乳动物细胞中的核糖体蛋白质S6(p
25、70S6)抑制自噬的发生，它位于TOR信号途径下游，其活性受mTOR调节 23。纳巴霉素（Rapamycin）通过抑制mTOR的活性，发挥抑制p70S6活性、诱导自噬发生的作用。TOR激酶抑制自噬的信号通路目前尚未完全明了。在酵母细胞，TOR激酶可能通过抑制ATG1激酶的活性来抑制自噬的发生24。2.ClassPI3K/PKB途径ClassPI3K是自噬的负调节分子，它可磷酸化PtdIns4P和PtdIns（4，5）P2，生成PtdIns（3，4）P2和PtdIns（3，4，5）P3，然后结合Akt/PKB和它的活化分子PDK1, 抑制自噬的发生。结节性硬化复合物1（TSC1）和TSC2蛋白位
26、于ClassPI3K/PKB途径的下游，可通过抑制小G蛋白Rheb，抑制TOR激酶的活性，对自噬发挥正向调节作用。 PTEN磷酸酶也是自噬的正向调节分子，它使PtdIns（3，4，5）P3去磷酸化，从而解除ClassPI3K/PKB途径对自噬的抑制。上述两条自噬过程的信号调控途径示意图见图五25,26。 3.Gai3蛋白和氨基酸GTP结合的G蛋白亚基Gai3是自噬的抑制因子，而GDP结合的Gai3蛋白则是自噬的活化因子。GAIP（G Alpha Interacting Protein）作为RGS (Regulators of G-protein Signaling)家族成员之一，通过Gai3蛋
27、白加速GTP的水解，促进自噬的发生。AGS3(Activator of G-protein Signaling 3)也能正向调控自噬效应。氨基酸作为自噬过程蛋白降解物的终产物，可负性反馈调节自噬。外源性氨基酸的去除，可以阻断TOR信号途径，而自噬产生的内源性氨基酸可补足氨基酸缺陷，恢复TOR信号转导。4.其他激素在自噬的调控中也起重要作用。胰岛素可抑制自噬，而胰高血糖素则促进自噬。酪氨酸激酶受体、PKA、casein激酶、MAP激酶、calcium 也存在于自噬过程错综复杂的调控网络中，但其机制还不甚清楚。四、Autophagy与细胞凋亡的关系尽管最初认为Autophagy 与凋亡两种程序性细
28、胞死亡方式在形态、生化指标、参与分子和机理方面均存在不同，近年来越来越多的研究提示二者在某些情况下可以相互拮抗或促进，可先后发生或同时共存于同一细胞，相同诱导因素在不同细胞中可分别诱发Autophagy或凋亡；参与Autophagy 和凋亡的分子也可能存在交叉，这些分子在Autophagy与凋亡两种程序性细胞死亡中可发挥正向或负向作用。随着研究的深入，Autophagy与凋亡之间的相互关系似乎变得越来越复杂了。最近有报道称Beclin 1可通过增强Caspase-9的活性加强化疗药物CDDP诱导的人胃癌细胞MKN28的凋亡，说明作为Autophagy重要调控基因的Beclin 1也可参与细胞凋
29、亡的调控 27。营养剥夺诱导的细胞Autophagy在Atg基因（Atg5, Atg6/Beclin 1, Atg10, Atg12）干扰RNA或Autophagy特异抑制剂剂（如3-MA）存在的情况下，细胞发生凋亡形式的程序性细胞死亡28。 广谱Caspase抑制剂zVAD 通过抑制Caspase-8活性，发挥诱导自噬性程序性细胞死亡的作用，并且这种程序性细胞死亡需要ATG7和Beclin 1基因的参与29。应用RNA干扰或同源重组技术将LAMP-2基因敲除，细胞在营养剥夺情况下，首先发生Autophagy，继而发生凋亡，同时伴随细胞凋亡的典型特点，如线粒体跨膜电位的丧失、Caspase的活
30、化和染色质的凝集30。另外的研究也证明LAMP-2基因缺陷的小鼠死亡率增加，幸存的小鼠出现多组织广泛的胞浆空泡31。凋亡刺激信号神经生长因子（NGF）去除或将胞嘧啶阿拉伯糖苷加入含NGF的交感神经的神经元，细胞在出现以DNA片断化为主的凋亡特点前，首先出现大量的自噬泡 32。最近，Pyo JO 等人的研究发现由IFN-或Atg5超表达诱导的Hela细胞死亡之前，首先发生以大量胞浆空泡出现为主的Autophagy的形态学特点。由IFN-诱导的胞浆空泡的出现和细胞死亡可被3-MA或Atg5K130R超表达所抑制，而广谱胱天蛋白酶抑制剂zVAD-fmk只能抑制细胞死亡，却不能抑制胞浆空泡的出现。这说
31、明以胞浆空泡出现为主的Autophagy可继发Caspase依赖的细胞死亡。进一步的研究证明Atg5通过和FADD (Fas-associated protein with death domain) 的相互作用发挥促进Autophagy性程序性细胞死亡的作用, 而FADD是细胞膜受体Fas/FasL途径凋亡的重要参与分子33。另外，Bcl-2家族蛋白不仅参与凋亡形式的程序性细胞死亡，还参与了对Autophagy形式细胞死亡的调控34,35。肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配基（TRAIL, TNF-related apoptosis inducing ligand）在人乳腺上皮细胞MCF-10A组
32、织形成过程中，诱导Autophagy形式的细胞死亡以形成中空的腔状结构，此过程同时伴随发生Caspase依赖的细胞凋亡事件36。五、Autophagy在病理生理过程中的作用自噬作用在生物体生长发育、细胞分化和对环境应激的应答方面极为关键，对防止某些疾病如肿瘤、肌病、神经退行性疾病以和对抵御病原微生物的感染和延缓衰老、延长寿命等方面发挥重要作用。最近的研究提示自噬也参与了天然免疫应答和适应性免疫应答。在讨论自噬与疾病的关系之前，我们首先需要明确的一个基本观点是：自噬对疾病的发生起促进作用还是抑制作用？当环境中的营养物质缺乏时，细胞通过自噬作用对胞内大分子物质进行降解，提供维持细胞存活所需的最低能
33、量37；某些毒素和病原体通过自噬途径被包裹、降解清除 38,39。变性的胞浆成分，如因错误折叠而形成的凝聚蛋白或受损的细胞器也可通过自噬得到清除，从而使细胞免于受到进一步损伤 7, 40。因此，在某些疾病的早期阶段，激活自噬起到了阻止疾病进展的作用。 然而，另有报道称自噬还可参与型程序性细胞死亡，即非凋亡形式的程序性细胞死亡。在自噬形式的程序性细胞死亡中，中间丝与微丝重新分布，但并不降解，激动蛋白仍然保持聚合状态，因此细胞骨架系统保持完好；与之相反，在凋亡形式的程序性细胞死亡中，很早就出现激动蛋白的解聚和中间丝的降解，细胞骨架系统遭到破坏 41。综合最近的研究结果提示，Autophagy对细胞
34、的作用具有两面性，可以说是一把双刃剑：既可以作为细胞生长的“朋友”，也可能成为“敌人”，这取决于疾病进展的不同阶段、细胞周围环境的变化和治疗干预措施的不同42-46。1.Autophagy与恶性肿瘤当细胞发生恶性转化时，内环境的稳态遭到破坏，其合成代谢速率明显大于分解代谢速率。随着肿瘤进展阶段的不同，Autophagy所扮演的角色发生了很大变化。在癌症发生早期，抑制Autophagy导致癌前细胞的持续生长，此时Autophagy发挥的是肿瘤抑制作用42,47。当肿瘤细胞持续分裂增值，癌症呈进展阶段时，癌细胞利用自噬机制对抗营养缺乏和缺氧，这在处于实体肿瘤内部血供不良的癌细胞中尤其明显，此时Au
35、tophagy发挥的是促进肿瘤细胞生长存活的作用 48。此外，Autophagy还可保护某些肿瘤细胞免受放疗损伤 49。据推测这种保护作用的机制可能是通过Autophagy清除受损的大分子或线粒体等细胞器，从而保护肿瘤细胞免于发生凋亡性程序性细胞死亡，维持恶性细胞的持续增殖50。Beclin 1 是酵母ATG6/Vps30基因在哺乳动物中的同源物，在自噬泡形成过程中起重要作用。在人乳腺癌、卵巢癌和前列腺癌中观察到高频率的Beclin 1单等位基因缺失。在人乳腺癌细胞系MCF-7中，Beclin 1蛋白表达下降，几乎检测不到。稳定转染Beclin 1促进了细胞的自噬活性，降低了其成瘤能力，这些均
36、提示自噬活性与抑制细胞增殖有关51。某些抗肿瘤治疗药物有可能通过Autophagy机制发挥作用，如被广泛用于乳腺癌治疗的药物它莫西芬可能通过激活细胞自噬，由神经酰胺介导上调Beclin 1表达发挥作用52。某些肿瘤细胞由于存在凋亡通路特异基因的突变，不能发生凋亡形式的程序性细胞死亡，却仍可通过Autophagy途径得到清除49。2.Autophagy与肌病关于肌病患者出现肌细胞胞浆空泡的报道很多，最近某些研究把其归因于自噬功能的改变53。LAMP-2缺陷小鼠出现多组织广泛的自噬性空泡，其中包括骨骼肌和心肌。心肌超微结构的异常使其收缩功能严重受损 31。 人LAMP-2 缺陷导致的Danon氏病
37、也与横纹肌自噬泡的聚集有关54。最近利用光镜和电镜的组织学研究方法证明Danon氏病和相关肌病的典型特征是胞浆中自噬溶酶体的大量聚集55。电生理方法对某些肌病的研究同样证明了广泛自噬现象的存在56。Pompe病又称型糖元储积病，是由于溶酶体酸性alpha-葡糖酐酶缺乏引起心肌和骨骼肌糖元积聚导致的常染色体隐性遗传病。利用重组或转基因酸性alpha-葡糖酐酶进行的治疗性实验中，二者均可有效清除心肌和型肌纤维中的糖元，但对型肌纤维无效，其中自噬活性的增加是型肌纤维对抗治疗的机理之一57。3.Autophagy与神经变性性疾病自噬在神经变性性疾病的发生发展中起双重作用，它既可加速疾病的进展，在某些条
38、件下又起保护作用 58。在阿尔茨海默氏病（Alzheimers）59、亨廷顿氏病（Huntingtons）60 和帕金森氏病（Parkinsons）61中，溶酶体系统的形态学特征发生了显著变化，调控自噬的信号转导系统也同时发生改变62。神经营养因子撤除的小脑葡氏神经元死于自噬性程序性细胞死亡 63。在神经变性性疾病中起重要作用的神经递质多巴胺也可引起自噬性程序性细胞死亡 64,65。最近，有报道称自噬在神经变性性疾病中还可起保护性作用。在神经变性性疾病的早期阶段，激活自噬加速变性蛋白的清除阻止了疾病的进一步发展。例如亨廷顿氏病中，通过自噬途径对突变蛋白小片段的降解就阻止了它们的进一步聚集66。
39、激活自噬可加速细胞内蛋白聚合物的清除，而这种蛋白聚合物的存在是神经变性性疾病的典型特点之一 67,68。神经变性性疾病受累神经元两个最主要的特征是：胞浆中蛋白聚集物的存在和大的蛋白裂解体系活性的改变。尽管不同神经变性性疾病突变蛋白的种类不同，但蛋白聚集物形成的过程却极为相似。首先，受损蛋白错误折叠、构象改变，暴露出那些在正常情况下隐藏于蛋白内部的疏水性残基；然后，细胞活化分子伴侣系统和胞浆蛋白酶体系，促进这些错误折叠蛋白的再折叠或清除。最初，分子伴侣和蛋白酶可以逆转或在一定程度上延缓蛋白聚集物的形成；然而，随着受损蛋白的不断增多，当上述机制不足以完全清除时，这些分子伴侣和蛋白酶则被蛋白聚集物捕
40、获，成为其中的一部分69。尽管蛋白聚集可能是细胞对抗疏水残基暴露的保护机制，这同时使聚集的蛋白更加不易被蛋白酶降解，因此自噬成为降解这些变性蛋白的唯一机制69。激活自噬加速新合成的蛋白聚集物清除已经得到实验证实40,70。然而，随着疾病的进展，蛋白聚集物越来越多，它们对溶酶体蛋白酶降解的敏感性下降，自噬的持续性激活导致细胞最终发生自噬性程序性细胞死亡。 4.Autophagy与病原体感染细胞自噬机制的激活在清除病原体感染中也起重要作用。在对C. neoformans感染的小鼠巨噬细胞转录特点的研究中发现，与自噬相关的基因被诱导表达71。巨噬细胞利用Autophagy机制对抗Legionella
41、 pneumophila感染72。巨噬细胞以胆固醇依赖方式激活自噬，清除胞内病原菌L. pneumophila的感染73。Autophagy在植物免疫反应中的作用也有报道74,75。激活自噬不一定对病原体感染的细胞均起保护作用。例如激活Coxiella感染的中国仓鼠卵巢细胞的自噬机制，会为细菌最初的存活和扩增提供有利条件76。脊髓灰质炎病毒和鼻病毒利用自噬机制促进病毒的复制和扩增，据推测其机制可能是自噬为病毒RNA复合物提供了膜性结构的包裹，帮助病毒颗粒以非裂解方式从受感染的细胞中释放出来77。宿主自噬机制在沙眼衣原体（Chlamydia trachomatis）感染所致的沙眼、肺炎和动脉硬化
42、等疾病的发病机制中起重要作用78。冠状病毒复制依赖细胞自噬过程中双层膜囊泡的形成，并不被3-MA所阻断79；Autophagy基因Atg5敲除的胚胎干细胞中，冠状病毒复制缺陷79。5.Autophagy与衰老自噬的激活在延缓由衰老造成的线粒体DNA体细胞突变的累积方面发挥关键性作用80。心肌细胞、骨骼肌纤维和其他长寿命的有丝分裂后细胞表现出明显的年龄相关的线粒体和溶酶体改变，自噬泡降解变性线粒体的能力下降81。线粒体-溶酶体轴理论在衰老中的作用已经得到实验验证82。Keller JN等人的综述详细探讨了Autophagy与脑衰老的关系83；最近又有研究指出：周期性终生服用抗脂解药物抑制胰岛素的
43、分泌与轻度节食共同发挥抗衰老作用，推测其机理可能为短暂的血浆低胰岛素水平刺激了机体的抗衰老细胞修复机制，这种机制就是细胞的自噬84。细胞自噬活性随年龄增加而下降，这种下降可能与年龄相关的消化吸收后氨基酸水平的增加和/或基础水平胰岛素受体信号传导途径的增加有关85。与之相反，自噬溶酶体在衰老淋巴细胞中的聚集可加速细胞的病理变化，导致活化诱导的淋巴细胞凋亡或坏死86。 六、Autophagy的监测与研究方法1形态学方法1.1. 电子显微镜迄今为止，电子显微镜是研究autophagy的唯一可信赖方法，细胞的自噬现象最初也是通过电子显微镜发现的 87。在电子显微镜下，自噬体（Autophagosome
44、）由包裹未吞噬降解的胞浆物质、细胞器的双层膜结构组成；而自噬溶酶体（Autolysosome）由单层膜结构组成，其中包裹着处于不同降解阶段的胞浆成分。由于有时很难严格区分自噬体和自噬溶酶体，二者经常统称为“自噬泡” 。通过电镜可对细胞的自噬活性进行定量。自噬泡占胞浆总面积或体积的比例是目前通过电镜对细胞自噬活性进行定量的唯一方法。尽管最近计算机软件的进展允许我们进行快速定量，在应用这种形态学的评价方法时，我们仍需对采集于不同细胞的大量照片进行综合观察和考虑。在对酵母细胞自噬的研究中，利用囊泡蛋白酶缺陷细胞系或用蛋白酶抑制剂PMSF处理抑制自噬体的降解，仅通过光学显微镜就可观察到囊泡中未降解的自噬体88。由于哺乳动物的溶酶体很小，应用光学显微镜观察自噬泡的方法是不行的。1.2. Monodansylcadaverine (MDC) 染色Monodansylcadaverine (MDC) 是一种荧光染料，被用作自噬泡的示踪剂